Name: behavioral approaches to studying innate stress in zebrafish
Uploaded: 2019-05-01T14:00:00
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Ce travail a été appuyé par le financement de la Jupiter Life Science Initiative à la Florida Atlantic University à ERD et ACK. Ces travaux ont également été soutenus par des subventions R21NS105071 (attribuées à l’ACK et à la ERD) et R15MH118625 (attribuées à la Dre) par les instituts nationaux de la santé.

Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux Florida Atlantic University.
1. la préparation
<ol><li>Désigner une pièce isolée pour effectuer des études comportementales, ou fermer une section d’une pièce afin qu’elle soit isolée. Remarque: la pièce doit être non perturbée et avoir un faible trafic pour éviter de perturber le comportement normal du poisson.</li>
	<li>Déplacez les matériaux et l’équipement suivants ...

Le zebrafish présente une réaction de stress solide dans un nouveau char Ici, nous décrivons une approche comportementale simple pour examiner les réponses au stress chez les adultes zebrafish, et valider l’approche comme une simple mesure du stress en utilisant la pharmacologie.
Le test du nouveau réservoir est un test largement utilisé pour examiner le stress inné chez le zébrafish et d’autres espèces de poissons12,<sup class="xref"...

Les réactions de stress sont altérées des États comportementaux et physiologiques résultant de stimuli potentiellement nocifs ou aversifs. Les réponses au stress sont conservées dans tout le règne animal et sont essentielles pour la survie d’un organisme1. Des décennies de recherche ont grandement élargi notre connaissance de certains des mécanismes génétiques et neuronaux sous-jacents aux États de stress. Aujourd’hui, les zones du cerveau telles que l’amygdale et le striatum2, et les facteurs génétiques tels que l’hormone de libération de la corticotropine (CRH), et les récepteurs glucocorticoïdes (GR) et mineralocorticoïdes ( m.) ont été étudiés intensivement3,4,5,6. Malgré ces résultats critiques, beaucoup reste inconnu au sujet de la régulation génétique et neuronale du stress. En tant que tel, de nombreux troubles liés au stress souffrent d’un manque de thérapeutique.
Les organismes modèles génétiquement amendables fournissent un outil utile dans l’étude du contrôle génétique et neuronale du comportement. Les modèles de poissons, en particulier, sont extrêmement puissants: ils sont de petits organismes avec des temps de génération courte, leur utilisation dans un cadre de laboratoire est facile, leurs génomes sont facilement modifiés, et, en tant que vertébrés, ils partagent non seulement génétique, mais aussi neuroanatomique homologie avec leurs homologues mammaliens7,8. Les dosages standard pour mesurer la contrainte peuvent être couplés avec des lignées de zébrafish qui sont des mutations génétiques, ou celles dans lesquelles la manipulation de sous-ensembles neuronaux précis est possible, et les effets de gènes isolés ou de neurones définis peuvent être évalués rapidement et efficacement.
Comportemental, les réponses au stress peuvent être caractérisées chez les poissons comme des périodes d’hyper-activité ou des périodes prolongées d’inactivité (semblable au «gel»)9, exploration réduite10, respiration rapide, réduction de l’apport alimentaire11, et a place-préférence pour le fond d’un réservoir12. Par exemple, lorsqu’ils sont placés dans un réservoir inconnu, le poisson-zèbre adulte et d’autres petits modèles de poissons montrent une préférence initiale pour la moitié inférieure du réservoir, mais, au fil du temps, les poissons commencent à explorer les moitiés supérieure et inférieure avec une fréquence presque égale à12. Traitement des adultes avec des médicaments connus pour réduire l’anxiété causer des poissons à explorer immédiatement la moitié supérieure10,13. Inversement, les médicaments qui augmentent l’anxiété causent le poisson à montrer une forte préférence pour la moitié inférieure du réservoir12,14,15. Ainsi, l’exploration et la préférence réduites pour la moitié inférieure du réservoir sont des indicateurs de stress simples et fiables.
Comme la plupart des vertébrés, les réactions de stress chez les poissons sont stimulés par l’activation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-inter-rénal (HPI; analogue à l’axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien [hPa] chez les mammifères)14,16. Les neurones hypothalamiques exprimant l’hormone de libération de la corticotrophine (CRH) du signal à l’hypophyse, qui à son tour libère l’hormone de libération adrénocorticotrope (ACTH). ACTH signale ensuite à la glande inter-rénale de produire et de sécréter le cortisol, qui a un certain nombre de cibles en aval16, l’un d’eux étant la rétroaction négative des neurones hypothalamiques de production de CRH3,17, 18,19.
Ici, nous décrivons une méthode pour évaluer les mesures comportementales du stress inné. Pour le comportement, nous détaillons les protocoles en utilisant le nouvel essai de plongée de réservoir12,14. Nous démontrons ensuite, à titre d’exemple, qu’un médicament anxiolytique connu, la buspirone, réduit les mesures comportementales du stress.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1043px;" width="1042">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Camera</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Infrared filter</td>
			<td style="width:264px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Video Acquisition Program</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Infrared LED lights</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Assay tank</td>
			<td style="width:264px;">Aquaneering</td>
			<td style="width:181px;">Part number ZT180</td>
			<td style="width:380px;">Size: M3 1.8 liter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stand and clamp, or standard tripod for camera</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">250mL beaker</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Tracking software</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Buspirone chloride</td>
			<td style="width:264px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">B7148</td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Randomized trial generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral approaches to studying innate stress in zebrafish

La réponse appropriée aux stimuli stressants est essentielle pour la survie d’un organisme. Des recherches approfondies ont été menées sur un large éventail de maladies liées au stress et de troubles psychiatriques, mais d’autres études sur la régulation génétique et neuronale du stress sont encore nécessaires pour développer de meilleurs traitements thérapeutiques. Le zébrafish fournit un modèle génétique puissant pour enquêter sur les fondements neuronaux du stress, car il existe une grande collection de lignées mutantes et transgéniques. En outre, la pharmacologie peut facilement être appliquée à la zébrafish, car la plupart des médicaments peuvent être ajoutés directement à l’eau. Nous décrivons ici l’utilisation du «test du nouveau réservoir» comme une méthode pour étudier les réponses innées du stress chez le zébrafish, et démontrer comment les médicaments anxiolytiques potentiels peuvent être validés en utilisant le dosage. La méthode peut facilement être couplée avec des lignées de zébrafish qui constituent des mutations génétiques, ou celles dans lesquelles des approches transgéniques pour manipuler des circuits neuronaux précis sont utilisées. Le dosage peut également être utilisé dans d’autres modèles de poissons. Ensemble, le protocole décrit devrait faciliter l’adoption de ce dosage simple à d’autres laboratoires.

Examen du stress dans le zébrafish Pour examiner le comportement du stress au fil du temps dans le zébrafish de type sauvage, nous avons testé des poissons adultes de la souche AB24 dans le test du nouveau réservoir. Les adultes AB ont été soumis au protocole tel que décrit ci-dessus. Brièvement, les poissons ont reçu une période d’acclimatation de 1 h dans un réservoir dans la salle de comportement. Une personne a été placée dans un bé...

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Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Ce manuscrit décrit une méthode simple pour mesurer le stress comportemental chez le zébrafish adulte. L’approche profite de la tendance innée que le zébrafish préfèrent la moitié inférieure d’un réservoir quand dans un État stressant. Nous décrivons également les méthodes de couplage du dosage avec la pharmacologie.

Approches comportementales pour étudier le stress inné dans le Zébrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Le nouvel essai de réservoir se combinera avec des outils génétiques puissants dans Zebrafish offre une méthode pour disséquer la façon dont le cerveau module le stress et comment les circuits neuronaux peuvent être déréglementés. Les voies de signalisation génétiques et neuronales sont fortement conservées entre le poisson zèbre et les mammifères et cette technique peut nous aider à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la réponse au stress. La méthode n’est pas spécifique au poisson zèbre et a été utilisée avec les poissons aveugles mexicains des cavernes et peut donc potentiellement être étendue à d’autres espèces de poissons.Une course d’essai peut être utile pour déterminer l’éclairage et le contraste appropriés de l’animal sur un fond pour réaliser le suivi réussi. L’essai est rarement utilisé, mais peut être un processus impliqué. La visualisation des étapes aidera d’autres chercheurs à exécuter la procédure avec succès.Jacqueline Chin, post-doc au laboratoire, et Lydia Albert, étudiante de premier cycle, feront la démonstration de cette procédure. Commencez par remplir un bécher de 250 millilitres et au moins deux réservoirs de retenue avec de l’eau du système de poissons. Le matin de l’essai, transférer au moins 10 poissons zèbres adultes pour chaque condition expérimentale dans des réservoirs de retenue individuels avant de transférer tous les poissons à la salle de comportement pour l’aclimation pendant au moins une heure.Étiquetez les réservoirs de telle sorte que l’état ou le génotype des animaux est aveugle à l’expérimentateur et utilisez un filet pour placer doucement un seul adulte dans le bécher prére rempli. Laissez les poissons adultes s’acclimater dans le bécher pendant 10 minutes avant de verser doucement l’eau et le poisson du bécher dans le nouveau réservoir expérimental. Dès que le poisson est dans le réservoir, commencer l’enregistrement de la caméra et s’éloigner de la configuration pour éviter une détresse supplémentaire pour le poisson.Lorsque l’enregistrement est terminé, retirez l’individu du nouveau réservoir et placez le poisson dans un nouveau réservoir de détention. Pour évaluer les effets de médicaments spécifiques d’intérêt, diluer le médicament à une concentration de travail dans 250 millilitres de l’eau du système. Utilisation d’un bécher avec de l’eau système seulement comme un contrôle.Masquer l’identité du médicament et contrôler les beakers pour s’assurer que le testeur est aveugle aux conditions de traitement jusqu’à ce qu’il post-analyse et effectuer un nouveau test de réservoir comme démontré pour obtenir une réponse de stress comportemental de base. À la fin de l’enregistrement de base, utilisez un filet pour transférer immédiatement le poisson dans l’un des béchers d’essai pendant 10 minutes avant de transférer le poisson dans un bécher de lavage contenant de l’eau du système frais seulement. Il est important d’utiliser des filets distincts désignés pour chaque bécher de traitement pour prévenir le dosage accidentel des poissons témoins, en particulier lorsque plusieurs traitements médicamenteux sont impliqués.Après 10 minutes, placez le poisson dans un nouveau réservoir pour un deuxième essai de réservoir nouveau. À la fin de l’essai, transférer le poisson zèbre adulte dans un nouveau réservoir de détention et remplacer l’eau du système dans le deuxième nouveau réservoir par de l’eau du système frais pour la prochaine étape afin d’éviter la contamination croisée du médicament expérimental. À la fin de tous les essais, retournez les individus à l’installation de pêche.Ici, l’activité locomotrice d’un seul poisson zèbre pendant la première et la dernière minute d’un essai de réservoir de 10 minutes est montrée. Lorsqu’ils sont introduits dans le réservoir pour la première fois, les poissons passent généralement la majorité du temps au fond du nouveau réservoir. Au fil du temps, cependant, les poissons adultes démontrent une augmentation graduelle de la quantité de temps passé dans le haut du réservoir.En effet, le temps total passé dans le haut du réservoir pendant la première minute est significativement plus court par rapport à la dernière minute du nouvel essai de réservoir. En revanche, la distance totale parcourue entre la première et la dernière minute ne révèle aucune différence significative. Dans cette expérience représentative, l’analyse des chemins locomoteurs adultes du poisson zèbre a révélé peu de différence entre l’activité de natation du poisson zèbre avant et après le traitement pour les groupes d’adultes exposés au seul véhicule.En revanche, les adultes exposés à un médicament anxiolytique ont passé beaucoup de temps dans le haut du réservoir par rapport aux chemins locomoteurs du même poisson avant l’exposition aux médicaments. Ces différences n’étaient pas dues à une moins grande locomotion en général, car aucune différence significative dans la distance parcourue n’a été mesurée pour l’un ou l’autre des groupes. Comme les rythmes comportementaux sont affectés par les processus circadiens, assurez-vous d’effectuer des répliques expérimentales effectuées à différents jours à la même heure de la journée pour chaque expérience.D’autres analyses comportementales, telles que l’essai en plein champ ou d’autres mesures physiologiques du stress, peuvent être effectuées pour valider davantage les résultats obtenus lors du nouveau test de plongée en réservoir. Cette méthode peut être utilisée un essai de débit élevé pour répondre aux questions liées au stress, la peur et l’anxiété.

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