Name: behavioral approaches to studying innate stress in zebrafish
Uploaded: 2019-05-01T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da iniciativa de ciência da vida de Júpiter na Universidade Atlântica da Flórida para ERD e ACK. Este trabalho também foi apoiado por subsídios R21NS105071 (concedido a ACK e ERD) e R15MH118625 (concedido ao ERD) dos institutos nacionais de saúde.

O protocolo foi aprovado pela instituição de cuidados institucionais de animais e uso Committeeat Florida Atlantic University.
1. preparação
<ol><li>Designe um quarto isolado para executar estudos comportáveis, ou feche fora de uma seção de um quarto de modo que seja isolado. Nota: o quarto deve ser imperturbável e ter tráfego baixo para evitar interromper o comportamento normal dos peixes.</li>
	<li>Mova os seguintes materiais e equipamentos para a sala comportamental: (i) uma c...

Zebrafish exibem uma resposta de stress robusta em um novo tanque Aqui, nós descrevemos uma aproximação comportável simples para examinar respostas do esforço no zebrafish adulto, e validamos a aproximação como uma medida simples do stress usando a farmacologia.
O novo teste do tanque é um teste amplamente utilizado para examinar o estresse inato em zebrafish e outras espécies de peixes12,14,<sup class="...

As respostas ao estresse são Estados comportamentais e fisiológicos alterados resultantes de estímulos potencialmente prejudiciais ou aversivos. As respostas ao estresse são conservadas em todo o reino animal e são críticas para a sobrevivência de um organismo1. Décadas de pesquisa expandiram enormemente nosso conhecimento de alguns dos mecanismos genéticos e neuronais subjacentes aos Estados de estresse. Hoje, as áreas do cérebro, como a amígdala e o estriado2, e fatores genéticos como o hormônio liberador de corticotropina (CRH), e os receptores de glicocorticóide (gr) e Mineralocorticoide ( Mr) foram estudados extensivamente3,4,5,6. Apesar destes resultados críticos, muito permanece desconhecido sobre a regulação genética e neuronal do stress. Como tal, muitos distúrbios relacionados com o stress sofrem de uma falta de terapêutica.
Organismos modelo geneticamente modificáveis fornecem uma ferramenta útil no estudo do controle genético e neuronal do comportamento. Os modelos de peixes, em particular, são extremamente poderosos: eles são pequenos organismos com tempos de geração curtos, seu uso em um ambiente laboratorial é facile, seus genomas são facilmente modificados, e, como um vertebrado, eles compartilham não só genética, mas também neuroanatômica homologia com seus homólogos mamíferos7,8. Os ensaios padrão para o stress de medição podem ser emparelhados com as linhas do zebrafish que abrigando mutações genéticas, ou aquelas em que a manipulação de subconjuntos neuronal precisos é possível, e os efeitos de únicos genes ou de neurônios definidos podem ser avaliados ràpida e eficientemente.
Comportamentalmente, as respostas ao estresse podem ser caracterizadas em peixes como períodos de hiperatividade ou períodos prolongados de inatividade (semelhante a "congelamento")9, redução da exploração10, respiração rápida, ingestão reduzida de alimentos11, e um lugar-preferência para o fundo de um tanque12. Por exemplo, quando colocado em um tanque desconhecido, o zebrafish adulto e outros modelos pequenos do peixe mostram uma preferência inicial para a metade inferior do tanque, contudo, sobre o tempo, os peixes começam a explorar as metades superiores e inferiores com freqüência próximo-igual12. Tratamento de adultos com drogas conhecidas para reduzir a ansiedade causa peixe para explorar imediatamente a metade superior10,13. Inversamente, as drogas que aumentam a ansiedade causam o peixe a mostrar forte preferência pela metade inferior do tanque12,14,15. Assim, a exploração e a preferência reduzidas para a metade inferior do tanque são indicadores simples e de confiança do esforço.
Como a maioria dos vertebrados, as respostas ao estresse em peixes são impulsionadas pela ativação do eixo hipotálamo-hipófise-interrenal (HPI; análoga ao eixo hipotálamo-hipófise-adrenal [hPa] em mamíferos)14,15. Neurónios hipotalâmicos expressando o sinal de hormônio liberador de corticotropina (CRH) para a hipófise, que por sua vez libera hormônio liberador Adrenocorticotrópico (ACTH). ACTH então sinaliza para a glândula interrenal para produzir e secretar cortisol, que tem um número de alvos a jusante16, sendo um deles feedback negativo dos neurônios hipotalâmicos produtores de CRH3,17, 18,19.
Aqui, nós descrevemos um método para avaliar medidas comportáveis do stress inata. Para o comportamento, nós detalha protocolos usando o teste novo do mergulho do tanque12,14. Em seguida, demonstramos, como exemplo, que uma droga ansiolítica conhecida, buspirona, reduz as medidas comportamentais do estresse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1043px;" width="1042">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Camera</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Infrared filter</td>
			<td style="width:264px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Video Acquisition Program</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Infrared LED lights</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Assay tank</td>
			<td style="width:264px;">Aquaneering</td>
			<td style="width:181px;">Part number ZT180</td>
			<td style="width:380px;">Size: M3 1.8 liter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stand and clamp, or standard tripod for camera</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">250mL beaker</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Tracking software</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Buspirone chloride</td>
			<td style="width:264px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">B7148</td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Randomized trial generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral approaches to studying innate stress in zebrafish

Responder apropriadamente a estímulos estressores é essencial para a sobrevivência de um organismo. A pesquisa extensiva foi feita em um espectro largo de doenças stress-related e de desordens psiquiátricas, contudo uns estudos mais adicionais na regulação genética e neuronal do stress são exigidos ainda para desenvolver uma terapêutica melhor. O zebrafish fornece um modelo genético poderoso para investigar os fundamentos neural do stress, porque existe uma grande coleção de linhas mutantes e transgénicas. Além disso, a farmacologia pode ser facilmente aplicada ao zebrafish, pois a maioria das drogas pode ser adicionada diretamente à água. Nós descrevemos aqui o uso do "teste novo do tanque" como um método para estudar respostas inatas do esforço no zebrafish, e demonstramos como os fármacos ansiolíticos potenciais podem ser validados usando o ensaio. O método pode facilmente ser acoplado com as linhas do zebrafish que abrigando mutações genéticas, ou aquelas em que as aproximações transgénicas para manipular circuitos neural precisos são usadas. O ensaio também pode ser usado em outros modelos de peixes. Juntos, o protocolo descrito deve facilitar a adoção deste ensaio simples para outros laboratórios.

Examinando o stress no zebrafish Para examinar o comportamento de estresse ao longo do tempo em zebrafish tipo selvagem, testamos peixes adultos da cepa AB24 no teste de tanque novo. Os adultos do AB foram submetidos ao protocolo como descrito acima. Momentaneamente, os peixes foram dados um período da Aclimação 1-h em um tanque na sala do comportamento. Um indivíduo foi colocado em um copo para 10-min, e depois colocado suavemente em um tanque desc...

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Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Este manuscrito descreve um método simples para medir o stress comportamentalmente no zebrafish adulto. A abordagem tira proveito da tendência inata que zebrafish preferem a metade inferior de um tanque quando em um estado estressante. Nós igualmente descrevemos métodos para acoplando o ensaio com farmacologia.

Abordagens comportamentais para estudar estresse inato em zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

O novo ensaio do tanque se combinará com poderosas ferramentas genéticas em Zebrafish oferece um método para dissecar como o cérebro modula o estresse e como circuitos neurais podem ser desregulados. As vias de sinalização genética e neuronal são altamente conservadas entre zebrafish e mamíferos e essa técnica pode ajudar a aprofundar nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à resposta ao estresse. O método não é específico para o Zebrafish e tem sido usado com os peixes cegos mexicanos e, portanto, pode ser potencialmente estendido a outras espécies de peixes.Um teste pode ser útil para determinar a iluminação adequada e o contraste do animal em um fundo para alcançar o rastreamento bem sucedido. O ensaio raramente é usado, mas pode ser um processo envolvido. Visualizar as etapas ajudará outros pesquisadores a executar o procedimento com sucesso.Jacqueline Chin, pós-doutora no laboratório, e Lydia Albert, uma estudante de graduação, estarão demonstrando esse procedimento. Comece preenchendo um béquer de 250 mililitros e pelo menos dois tanques de retenção com água do sistema de peixes. Na manhã do teste, transfira pelo menos 10 zebrafish adultos para cada condição experimental em tanques de retenção individuais antes de transferir todos os peixes para a Sala de Comportamento para aclimatação por pelo menos uma hora.Rotule os tanques de tal forma que a condição ou genótipo dos animais seja cego para o experimentador e use uma rede para colocar suavemente um único adulto no béquer pré-preenchido. Deixe o peixe adulto se aclimatar no béquer por 10 minutos antes de despejar suavemente a água e o peixe do béquer no tanque experimental. Assim que o peixe estiver no tanque, inicie a gravação da câmera e afaste-se da configuração para evitar sofrimento adicional aos peixes.Quando a gravação terminar, remova o indivíduo do novo tanque e coloque o peixe em um novo tanque de retenção. Para avaliar os efeitos de drogas específicas de interesse, diluir a droga para uma concentração de trabalho em 250 béquers mililitros de água do sistema. Usando um béquer com água do sistema apenas como controle.Mascarar as identidades da droga e controlar os béquers para garantir que o testador esteja cego às condições de tratamento até a pós-análise e realize um novo teste de tanque, como demonstrado para obter uma resposta de estresse comportamental de base. No final da gravação da linha de base, use uma rede para transferir imediatamente o peixe para um dos béquers de teste por 10 minutos antes de transferir o peixe para um béquer de lavagem contendo apenas água fresca do sistema. É importante usar redes separadas designadas para cada béquer de tratamento para evitar a dosagem acidental do peixe controle, especialmente quando vários tratamentos medicamentosos estão envolvidos.Depois de 10 minutos, coloque o peixe em um novo tanque para um segundo novo teste de tanque. No final do teste transfira o zebrafish adulto para um novo tanque de retenção e substitua a água do sistema no segundo tanque novo por água fresca do sistema para o próximo passo para evitar a contaminação cruzada da droga experimental. No final de todos os testes, devolva os indivíduos para a instalação de peixes.Aqui é mostrada a atividade locomotor de um único zebrafish durante o primeiro e último minuto de um novo teste de tanque de 10 minutos. Quando introduzido pela primeira vez no tanque, os peixes normalmente passam a maior parte do tempo no fundo do novo tanque. Com o tempo, no entanto, os peixes adultos demonstram um aumento gradual no tempo gasto no topo do tanque.De fato, o tempo total gasto no topo do tanque durante o primeiro minuto é significativamente menor em comparação com o último minuto do novo teste do tanque. Em contrapartida, a distância total percorrida entre o primeiro e o último minuto não revela diferenças significativas. Neste experimento representativo, a análise dos caminhos locomotores adultos do Zebrafish revelou pouca diferença entre a atividade de natação de zebrafish antes e depois do tratamento para grupos de adultos expostos apenas ao veículo.Em contraste, adultos expostos a uma droga ansiolítica passaram grande parte do tempo no topo do tanque em comparação com os caminhos locomomotores do mesmo peixe antes da exposição à droga. Essas diferenças não se devem à menor locomoção em geral, pois não foram mensuradas diferenças significativas na distância percorrida para nenhum dos grupos. Como os ritmos comportamentais são afetados por processos circadianos, certifique-se de realizar réplicas experimentais realizadas em dias diferentes durante a mesma hora do dia para cada experimento.Ensaios comportamentais adicionais, como o teste de campo aberto ou outras medidas fisiológicas de estresse, podem ser realizados para validar ainda mais os resultados obtidos a partir do novo teste de mergulho do tanque. Este método pode ser usado como um ensaio de alto rendimento para abordar questões relacionadas ao estresse, medo e ansiedade.

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