Name: an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy
Uploaded: 2019-01-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy at JoVE.com

Los autores están muy agradecidos a los colegas de retina médica y quirúrgica, enfermeras y todo personal de la unidad de diabéticos y la unidad de cirugía del Vitreoretinal en el Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario de Helsinki para participar activamente en el reclutamiento de los pacientes. Agradecemos a Biomedicum unidad de imagen Molecular para las instalaciones de proyección de imagen. Agradecemos a Anastasiya Chernenko excelente asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por becas de la Academia de Finlandia (KL), Universidad de Helsinki (KL), Sigrid Juselius Fundación (KL), K. Albin Johansson Fundación (KL), Instituto Finlandés del cáncer (KL), Karolinska Institutet (KL), Fundación de ojo finlandés (SL), ojo y Fundación de banco de tejidos (SL), María y Georg C. Ehrnrooth Fundación (SL) y becas de investigación clínica en HUCH (TYH2018127 después de TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG), así como el programa de doctorado en biomedicina (EG).

Esta investigación fue aprobada por la Junta de revisión institucional y Comité de ética del Hospital Universitario de Helsinki. Firmado el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente.
1. preparación de soluciones, medios y equipos
<ol><li>Preparar el siguiente equipo antes de la obtención del tejido fibrovascular (FT) para asegurar un procesamiento rápido.<ol>
<li>Pinzas de microdisección estéril-autoclave dos.</li>
		<li>Preparar 1 x solución salina tamponada con fosfato ...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+Review:+Changes+in+the+Incidence+of+and+Progression+to+Proliferative+and+Sight-Threatening+Diabetic+Retinopathy+Over+the+Last+30+Years.">Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indications+of+lymphatic+endothelial+differentiation+and+endothelial+progenitor+cell+activation+in+the+pathology+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).</li><li>Stitt, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+in+understanding+and+treatment+of+diabetic+retinopathy.">The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).</li><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+current+understanding,+mechanisms,+and+treatment+strategies.">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), (2017).</li><li>Gross, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-Year+Outcomes+of+Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).</li><li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy:+from+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals.">Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).</li><li>Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+retinopathies:+animal+models+and+therapeutic+opportunities.">Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities.</a> Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).</li><li>Sharma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+treatment+for+diabetic+vitreoretinal+diseases:+a+review.">Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review.</a> Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).</li><li>Gucciardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+of+proliferative+diabetic+retinopathy+supports+lymphatic+neovascularization.">The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization.</a> The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+endothelial+cell+spheroid/human+vitreous+humor+assay+for+the+characterization+of+anti-angiogenic+inhibitors+for+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).</li><li>Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+a+paradigm+for+balanced+extracellular+proteolysis+during+cell+migration+and+morphogenesis.">Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis.</a> Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).</li><li>Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+tubulogenesis+within+fibrin+gels+specifically+requires+the+activity+of+membrane-type-matrix+metalloproteinases+(MT-MMPs).">Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs).</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomics+Analysis+of+Vitreous+Humor+from+Diabetic+Retinopathy+Patients.">Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients.</a> Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).</li><li>Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+factor/c-kit+signaling+pathway+components+in+diabetic+fibrovascular+epiretinal+membranes.">Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes.</a> Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ang-2+upregulation+correlates+with+increased+levels+of+MMP-9,+VEGF,+EPO+and+TGFbeta1+in+diabetic+eyes+undergoing+vitrectomy.">Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).</li><li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2+cleavage+by+MT1-MMP+triggers+single+cancer+cell+invasion+via+homotypic+cell+repulsion.">EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion.</a> Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).</li><li>Tatti, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP16+Mediates+a+Proteolytic+Switch+to+Promote+Cell-Cell+Adhesion,+Collagen+Alignment,+and+Lymphatic+Invasion+in+Melanoma.">MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma.</a> Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+framework+for+angiogenesis:+a+complex+web+of+interactions+between+extravasated+plasma+proteins+and+endothelial+cell+proteins+induced+by+angiogenic+cytokines.">Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines.</a> American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).</li><li>Senger, D. R., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).</li><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li><li>Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+modeling+macular+degeneration+in+mice.">The challenge of modeling macular degeneration in mice.</a> Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).</li><li>Kim, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cells+from+patient-derived+fibrovascular+membranes+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy.</a> Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).</li><li>Avery, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+bevacizumab+(Avastin)+in+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).</li><li>Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+outcomes+of+vitrectomy+with+or+without+intravitreal+bevacizumab+pretreatment+for+severe+diabetic+retinopathy.">A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).</li><li>Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safe+and+efficient+method+to+retrieve+mesenchymal+stem+cells+from+three-dimensional+fibrin+gels.">A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).</li></ol>

Considerando la importancia del microambiente del tejido relevante para celular funcional confiable y resultados mecanismos moleculares, es imperativo encontrar modelos experimentales apropiados que proporcionan el ambiente de este tejido. El PDR aquí descrito ex vivo cultura modelo de la FTs de fibrina incrustado permite la investigación de los mecanismos de la patofisiología PDR en el contexto nativo, complejo y pluricelular de las muestras clínicas del PDR.
Pasos críticos en e...

DR es una grave complicación ocular de la diabetes, una enfermedad que ha alcanzado proporciones enormes en los últimos tres décadas1. Veinte años después de diagnosis, prácticamente todos los pacientes con diabetes tipo 1 y el 60% de los pacientes con tipo 2 diabetes presente las muestras de la retinopatía, que diabetes por sí uno de los principales causas de ceguera en adultos de edad2de trabajo. Según el nivel de degeneración microvascular y daño isquémico, DR se clasifica en RD no proliferativa (no democrática) y Rd proliferativa (RDP). La enfermedad, PDR, se caracteriza por la neovascularización inducida por la isquemia y la inflamación y respuesta fibrótica en la interfase vítreo-retina. En condiciones no tratadas, estos procesos conducirá a la ceguera debido a hemorragia vítrea, fibrosis retiniana, la separación retiniana del tractional y neovascular glaucoma3,4. A pesar de los avances recientes, las opciones actuales de tratamiento objetivo sólo DR etapas, incluso el edema macular diabético y PDR, daño retiniano ha ya se produjo. Por otra parte, una gran proporción de pacientes del Dr. no se beneficia del actual arsenal terapéutico de tratamiento, lo que indica una necesidad urgente de mejores terapias4,5,6.
Otros yovivo n modelos de enfermedad, del desarrollo y múltiples modelos animales diabéticos se han desarrollado hasta la fecha, pero ninguno de ellos recoge toda la gama de características patológicas observadas en humanos PDR7,8. Además, la creciente evidencia indica que las respuestas al tratamiento están conectadas firmemente a la composición del ECM, así como el arreglo espacial y la interacción entre el microambiente celular y acelular9. Nosotros, por lo tanto, para desarrollar un modelo clínico relevante de PDR humana utilizando el material patológico de FT que es suprimido comúnmente de ojos sometidos a vitrectomía como parte de la gerencia quirúrgica del PDR10.
Este manuscrito describe el protocolo para el 3D ex vivo cultura y caracterización de la quirúrgico-suprimido, PDR pies patológicos derivados del paciente. El método aquí descrito se ha utilizado en una publicación reciente que demostró éxito deconstrucción del nativo paisaje de tejido 3D de PDR y recapitulación de las características de la patofisiología PDR angiogénicos como respuesta fibrótica de la anormal estructuras vasculares11. Este modelo también reveló características novedosas que no pueden ser fácilmente apreciadas desde finas secciones histológicas, tales como espacialmente limitan apoptosis y proliferación, así como formación de islotes vasculares11. Líquido vítreo se ha utilizado con éxito por otras culturas esferoide endotelial 3D para evaluar su potencial angiogénico y la eficacia de angiostatic moléculas12. Cuando se combina con un esferoide de células endoteliales linfáticas 3D (LEC) en vitro brotación ensayo utilizando vítreo PDR como estimulante, nuestro modelo reveló que la contribución de ambos vitreal soluble factores claves así como locales en el tejido neovascular de la todavía mal entendida implicación de LEC en PDR Fisiopatología3,11. En la gestión de PDR, cirugía vitreorretiniana es un procedimiento rutinario realizado pero desafiante. Como instrumentación quirúrgica y técnicas están viendo continuo adelanto y sofisticación, eliminación oportuna y conservador de muestra proliferativo fibrovascular no sólo mejora el resultado de la visión sino que también proporciona material de tejido muy valiosa para la investigación de respuestas de la patofisiología y el tratamiento de la PDR en los aspectos complejos de la traslación del microambiente del tejido humano vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td>Used for handling the FTs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels - Sterile</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0513</td>
			<td>Used for FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish, vented, 28 ml (60mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3210</td>
			<td>Used for dissection and for testing fibrin gel formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0049</td>
			<td>Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>525-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB74031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td>Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 96-well, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0019</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-528</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x22mm #1</td>
			<td>Menzel/Fisher</td>
			<td>15727582</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Kindler K102</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-0202</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>Used for preparing 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>341578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394-500ML</td>
			<td>Used for preparing the fibrinogen and TA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Used for preparing the blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Aliquoted in -20 &#176;C, thaw before preparing the ex vivo culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate 10mg/ml</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell media MV Kit</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22120</td>
			<td>Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,&#160; 500 &#956;L of recombinant human epidermal growth factor (10 &#956;g/ mL) and 500 &#956;L of hydrocortisone (1 g/ mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201-2.5L-M</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, 20mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62249</td>
			<td>For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989-100ml</td>
			<td>TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549-500UN&#160;</td>
			<td>Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3428</td>
			<td>Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>752-VC-025</td>
			<td>200 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF346</td>
			<td>1 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>01-106</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (JC70A)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0823</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 (QBEND10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M716501-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 (2B11+PD7/26)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M070129-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>ImmunoWay</td>
			<td>RLM3161</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase-3 (5A1E)</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9664</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG (EP111)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M731429-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NCL-Ki67p</td>
			<td>Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyve1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2089</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>ReliaTech</td>
			<td>102-PA32</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2727</td>
			<td>Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR3 (9D9F9)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3757</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-SMA (1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9 upright dissection stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy

Retinopatía diabética (RD) es la complicación microvascular más frecuente de la diabetes y una de las principales causas de ceguera en adultos en edad de trabajar. No actuales modelos animales de diabetes y la retinopatía inducida por el oxígeno convierten los cambios progresivos de gama completa que se manifiesta en humana retinopatía diabética proliferativa (PDR). Por lo tanto, comprensión de la patogénesis de la enfermedad y la patofisiología ha dependido en gran medida el uso de secciones histológicas y muestras de vítreas en planteamientos que sólo proporcionan información de estado de equilibrio en los factores patogénicos implicados. Creciente evidencia indica que célula dinámica e interacciones de la matriz extracelular de la célula (MEC) en el contexto de microambientes (3D) tridimensionales son esenciales para los estudios mecanicistas y funcionales para el desarrollo de nuevos estrategias de tratamiento. Por lo tanto, la hipótesis de que el tejido fibrovascular patológico suprimido quirúrgico de ojos con RDP podría utilizarse confiablemente desentrañar los mecanismos celulares y moleculares de esta enfermedad devastadora y poner a prueba el potencial clínico de la novela intervenciones. Hacia este fin, hemos desarrollado un novedoso método para 3D ex vivo cultura de suprimido quirúrgico derivados del paciente tejido fibrovascular (FT), que servirá como un modelo relevante de Fisiopatología humana de PDR. La FTs se diseca en explantes y embebida en matriz de fibrina para ex vivo cultura y 3D caracterización. Conjunto Monte inmunofluorescencia de la FTs nativos y culturas punto final permite investigación exhaustiva de la composición tisular y procesos multicelulares, destacando la importancia de la caracterización de nivel tejido 3D para descubrir características relevantes de Fisiopatología de la PDR. Este modelo permite la evaluación simultánea de los mecanismos moleculares, celulares y tejidos procesos y las respuestas al tratamiento en el contexto complejo de interacciones bioquímicas y físicas dinámicas dentro de la arquitectura del tejido PDR y el microambiente. Este modelo recoge Fisiopatología PDR, también será favorable para pruebas o desarrollo de nuevos tratamientos.

Comprensión más profunda de las propiedades del tejido fibrovascular de PDR y expresión de la proteína se ha basado principalmente en muestras de vítreas y finas histológicas FT secciones3,15,16,17. Para desarrollar un método para la investigación exhaustiva de la organización de tejido 3D y pluricelulares procesos fisiopatológicos de la RDP, nos propu...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Aquí, presentamos un protocolo de estudio de la fisiopatología de la retinopatía diabética proliferativa mediante el uso de los tejidos derivados del paciente quirúrgico suprimido, fibrovasculares de tejido nativo tridimensional caracterización y ex vivo la cultura. Esta ex modelo de cultura vivo también es favorable para probar o desarrollar nuevos tratamientos.

Un modelo de cultivo de tejidos Ex Vivo para las complicaciones Fibrovascular en la retinopatía diabética proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

La retinopatía diabética es la complicación microvascular más común de la diabetes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la fisiopatología de la retinopatía diabética proliferativa de la enfermedad terminal. Esta técnica permite la deconstrucción del paisaje de tejido tridimensional nativo y la investigación de la fisiopatología tisular en material vivo del paciente con relevancia clínica directa. Consulte el protocolo de texto para obtener detalles sobre la cirugía y la instrumentación utilizada en la disección. Para empezar, coloque el tejido fibrovascular que ha sido extirpado de sujetos humanos sometidos a cirugía vitreorretiniana de microincisión transconjuntival en un plato de cultivo celular que contenga PBS estéril. Usando un microscopio estéreo de disección vertical, corte el tejido fibrovascular en aproximadamente un milímetro cuadrado. Sumerja el tejido en PBS y mantenga el tejido en su lugar con pinzas de micro disección. Haz cortes claros en el tejido con un bisturí estéril teniendo cuidado de evitar rasgar el tejido fibrovascular. Coloque cada pieza individual de tejido en un pozo de una placa de cultivo celular de 12 pozos que contenga un mililitro de PBS estéril. En primer lugar, preparar 25 microlitros alícuotas de solución de fibrinógeno a temperatura ambiente. Coloque una pieza de tejido fibrovascular en el centro del pozo de una placa de 24 pozos y retire cualquier exceso de PBS. A continuación, añada 25 microlitros de solución ta a una de las alícuotas de fibrinógeno preparadas. Y usando otra pipeta ajustada a 50 microlitros se mezclan por pipeteo. Dispensar la mezcla sobre la pieza de tejido fibrovascular y pipeta hacia arriba y hacia abajo para asegurar que la pieza de tejido está contenida dentro de la gota. El tiempo de formación de fibrinógeno crítico para la tridimensionalidad del cultivo ex vivo, se prueba en una gota vacía de incrustación de tejido anterior como se describe en el protocolo. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular. Después de 30 a 60 minutos inclinar la placa para comprobar que el gel de fibrina está completamente formado. A continuación, superponer los geles de fibrina de tejido fibrovascular con medio de cultivo ex vivo complementado con aprotinina. Después de esto, devuelva las placas de cultivo a la incubadora de cultivo celular para el período de tiempo deseado. En primer lugar, reemplace el medio de cultivo ex vivo con un mililitro de solución de paraformaldehído por pozo para fijar los cultivos. Después de una hora, enjuague los geles con tres lavados PBS de cinco minutos. A continuación, reemplace el lavado PBS por dos mililitros de solución de azida sódica por pozo. Almacene los geles fijos a cuatro grados Celsius.Use una espátula de borde cuadrado de acero inoxidable para levantar las gotas de la placa con cuidado, comenzando en los bordes antes de levantar el centro de la gota. Usando una espátula de borde redondo transfiera las gotas a pozos individuales de una placa de 12 pozos que contiene un mililitro de PBS. Después de esto, incline la placa sobre un soporte y coloque las gotas con un mililitro de solución de metanol de acetona helada durante un minuto. Luego, enjuague con tres a cinco lavados de dos mililitros de PBS. Centrifugar la solución de bloqueo durante 15 minutos para eliminar los residuos. A continuación, incline la placa sobre un soporte e incubar las gotas en 500 microlitros de solución de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. Preparar la mezcla de anticuerpos primarios de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, utilice una espátula de borde redondo para transferir las gotas a una placa redonda inferior de 96 pozos. Incubar las gotas en 30 microlitros de mezcla de anticuerpos primarios por gota durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera las gotas a una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros de solución de lavado por pozo. Enjuague las gotas con tres lavados de cinco minutos. Luego, lave las gotas con nueve lavados de 30 minutos. Al día siguiente, enjuague las gotas tres veces con PBS. Preparar la mezcla de anticuerpos secundarios conjugada con fluoróforo adecuada de acuerdo con el protocolo de texto. Transfiera las gotas a una placa redonda inferior de 96 pozos, como se ha demostrado anteriormente, e incubar la placa con 30 microlitros de mezcla de anticuerpos secundarios durante cuatro horas a temperatura ambiente, protegidos de la luz.Después de cuatro horas, transfiera las gotas a una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros de solución de lavado por pozo. Primero, enjuague las gotas con tres lavados de cinco minutos. A continuación, lave las gotas con cuatro lavados de 30 minutos. Al día siguiente, enjuague las gotas cinco veces con solución de lavado durante 30 minutos, y tres veces con PBS durante 30 minutos. Al día siguiente, transfiera las gotas a una placa redonda inferior de 96 pozos, como se ha demostrado anteriormente. Contraataque las gotas con mancha nuclear Hoechst durante 30 minutos a temperatura ambiente. Transfiera las gotas a una placa de 12 pozos que contenga dos mililitros de PBS por pozo y enjuague tres veces con PBS. A continuación, aplique una capa estrecha de medio de montaje de endurecimiento rápido a lo largo de los bordes de un vidrio de cubierta cuadrada y deje que se seque durante un minuto. A continuación, enjuague la gota sumergiéndola en un pozo de un recipiente de 12 pozos que contenga agua desionizada. Y transfiera la gota a una diapositiva del microscopio. A continuación, dispensar 15 microlitros de medio de montaje anti-fade no endurecido en la gota. Coloque suavemente el cristal de la cubierta sobre la gota con el medio de montaje mirando hacia el portaobjetos y déjelo asentar. Deje que los portaobjetos se sequen durante dos horas a temperatura ambiente y guárdelos a cuatro grados centígrados durante la noche. Por último, imagine las diapositivas con un microscopio de epifluorescencia vertical equipado con una función de seccionamiento óptico con objetivo de 20x o 40x. En este protocolo se preparó e probó el tejido fibrovascular. Los datos representativos mostraron que las culturas de PDR ex vivo inducen la brotación del endotelio positivo CD-31 y la preservación de la vasculatura en respuesta a VEGFA. Por el contrario, TGF

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Cultura de tejido del paciente y examen de la entrega de genes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Investigación

Medicina

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

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Ex infección in vivo del tejido vivo con virus oncolíticos

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

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Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

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Humano Dupuytren<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para el Estudio de miofibroblastos y matriz extracelular Interacciones

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

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Evaluación de la coagulación con Plasma en tejido del hígado en un modelo Animal grande en Vivo

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

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Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

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Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

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Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Modelo preclínico de isquemia de extremidades traseras en conejos diabéticos

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...