Name: an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy
Uploaded: 2019-01-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy at JoVE.com

Författarna är mycket tacksamma till medicinsk och kirurgisk retina kollegor, sjuksköterskor och hela personalen för Vitreoretinal kirurgi enheten på den Department of Ophthalmology, Helsingfors universitetssjukhus för att aktivt delta i rekryteringen och diabetiker enhet av patienterna. Vi tackar Biomedicum molekylär Imaging Unit för imaging faciliteter. Vi tackar Anastasiya Chernenko för utmärkt tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av bidrag från Akademin i Finland (KL), Helsingfors universitet (KL), Sigrid Juselius stiftelse (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finska Cancer Institute (KL), Karolinska Institutet (KL), finska Eye Foundation (SL), ögat och Tissue Bank Foundation (SL), Maria och Georg C. Ehrnrooths stiftelse (SL) och HUCH kliniska forskningsanslag (TYH2018127 efter TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) samt doktorandprogrammet i biomedicin (EG).

Denna forskning godkändes av institutionella Review Board och etiska kommittén Helsingfors universitetssjukhus. Signerad informerat samtycke erhölls från varje patient.
1. beredning av lösningar, Media och utrustning
<ol><li>Förbered följande utrustning före samlingen av fibrovaskulär vävnad (FT) att säkerställa snabb behandling.<ol>
<li>Steril-autoklav två lokalt pincett.</li>
		<li>Bered 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom upplösning 1 Pre vägde PBS tablett (0,14 M Na...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+Review:+Changes+in+the+Incidence+of+and+Progression+to+Proliferative+and+Sight-Threatening+Diabetic+Retinopathy+Over+the+Last+30+Years.">Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indications+of+lymphatic+endothelial+differentiation+and+endothelial+progenitor+cell+activation+in+the+pathology+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).</li><li>Stitt, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+in+understanding+and+treatment+of+diabetic+retinopathy.">The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).</li><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+current+understanding,+mechanisms,+and+treatment+strategies.">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), (2017).</li><li>Gross, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-Year+Outcomes+of+Panretinal+Photocoagulation+vs+Intravitreous+Ranibizumab+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).</li><li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy:+from+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals.">Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).</li><li>Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+retinopathies:+animal+models+and+therapeutic+opportunities.">Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities.</a> Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).</li><li>Sharma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+treatment+for+diabetic+vitreoretinal+diseases:+a+review.">Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review.</a> Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).</li><li>Gucciardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+of+proliferative+diabetic+retinopathy+supports+lymphatic+neovascularization.">The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization.</a> The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+endothelial+cell+spheroid/human+vitreous+humor+assay+for+the+characterization+of+anti-angiogenic+inhibitors+for+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).</li><li>Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+a+paradigm+for+balanced+extracellular+proteolysis+during+cell+migration+and+morphogenesis.">Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis.</a> Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).</li><li>Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+tubulogenesis+within+fibrin+gels+specifically+requires+the+activity+of+membrane-type-matrix+metalloproteinases+(MT-MMPs).">Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs).</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomics+Analysis+of+Vitreous+Humor+from+Diabetic+Retinopathy+Patients.">Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients.</a> Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).</li><li>Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+factor/c-kit+signaling+pathway+components+in+diabetic+fibrovascular+epiretinal+membranes.">Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes.</a> Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).</li><li>Loukovaara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ang-2+upregulation+correlates+with+increased+levels+of+MMP-9,+VEGF,+EPO+and+TGFbeta1+in+diabetic+eyes+undergoing+vitrectomy.">Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy.</a> Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).</li><li>Sugiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2+cleavage+by+MT1-MMP+triggers+single+cancer+cell+invasion+via+homotypic+cell+repulsion.">EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion.</a> Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).</li><li>Tatti, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP16+Mediates+a+Proteolytic+Switch+to+Promote+Cell-Cell+Adhesion,+Collagen+Alignment,+and+Lymphatic+Invasion+in+Melanoma.">MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma.</a> Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).</li><li>Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+framework+for+angiogenesis:+a+complex+web+of+interactions+between+extravasated+plasma+proteins+and+endothelial+cell+proteins+induced+by+angiogenic+cytokines.">Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines.</a> American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).</li><li>Senger, D. R., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).</li><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li><li>Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+modeling+macular+degeneration+in+mice.">The challenge of modeling macular degeneration in mice.</a> Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).</li><li>Kim, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cells+from+patient-derived+fibrovascular+membranes+in+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy.</a> Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).</li><li>Avery, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+bevacizumab+(Avastin)+in+the+treatment+of+proliferative+diabetic+retinopathy.">Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy.</a> Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).</li><li>Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+outcomes+of+vitrectomy+with+or+without+intravitreal+bevacizumab+pretreatment+for+severe+diabetic+retinopathy.">A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy.</a> The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).</li><li>Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+safe+and+efficient+method+to+retrieve+mesenchymal+stem+cells+from+three-dimensional+fibrin+gels.">A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).</li></ol>

Som beaktar betydelsen av relevanta vävnad närmiljön för tillförlitlig funktionella cell och molekylär mekanistiska resultat är det absolut nödvändigt att hitta lämpliga experimentella modeller som ger denna vävnad miljö. Häri beskrivna ex vivo PDR kultur modellen för de fibrin-embedded FTs tillåter undersökningen av PDR patofysiologi mekanismer inom ramen för infödda, komplexa och flercelliga PDR kliniska prover.
Kritiska steg inom protokollet är korrekt fibrin gel...

DR är en allvarlig okulär komplikation av diabetes, en sjukdom som har nått enorma proportioner i de senaste tre decennierna1. Tjugo år efter diagnos, praktiskt taget varje patient med typ 1-diabetes och 60% av patienter med typ 2-diabetes finns tecken på retinopati, att göra diabetes i sig. en av ledande orsakerna till blindhet i arbetar age vuxna2. Enligt nivån för mikrovaskulära degeneration och ischemisk skada indelas DR i icke-proliferativ DR (icke-PDR) och proliferativ DR (PDR). Slutstadiet sjukdomen, PDR, kännetecknas av ischemi - och inflammation-inducerad kärlnybildning och fibrotiska svar på vitreoretinala gränssnittet. I obehandlad villkor leder dessa processer till blindhet på grund av glaskroppshemorragi, retinal fibros, tractional näthinneavlossning och neovaskulära glaukom3,4. Trots senaste framsteg rikta nuvarande behandlingsalternativ endast DR stadier, inklusive Diabetiskt makulaödem och PDR, när skada på näthinnan har redan följde. Dessutom gynnar inte en stor del av DR patienter från nuvarande behandling Arsenal, som anger ett brådskande behov av förbättrade terapier4,5,6.
Flera andra jagn vivo sjukdom/utvecklingstoxicitet modeller och diabetiker djurmodeller har utvecklats hittills, men ingen av dem recapitulates hela skalan av patologiska funktioner hos mänskliga PDR7,8. Dessutom indikerar ökande bevis att behandlingssvar är tätt anslutna till ECM sammansättning och den rumsliga ordningen samt samspelet mellan den cellulära och acellulära mikromiljö9. Vi, därför anges för att utveckla en kliniskt relevant modell av mänskliga PDR genom att utnyttja det FT patologiska material som vanligen Bolts från ögon som genomgår vitrektomi som en del av den kirurgiska förvaltningen av PDR10.
Detta manuskript beskriver protokollet för 3D ex vivo kultur och karakterisering av de kirurgiskt-censurerade, PDR patientderiverade patologiska FT. Den metod som beskrivs här har använts i en ny publikation som visat framgångsrika dekonstruktion av infödda 3D PDR vävnad landskapet och rekapitulation av funktioner av PDR patofysiologi inklusive angiogena och fibrotiska reaktioner av det onormala vaskulära strukturer11. Denna modell har också avslöjat nya funktioner som inte kan enkelt uppskattas från histologiska tunnslip, såsom rumsligt begränsade apoptos och spridning samt vaskulär holme bildandet11. Glaskroppen vätska har använts framgångsrikt av andra på 3D endothelial sfäroid kulturer att utvärdera dess potentiella angiogena och effekten av angiostatiska molekyler12. Kombination med en in vitro- 3D lymfatiska endotelceller (LEC) sfäroid groning assay använder PDR glaskroppen som stimulerande, avslöjade vår modell bidrag både lösliga vitreal faktorer och lokala referenser inom neovaskulär vävnad till den som ännu dåligt förstådd LEC medverkan i PDR patofysiologi3,11. I förvaltningen av PDR är vitreoretinal kirurgi ett rutinmässigt utförda men utmanande förfarande. Som kirurgiska Instrumentation och tekniker ser fortlöpande befordran och förfining, lägligt och konservativa borttagning av fibrovaskulär proliferation exemplar förbättrar inte bara vision resultatet men ger också ovärderlig vävnadsmaterial för den utredning av PDR patofysiologi och behandling svaren i de komplexa translationella aspekterna av den levande mänsklig vävnad mikromiljö.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforceps</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>07.60.03</td>
			<td>Used for handling the FTs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels - Sterile</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0513</td>
			<td>Used for FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish, vented, 28 ml (60mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3210</td>
			<td>Used for dissection and for testing fibrin gel formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12-well</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0049</td>
			<td>Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>391-3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>525-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td>Used to sterile-filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB74031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td>Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 96-well, U-bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>392-0019</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-528</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x22mm #1</td>
			<td>Menzel/Fisher</td>
			<td>15727582</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Kindler K102</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-0202</td>
			<td>Used for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>Used for preparing 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>341578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9394-500ML</td>
			<td>Used for preparing the fibrinogen and TA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Used for preparing the blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td>Aliquoted in -20 &#176;C, thaw before preparing the ex vivo culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate 10mg/ml</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0011-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell media MV Kit</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22120</td>
			<td>Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,&#160; 500 &#956;L of recombinant human epidermal growth factor (10 &#956;g/ mL) and 500 &#956;L of hydrocortisone (1 g/ mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201-2.5L-M</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, 20mM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>62249</td>
			<td>For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt Quick-hardening mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03989-100ml</td>
			<td>TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549-500UN&#160;</td>
			<td>Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3428</td>
			<td>Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 &#176;C, avoid repeated freeze/ thaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE-010</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>752-VC-025</td>
			<td>200 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF&#946;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF346</td>
			<td>1 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>01-106</td>
			<td>50 ng/ mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (JC70A)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0823</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 (QBEND10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M716501-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 (2B11+PD7/26)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M070129-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>ImmunoWay</td>
			<td>RLM3161</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved caspase-3 (5A1E)</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>9664</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERG (EP111)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M731429-2</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>NCL-Ki67p</td>
			<td>Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyve1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2089</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>ReliaTech</td>
			<td>102-PA32</td>
			<td>Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2727</td>
			<td>Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR3 (9D9F9)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3757</td>
			<td>Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-SMA (1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11057</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-21468</td>
			<td>Used at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX9 upright dissection stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For FT dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>For imaging of whole-mount immunostained FT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model for fibrovascular complications in proliferative diabetic retinopathy

Diabetesretinopati (DR) är den vanligaste mikrovaskulära komplikationen av diabetes och en av ledande orsakerna till blindhet i arbetsföra vuxna. Ingen aktuell djurmodeller för diabetes och syre-inducerad retinopati utveckla fullrange-progressiva förändringar manifesteras i mänskliga proliferativ diabetesretinopati (PDR). Därför har förståelse för sjukdomspatogenes och patofysiologi åberopat i hög grad användningen av histologiska sektioner och glaskroppen prover i metoder som endast ger steady state information om de inblandade patogena faktorerna. Ökande bevis indikerar att dynamiska cell-cell och cell-extracellulär matrix (ECM) interaktioner inom ramen av tredimensionella (3D) mikromiljö är väsentliga för de mekanistiska och funktionella studierna mot utvecklingen av nya behandlingsstrategier. Därför hypotesen vi att den patologiska fibrovaskulär vävnaden kirurgiskt utskurna från ögonen med PDR kunde utnyttjas tillförlitligt nysta de cellulära och molekylära mekanismerna av denna förödande sjukdom och att testa potentialen för romanen kliniska interventioner. Mot detta syfte utvecklat vi en ny metod för 3D ex vivo kultur kirurgiskt utskurna patientderiverade fibrovaskulär vävnad (FT), som kommer att utgöra en relevant modell av mänskliga PDR patofysiologi. FTs är dissekeras i bladsticklingar och inbäddade i fibrin matris för ex vivo kultur och 3D karakterisering. Hela-mount immunofluorescens infödda FTs och slutpunkten kulturer gör grundlig utredning av vävnadssammansättning och flercelliga processer, belysa vikten av 3D vävnad-nivå karakterisering för avtäckning relevanta inslagen i PDR patofysiologi. Denna modell tillåter samtidiga bedömningen av molekylära mekanismer, cellulär/vävnad processer och behandlingssvar i komplexa samband med dynamisk biokemiska och fysiska interaktioner inom PDR vävnad arkitektur och mikromiljö. Eftersom denna modell recapitulates PDR patofysiologi, kommer det också vara mottaglig för att testa eller utveckla nya behandlingar.

Djupare förståelse av PDR fibrovaskulär vävnad egenskaper och proteinuttryck har främst åberopat glaskroppen prover och tunn histologiska FT avsnitt3,15,16,17. För att utveckla en metod för grundlig utredning av 3D vävnad organisationen och flercelliga physiopathological processer av PDR, vi satt för att utnyttja den kirurgiskt exciderad, patientderive...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy at JoVE.com

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Här presenterar vi ett protokoll för att studera patofysiologin av proliferativ diabetesretinopati med patientderiverade, kirurgiskt utskurna, fibrovaskulär vävnader för tredimensionella infödda karakterisering och ex vivo vävnadskultur. Detta ex vivo kultur modell är också mottaglig för att testa eller utveckla nya behandlingar.

Ett Ex Vivo vävnadsodling modell för fibrovaskulär komplikationer i proliferativ diabetesretinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Diabetiker retinopati är den vanligaste mikrovaskulära komplikation av diabetes. Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor om patofysiologi av slutet skede sjukdom proliferative diabetiker retinopati. Denna teknik gör att dekonstruktion av den inhemska tredimensionella vävnad landskap och undersökningen av vävnad Patofysiologi i levande patienten material med direkt klinisk relevans. Se textprotokollet för detaljer om operationen och den instrumentering som utnyttjas i dissektionen. Till att börja placera fibrovascular vävnad som har strukits från personer som utsätts för människor genomgår transkonjunkturmikroincision vitreoretinal kirurgi i en cellkultur skålen som innehåller steril PBS. Med hjälp av en upprätt dissekering stereomikroskop, skär den fibrovaskulära vävnaden i ungefär en kvadratmillimeter bitar. Dränka vävnaden i PBS och håll vävnaden på plats med mikro dissektions pincett. Gör tydliga nedskärningar i vävnaden med en steril skalpell var noga med att undvika att riva den fibrovaskulära vävnaden. Placera varje enskild bit vävnad i en brunn av en 12 väl cellodling tallrik som innehåller en milliliter steril PBS. Först förbereda 25 microliter alikvoter av fibrinogen lösning vid rumstemperatur. Placera en bit fibrovaskulär vävnad i mitten av brunnen av en 24 väl platta och ta bort eventuella överskott PBS. Därefter lägger du till 25 mikroliter av TA-lösning till en av de beredda fibrinogen alikvoterna. Och med hjälp av en annan pipett inställd på 50 mikroliter blanda genom pipettering. Dispensera blandningen på bit av fibrovaskulär vävnad och pipetten upp och ner för att försäkra vävnadsbiten finns i droppen. Tiden för fibrinogen bildning kritisk för den tre dimensionalitet av ex vivo kultur, testas i en tom droppe tidigare vävnad inbäddning som beskrivs i protokollet. Inkubera plattan i en cellkultur inkubator. Efter 30 till 60 minuter luta plattan för att kontrollera att fibrin gel är helt bildas. Därefter överlägg de fibrovaskulära vävnadsfibringelerna med ex vivo-odlingsmedium kompletterat med aprotinin. Efter detta, returnera odlingsplattorna till cellodlingsinkubatorn för den önskade tidsperioden. Först, ersätta ex vivo odlingsmedium med en milliliter av paraformaldehyd lösning per brunn för att fixa kulturerna. Efter en timme, skölj gelerna med tre fem minuters PBS tvättar. Därefter ersätter PBS-tvätten med två milliliter natriumazidlösning per brunn. Förvara de fasta gelerna i fyra grader Celsius.Använd en rostfri i kvadratkantspateln för att lyfta dropparna från plattan försiktigt, med början i kanterna innan du lyfter mitten av droppen. Med hjälp av en rund kantad spatel överföra droppar till enskilda brunnar av en 12 brunnsplatta som innehåller en milliliter PBS. Efter detta, luta plattan på ett stöd och postfix dropparna med en milliliter iskall aceton metanol lösning i en minut. Skölj sedan med tre till fem två milliliter tvättar PBS. Centrifugera blockeringslösningen i 15 minuter för att avlägsna eventuellt skräp. Sedan lutar du plattan på ett stöd och inkuberar dropparna i 500 mikroliter av blockerande lösning i två timmar i rumstemperatur. Bered den primära antikroppsblandningen enligt textprotokollet. Använd sedan en rund kantad spatel för att överföra dropparna till en rund botten 96 brunnsplatta. Inkubera dropparna i 30 mikroliter av primär antikroppsblandning per droppe över natten vid fyra grader celsius. Nästa dag, överför dropparna till en 12 brunnsplatta som innehåller två milliliter tvättlösning per brunn. Skölj av dropparna med tre femminuterstvättar. Sedan tvättar du dropparna med nio 30-minuterstvättar. Följande dag, skölj dropparna tre gånger med PBS. Bered lämplig fluoroforekonjugerad sekundär antikroppsblandning enligt textprotokollet. Överför dropparna till en rund botten 96 väl platta, som tidigare visats, och inkubera plattan med 30 mikroliter sekundär antikroppsblandning i fyra timmar vid rumstemperatur, skyddad från ljus.Efter fyra timmar, överför dropparna till en 12 brunnsplatta som innehåller två milliliter tvättlösning per brunn. Skölj först dropparna med tre femminuterstvättar. Sedan tvättar du dropparna med fyra 30-minuterstvättar. Nästa dag, skölj dropparna fem gånger med tvättlösning i 30 minuter, och tre gånger med PBS i 30 minuter. Nästa dag, överför dropparna till en rund botten 96 väl platta, som tidigare visat. Counterstain dropparna med Hoechst nukleär fläck i 30 minuter i rumstemperatur. Överför dropparna till en 12 brunnsplatta innehållande två milliliter PBS per brunn och skölj tre gånger med PBS. Därefter applicera ett smalt lager av snabb härdning monteringsmedium längs kanterna på ett fyrkantigt täckglas och låt den torka i en minut. Skölj sedan droppen genom att doppa den i en brunn av en 12 brunnsplatta som innehåller avjoniserat vatten. Och för över droppen till ett mikroskopsglas. Därefter dispensera 15 mikroliter av icke-härdande anti-fade monteringsmedium på droppen. Placera täckglaset försiktigt över droppen med monteringsmediet mot rutschkanan och låt det lägga sig. Låt rutschkanorna torka i två timmar i rumstemperatur och förvara dem i fyra grader Celsius över natten. Slutligen, bild bilderna med en upprätt epifluorescens mikroskop utrustad med en optisk sektionering funktion på 20x eller 40x mål. I detta protokoll fibrovascular vävnad var beredd och avbildad. De representativa uppgifterna visade att PDR ex vivo kulturer inducera groning av CD-31 positiva endotelet och vasculature bevarande som svar på VEGFA. Omvänt, TGF

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex vivo kultur Patient Tissue &amp; Undersökning av Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex vivo Infektion av levande vävnad med oncolytic Virus

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell för att studera Hormone Action i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Humant Dupuytrens<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur för studien av Myofibroblaster och extracellulära matrixinteraktioner

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Skapande och Transplantation av en Adipose-derived Stem Cell (ASC) blad i en diabetiker sårläkning modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Bröstmjölk förbättrar tillväxten av Enteroids: ett Ex Vivo modell av cellproliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Bedömning av Plasma koagulation på levervävnad i en stor djurmodell In Vivo

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En liten djurmodell för Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårläkning korneal orgel kultur modell för studier

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Prekliniska modell av hind lem ischemia i diabetiska kaniner

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...