Name: behavioral approaches to studying innate stress in zebrafish
Uploaded: 2019-05-01T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el financiamiento de la iniciativa de ciencia de vida de Júpiter en la Universidad atlántica de Florida a ERD y ACK. Este trabajo también fue apoyado por subvenciones R21NS105071 (otorgadas a ACK y ERD) y R15MH118625 (otorgadas a ERD) de los institutos nacionales de salud.

El protocolo ha sido aprobado por el Comité institucional de cuidado de animales y uso de la Universidad atlántica de Florida Atlantic.
1. preparación
<ol><li>Designe una habitación aislada para realizar estudios de comportamiento o cierre una sección de una habitación para que se aísla. Nota: la habitación debe estar sin perturbaciones y tener poco tráfico para evitar alterar el comportamiento normal de los peces.</li>
	<li>Mueva los siguientes materiales y equipos a la sala de ...

El pez cebra exhibe una respuesta de estrés robusta en un nuevo tanque Aquí describimos un enfoque de comportamiento simple para examinar las respuestas de estrés en el pez cebra adulto, y validar el enfoque como una medida simple de estrés usando farmacología.
La prueba de tanque novel es una prueba ampliamente utilizada para examinar el estrés innato en el pez cebra y otras especies de peces12,14,<sup cla...

Las respuestas de estrés son estados fisiológicos y conductuales alterados resultantes de estímulos potencialmente dañinos o aversivos. Las respuestas al estrés se conservan en todo el reino animal, y son fundamentales para la supervivencia de un organismo1. Décadas de investigación han ampliado en gran medida nuestro conocimiento de algunos de los mecanismos genéticos y neuronales subyacentes Estados de estrés. En la actualidad, las áreas del cerebro, como la amígdala y el estriado2, y los factores genéticos como la hormona liberadora de corticotropina (CRH) y los receptores glucocorticoides (gr) y mineralocorticoides ( Mr) se han estudiado extensamente3,4,5,6. A pesar de estos hallazgos críticos, todavía se desconoce mucho sobre la regulación genética y neuronal del estrés. Como tal, muchos trastornos relacionados con el estrés sufren de una falta de terapias.
Los organismos modelo genéticamente modificables proporcionan una herramienta útil en el estudio del control genético y neuronal del comportamiento. Los modelos de peces, en particular, son extremadamente poderosos: son pequeños organismos con tiempos de generación corta, su uso en un entorno de laboratorio es Facile, sus genomas son fácilmente modificados, y, como vertebrados, comparten no sólo genética, sino también neuroanatómico homología con sus homólogosdemamífero7,8. Los ensayos estándar para medir el estrés se pueden emparejar con las líneas de pez cebra que albergan mutaciones genéticas, o aquellas en las que es posible manipular subconjuntos neuronales precisos, y los efectos de genes individuales o neuronas definidas pueden evaluarse de forma rápida y eficiente.
El comportamiento, las respuestas de estrés se pueden caracterizar en el pescado como períodos de hiper-actividad o períodos prolongados de inactividad (similar a ' congelación ')9, reducción de la exploración10, respiración rápida, reducción de la ingesta de alimentos11, y un lugar-preferencia para el fondo de un tanque12. Por ejemplo, cuando se coloca en un tanque desconocido, pez cebra adulto y otros modelos de peces pequeños muestran una preferencia inicial para la mitad inferior del tanque, sin embargo, con el tiempo, los peces comienzan a explorar las mitades superior e inferior con la frecuencia casi igual12. El tratamiento de los adultos con fármacos conocidos para reducir la ansiedad causa que los peces exploren inmediatamente la mitad superior10,13. Por el contrario, los fármacos que aumentan la ansiedad causan que los peces muestren una fuerte preferencia por la mitad inferior del tanque12,14,15. Por lo tanto, la exploración reducida y la preferencia por la mitad inferior del tanque son indicadores simples y confiables de estrés.
Como la mayoría de los vertebrados, las respuestas de estrés en los peces son impulsadas por la activación del eje hipotalámico-pituitario-inter-renal (HPI; análogo al eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal [hPa] en mamíferos)14,16. Las neuronas hipotalámicas que expresan la hormona liberadora de corticotropina hormonal (CRH) la señal a la hipófisis, que a su vez libera la hormona liberadora adrenocorticotropa (ACTH). ACTH entonces señala a la glándula Interrenal para producir y secretar cortisol, que tiene una serie de objetivos descendentes16, uno de ellos siendo retroalimentación negativa de las neuronas hipotalámicas que producen CRH3,17, 18,19.
Aquí describimos un método para evaluar las medidas conductuales del estrés innato. Para el comportamiento, detallamos los protocolos usando la nueva prueba de buceo de tanque12,14. A continuación, demostramos, como ejemplo, que un fármaco ansiolítico conocido, la buspirona, reduce las medidas conductuales del estrés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1043px;" width="1042">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Camera</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Infrared filter</td>
			<td style="width:264px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Video Acquisition Program</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Infrared LED lights</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Assay tank</td>
			<td style="width:264px;">Aquaneering</td>
			<td style="width:181px;">Part number ZT180</td>
			<td style="width:380px;">Size: M3 1.8 liter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Stand and clamp, or standard tripod for camera</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">250mL beaker</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:217px;">Tracking software</td>
			<td style="width:264px;"></td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:380px;">We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Buspirone chloride</td>
			<td style="width:264px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">B7148</td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Randomized trial generator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral approaches to studying innate stress in zebrafish

Responder apropiadamente a estímulos estresantes es esencial para la supervivencia de un organismo. Se ha realizado una extensa investigación sobre un amplio espectro de enfermedades relacionadas con el estrés y trastornos psiquiátricos, pero aún se requieren más estudios sobre la regulación genética y neuronal del estrés para desarrollar una mejor terapéutica. El pez cebra proporciona un poderoso modelo genético para investigar los fundamentos neurales del estrés, ya que existe una gran colección de líneas mutantes y transgénicas. Además, la farmacología se puede aplicar fácilmente al pez cebra, ya que la mayoría de los fármacos se pueden agregar directamente al agua. Describimos aquí el uso de la ' prueba de tanque de novela ' como un método para estudiar las respuestas de estrés innata en el pez cebra, y demostrar cómo los fármacos ansiolíticos potenciales pueden ser validados utilizando el ensayo. El método se puede acoplar fácilmente con las líneas de pez cebra que albergan mutaciones genéticas, o aquellos en los que se utilizan enfoques transgénicos para manipular circuitos neuronales precisos. El ensayo también se puede utilizar en otros modelos de peces. En conjunto, el protocolo descrito debería facilitar la adopción de este sencillo ensayo a otros laboratorios.

Examinar el estrés en el pez cebra Para examinar el comportamiento del estrés a lo largo del tiempo en el pez cebra silvestre, probamos el pescado adulto de la cepa AB24 en la prueba del tanque novel. Los adultos AB fueron sometidos al Protocolo como se describió anteriormente. Brevemente, a los peces se les dio un período de aclimatación de 1-h en un tanque en la sala de comportamiento. Un individuo fue colocado en un vaso de precipitados durante ...

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Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Este manuscrito describe un método simple para medir el estrés de forma oral en el pez cebra adulto. El enfoque aprovecha la tendencia innata que el pez cebra prefiere la mitad inferior de un tanque cuando está en un estado estresante. También describimos métodos para acoplar el ensayo con farmacología.

Enfoques conductuales para estudiar el estrés innato en el pez cebra

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

El nuevo ensayo de tanques se combinará con potentes herramientas genéticas en Zebrafish ofrece un método para diseccionar cómo el cerebro modula el estrés y cómo los circuitos neuronales pueden ser desregulados. Las vías de señalización genética y neuronal están altamente conservadas entre el pez cebra y los mamíferos y esta técnica puede ayudar a una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes a la respuesta al estrés. El método no es específico del pez cebra y se ha utilizado con los peces de cueva ciegos mexicanos y, por lo tanto, potencialmente puede extenderse a otras especies de peces.Una prueba puede ser útil para determinar la iluminación adecuada y el contraste del animal en un fondo para lograr un seguimiento exitoso. El ensayo rara vez se usa, pero puede ser un proceso involucrado. Visualizar los pasos ayudará a otros investigadores a ejecutar con éxito el procedimiento.Jacqueline Chin, una post-doc en el laboratorio, y Lydia Albert, una estudiante de pregrado, demostrarán este procedimiento. Comience llenando un vaso de precipitados de 250 mililitros y al menos dos tanques de retención con agua del sistema de peces. En la mañana de la prueba, transfiera al menos 10 peces Zebra adultos por cada condición experimental a tanques de retención individuales antes de transferir todos los peces a la sala de comportamiento para la aclimatación durante al menos una hora.Etiqueta los tanques de tal manera que la condición o el genotipo de los animales sea ciego al experimentador y usa una red para colocar suavemente a un solo adulto en el vaso de precipitados. Permita que el pez adulto se aclimate en el vaso de precipitados durante 10 minutos antes de verter suavemente el agua y los peces del vaso de precipitados en el tanque de novela experimental. Tan pronto como el pez esté en el tanque, comience la grabación de la cámara y aléjese de la configuración para evitar problemas adicionales a los peces.Cuando la grabación haya terminado, retire al individuo del tanque de la novela y coloque el pez en un nuevo tanque de retención. Para evaluar los efectos de fármacos específicos de interés, diluir el fármaco a una concentración de trabajo en 250 mililitros de agua del sistema. Usar un vaso de precipitados con agua del sistema sólo como control.Enmascarar las identidades de los vasos de control y drogas para asegurarse de que el probador está ciego a las condiciones de tratamiento hasta el post-análisis y realizar una nueva prueba de tanque como se ha demostrado para obtener una respuesta de estrés conductual basal. Al final de la grabación de línea de base, utilice una red para transferir inmediatamente el pescado a uno de los vasos de prueba durante 10 minutos antes de transferir el pescado a un vaso de precipitados de lavado que contenga solo agua dulce del sistema. Es importante utilizar redes separadas designadas para cada vaso de precipitados de tratamiento para evitar la dosificación accidental de los peces de control, especialmente cuando intervienen varios tratamientos farmacológicos.Después de 10 minutos, coloque el pez en un nuevo tanque de novela para una segunda prueba de tanques novedosos. Al final de la prueba, transfiera el pez Zebra adulto a un nuevo tanque de retención y sustituya el agua del sistema en el segundo tanque novedoso por agua fresca del sistema para el siguiente paso para evitar la contaminación cruzada del medicamento experimental. Al final de todas las pruebas, devuelva a los individuos a la instalación de peces.Aquí se muestra la actividad locomotora de un solo pez cebra durante el primer y último minuto de una prueba de tanque novedoso de 10 minutos. Cuando se introduce por primera vez en el tanque, los peces suelen pasar la mayor parte del tiempo en el fondo del nuevo tanque. Con el tiempo, sin embargo, los peces adultos demuestran un aumento gradual en la cantidad de tiempo pasado en la parte superior del tanque.De hecho, el tiempo total pasado en la parte superior del tanque durante el primer minuto es significativamente más corto en comparación con el último minuto de la nueva prueba del tanque. Por el contrario, la distancia total recorrida entre el primer y el último minuto no revela diferencias significativas. En este experimento representativo, el análisis de las rutas locomotoras adultas Zebrafish reveló poca diferencia entre la actividad de natación de peces Zebra antes y después del tratamiento para grupos de adultos expuestos solo al vehículo.Por el contrario, los adultos expuestos a un fármaco ansiolítico pasaron una gran cantidad de tiempo en la parte superior del tanque en comparación con las rutas locomotoras del mismo pez antes de la exposición a la droga. Estas diferencias no se debieron a una menor locomoción en general, ya que no se midieron diferencias significativas en la distancia recorrida para ninguno de los grupos. Como los ritmos conductuales se ven afectados por procesos circadianos, asegúrese de llevar a cabo réplicas experimentales realizadas en diferentes días durante la misma hora del día para cada experimento.Se pueden realizar ensayos conductuales adicionales, como la prueba de campo abierto u otras mediciones fisiológicas del estrés, para validar aún más los resultados obtenidos de la nueva prueba de buceo en tanques. Este método se puede utilizar un ensayo de alto rendimiento para abordar preguntas relacionadas con el estrés, el miedo y la ansiedad.

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