Name: uptake of new lipid-coated nanoparticles containing falcarindiol by human mesenchymal stem cells
Uploaded: 2019-02-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Författarna tackar Dr. Moustapha Kassem (Odense universitetssjukhus, Danmark) för de humana mesenkymala stamcellerna. Författarna vill tacka den danska Medical Bioimaging Center för tillgång till deras Mikroskop. Författarna vill tacka Carlsberg och Villum grunden för ekonomiskt stöd (till E.A.C.). Författarna erkänner det ekonomiska stödet vid Niels Bohr professur utmärkelsen från danska National Research Foundation.

1. nanopartiklar syntes genom snabb växling teknik
<ol><li>Konfigurera följande för de nanopartiklar beredning: ett block värmare/prov koncentrator, exsickator, en digital dispenseringssystem med en 1 mL spruta av glas, en 12 mL injektionsflaska av glas, en magnetisk omrörare, en magnetisk loppa (15 mm x 4,5 mm, i en cylindrisk form med polytetrafluoreten [PTFE] beläggning) inuti glasflaskan, och en roterande indunstare.</li>
	<li>Fördela 2,4 mL av 250 µM falcarindiol lager löses i 70% EtOH vatten blandning i ...

<ol>
	<li>Firestone, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Density+Lipoprotein+as+a+Vehicle+for+Targeting+Antitumor+Compounds+to+Cancer+Cells.">Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 5 (2), 105-113 (1994).</li><li>Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolic+reprogramming+in+cancer+cells.">Lipid metabolic reprogramming in cancer cells.</a> Oncogenesis. 5 (1), 189 (2016).</li><li>Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+on+nanoparticle-based+drug+delivery+systems+for+cancer+therapy.">Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy.</a> Cancer Biology &amp; Medicine. 14 (3), 228 (2017).</li><li>Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+unexplained+hypoalbuminaemia+and+new+cancer+diagnoses+in+UK+primary+care+patients.">Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients.</a> Family Practice. 33 (5), 449-452 (2016).</li><li>Yue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesteryl+ester+accumulation+induced+by+PTEN+loss+and+PI3K/AKT+activation+underlies+human+prostate+cancer+aggressiveness.">Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).</li><li>dos Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LDL-cholesterol+signaling+induces+breast+cancer+proliferation+and+invasion.">LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion.</a> Lipids in Health and Disease. 13 (16), (2014).</li><li>Gallagher, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+tumor+LDLR+expression+accelerates+LDL+cholesterol-mediated+breast+cancer+growth+in+mouse+models+of+hyperlipidemia+HHS+Public+Access.">Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access.</a> Oncogene. 36 (46), 6462-6471 (2017).</li><li>Needham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom+up+design+of+nanoparticles+for+anti-cancer+diapeutics:+"put+the+drug+in+the+cancer's+food".">Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food".</a> Journal of Drug Targeting. 24 (9), 836-856 (2016).</li><li>Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cancer+chemotherapy+using+synthetic+nanoparticles.">Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles.</a> United States Patent Application Publication. , (2009).</li><li>Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nano-LDL+with+paclitaxel+oleate+as+a+targeted+drug+delivery+vehicle+for+glioblastoma+multiforme.">Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme.</a> Journal of Controlled Release. 124 (3), 163-171 (2007).</li><li>Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+data+from+LDL+composition+and+size+measurement+are+compatible+with+a+discoid+particle+shape.">Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape.</a> Journal of Lipid Research. 45 (5), 954-966 (2004).</li><li>Schweizer, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+niclosamide+in+combination+with+enzalutamide+in+men+with+castration-resistant+prostate+cancer.">A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202709 (2018).</li><li>Allen, T. M., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+stealth+versus+conventional+liposomes:+effect+of+dose.">Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068 (2), 133-141 (1991).</li><li>Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enhanced+Permeability+and+Retention+(EPR)+Effect+in+Tumor+Vasculature:+The+Key+Role+of+Tumor-Selective+Macromolecular+Drug+Targeting.">The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting.</a> Advances in Enzyme Regulation. 41 (1), 189-207 (2001).</li><li>Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+Enhanced+Permeation+and+Retention+(EPR)+Effect.">Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0123461 (2015).</li><li>Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanocarriers+Usage+for+Drug+Delivery+in+Cancer+Therapy.">Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy.</a> Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9 (2), (2016).</li><li>Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Frett&#233;, X., Baatrup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+polyacetylenes,+falcarinol+and+falcarindiol,+isolated+from+carrots+prevents+the+formation+of+neoplastic+lesions+in+the+colon+of+azoxymethane-induced+rats.">Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats.</a> Food &amp; Function. 8, 964-974 (2017).</li><li>Hervella, P., Parra, E., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+and+retention+of+chelated-copper+inside+hydrophobic+nanoparticles:+Liquid+cored+nanoparticles+show+better+retention+than+a+solid+core+formulation.">Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).</li><li>Hervella, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chelation,+formulation,+encapsulation,+retention,+and+in+vivo+biodistribution+of+hydrophobic+nanoparticles+labelled+with+57Co-porphyrin:+Octyl+Amine+ensures+stable+chelation+of+cobalt+in+Liquid+Nanoparticles+that+accumulate+in+tumors.">Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors.</a> Journal of Controlled Release. , (2018).</li><li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing.">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li><li>Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -. P., Cabane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoprecipitation+of+Polymethylmethacrylate+by+Solvent+Shifting:1+Boundaries.">Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries.</a> Langmuir. 25 (4), 1970-1979 (2009).</li><li>Karnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Controlled+Synthesis+of+Polymeric+Nanoparticles.">Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles.</a> Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).</li><li>Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+for+drug+delivery:+The+need+for+precision+in+reporting+particle+size+parameters.">Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69 (1), 1-9 (2018).</li><li>Christensen, L. P., Brandt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+polyacetylenes+in+food+plants+of+the+Apiaceae+family:+Occurrence,+bioactivity+and+analysis.">Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41 (3), 683-693 (2016).</li><li>Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+Effects+of+Feeding+with+Carrots+or+(-)+-Falcarinol+on+Development+of+Azoxymethane-Induced+Preneoplastic+Lesions+in+the+Rat+Colon.">Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).</li><li>Jin, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+natural+compound+falcarindiol+promotes+cancer+cell+death+by+inducing+endoplasmic+reticulum+stress.">The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress.</a> CellDeath &amp; Disease. 3, 1-9 (2012).</li><li>Walke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physico-Chemical+Parameters+of+Nanoparticles+that+Govern+Prodrug+Design+and+Application+in+Anticancer+Nanomedicine+in+Physics,+Chemistry,+Pharmacy.">Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy.</a> University of Southern Denmark (SDU). , (2018).</li><li>Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-Coated+Stealth+Nanoparticles+of+Novel+Hydrophobic+Prodrug,+Niclosamide+Stearate,+as+Cancer+Therapeutic:+Formulation+and+Physico-Chemical+Characterization+of+Nanoparticles.">Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles.</a> 6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress. , (2017).</li></ol>

Ett detaljerat protokoll för fabricera lipid-belagd nanopartiklar för drogen leverans med enkelt, snabbt, reproducerbar och skalbar snabb injektion metod för lösningsmedel skiftande var följt27,28 och presenteras i detta papper, som tillämpas på falcarindiol. Genom att kontrollera hastigheten på injektion av den organiska fasen i vattenfasen och genom beläggning lipider på lämpliga koncentrationer för att belägga falcarindiol kärnan, kunde partikel ...

Lipid-belagd nanopartiklar ser ett ökat intresse när det gäller deras funktion som drog leveranssystem för cancer behandling1. Cancer har en förändrad lipid-metabola omplanering2 och ett ökat behov av kolesterol föröka3. De överuttrycka LDLs1 och ta i mer LDLs än normala celler, i den utsträckning som en cancer patients LDL räkna kan även gå ner4. LDL-upptag främjar aggressiva fenotyper5 resulterar i spridning och invasion i bröst cancer6. Ett överflöd av LDL-receptorer (LDLRs) är en prognostisk indikator av metastaserande potentiella7. Inspirerad av LDL och dess upptag av cancerceller, en ny strategi har kallats: göra läkemedlet se ut cancer's mat8. Således dessa nya nanopartiklar drogen leverans mönster8,9,10 har inspirerats av core - och lipid-stabiliserad utformningen av naturliga LDLs11 som en mekanism för att leverera cytostatika cancerceller. Denna passiva inriktning leverans systemet stöder encapsulating av, särskilt, hydrofoba droger, som vanligen ges i oral dosering formulär men ger endast en liten mängd av droger i blodet, så begränsa deras förväntade effekt12. Som med stealth liposomer13en polyetylenglykol (PEG) beläggning hjälper till att reducera någon immunologisk reaktion och utökar cirkulationen i blodomloppet för optimal tumör upptag genom den påstådda förbättrad genomträngning och retention (EPR) effekt 14 , 15. i tillägg till, i vissa instanser, instabilitet i cirkulationen och oönskade distribution i system16, vissa hinder kvarstår dock olösta, till exempel hur och i vilken utsträckning sådana nanopartiklar tas av celler och vad är sitt intracellulära öde. Det är här att denna uppsats behandlar nanopartiklar upptaget av ett visst hydrofoba anticancer läkemedel falcarindiol, använder confocal och epifluorescence imaging tekniker.
Syftet med studien är att fabricera lipid-belagd nanopartiklar av falcarindiol och studera deras intracellulära upptaget i hMSCs. Därmed skulle kunna stabilisera sin administration, att övervinna de utmaningar som förknippas med leverans och förbättrar biotillgängligheten. Således att bedöma ett nytt leveranssystem för detta anticancer läkemedel. Tidigare har falcarindiol varit administreras oralt via en hög koncentration renat falcarindiol som en mat tillägg17. Dock finns det behov av ett mer strukturerat sätt att leverera denna lovande läkemedel. Därför utformades falcarindiol nanopartiklar, med en fosfolipid och kolesterol encapsulating enskiktslager med renat drogen som utgör kärnan av partikeln. Metoden snabb injektion av lösningsmedel växling, som nyligen utvecklats av Needham et al. 8, används i denna studie att kapsla in den polyacetylen falcarindiol.
Metoden har tidigare använts för tillverkning av lipid nanopartiklar att kapsla in diagnostisk avbildning agenter18,19, samt testa molekyler (triolein)27 och droger (orlistat, niclosamide stearat)8 ,27,28. Det är en relativt enkel teknik när de utförs med rätt molekylerna. Nanosized partiklar, på gränsen till deras kritiska kärnbildning (~ 20 nm i diameter), bildar av mycket olösligt hydrofoba koncentrationsfördelningen upplöst i polära lösningsmedel. Lösningsmedel utbyte sker genom en snabb injektion av organiska lösningen i ett överskott av antisolvent (vanligtvis en vattenfas i en 1:9 ekologisk: vattenlösning volymförhållandet)20,21.
Nanopartiklarna kompositionella utformning ger upphov till flera fördelar. DSPC:Chol komponenter ger en mycket stram, nästan ogenomtränglig, biokompatibla och biologiskt nedbrytbara enskiktslager. PEG ger en koalisera stabiliserande gränssnitt som fungerar som en sköld från opsonization av immunsystemet, sakta någon upptag av retikuloendoteliala systemet (lever och mjälte) och skydda mot mononukleära fagocytsystemet systemet, hindrar deras kvarhållande och nedbrytning av immunsystemet, och därmed öka sin omsättning halvtid i blod22. Detta tillåter partiklarna att cirkulera tills de extravasate på sjuka platser, såsom tumörer, där det vaskulära systemet är läckande, möjliggör EPR-effekt för att ge upphov till passiv ackumulering av partiklarna. Dessutom gör lipid pälsen att man kan ha bättre kontroll över de nanopartiklar storlek av kinetiskt svällning kärnan dess kritiska nucleus dimension27,28. Lipider framkalla olika ytegenskaper (inklusive peptid inriktning, som ännu inte var tillgänglig för detta projekt), en ren drog kärna och en låg polydispertion22,27,28. Den metod som används för partikel storlek analys är DLS, en teknik som tillåter forskare att mäta storleken på ett stort antal partiklar samtidigt. Dock kan denna metod bias mätningarna till större storlekar, om nanopartiklarna inte monodispersed23. Problemet bedöms med lipid pälsen samt. Mer detaljer om dessa grundläggande mönster och kvantifiering av alla egenskaper ges i andra publikationer27,28.
Läkemedlet inkapslade i nanopartiklarna är falcarindiol, en kosten polyacetylen som finns i växter från familjen flockblommiga växter. Det är en sekundär metabolit från alifatiska C17polyacetylenes typ som har befunnits Visa hälsofrämjande effekter, inklusive anti-inflammatorisk aktivitet, antibakteriella effekter och cytotoxicitet mot ett brett spektrum av cancer cellinjer. Dess höga reaktivitet är relaterad till dess förmåga att interagera med olika biomolekyler, agerar som en mycket reaktiv alkylerare mot mercapto och amino grupper24. Falcarindiol har tidigare visats minska antalet av neoplastiska lesioner i kolon17,25, även om de biologiska mekanismerna är fortfarande okänd. Det är dock tanken att det interagerar med biomolekyler som NF-κB, COX1, COX-2, och cytokiner, hämma deras tumör progression och cell spridning processer, leder till arresterar cellcykeln, endoplasmatiska nätverket (ER) stress och apoptos 17,26 i cancerceller. Falcarindiol används i denna studie som ett exempel anticancer läkemedel på grund av dess anticancer potential och mekanism studeras för närvarande, och eftersom det visar lovande anticancer effekter. Cellulära upptaget av nanopartiklarna är testad i hMSCs och avbildas med hjälp av epifluorescence och konfokalmikroskopi. Denna celltyp valdes på grund av dess storlek, vilket gör dem idealiska för mikroskopi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:965px;" width="966">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm)</td>
			<td style="width:384px;">Microlab Aarhus A/S</td>
			<td style="width:160px;">ML 33154LP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">6 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td style="width:160px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Absolute Ethanol</td>
			<td>EMD Millipore (VWR)</td>
			<td>EM8.18760.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Chloroform</td>
			<td>Rathburn Chemicals Ltd.</td>
			<td>RH1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:384px;">Zeiss LSM510</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Cover Slips thickness #1.5</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co</td>
			<td>117650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Desiccator</td>
			<td style="width:384px;">Self-build</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DiI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:160px;">D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">DLS</td>
			<td style="width:384px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:160px;">DelsaMAXpro 3167-DMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DSPC (Chloroform stock)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850365C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DSPE PEG 2000 (Chloroform stock)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>880120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">eVol XR</td>
			<td>SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.</td>
			<td>2910200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:160px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fluorescence Miccroscope</td>
			<td style="width:384px;">Olymous IX81</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td>With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Incubator</td>
			<td style="width:384px;">Panasonic&#160;</td>
			<td style="width:160px;">MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Magnetic flea</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>15 x 4.5 mm</td>
			<td>Cylindrical shape with PTFE coating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td style="width:160px;">RT-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:160px;">32561-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:255px;">PBS tablets for cell culture</td>
			<td style="width:384px;">VWR Chemicals</td>
			<td>97062-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Pen/strep</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>97063-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Rotary Evaporator</td>
			<td>Rotavapor, B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td style="width:160px;">R-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sample concentrator&#160;</td>
			<td>Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC</td>
			<td style="width:160px;">SBHCONC/1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uptake of new lipid-coated nanoparticles containing falcarindiol by human mesenchymal stem cells

Nanopartiklar är i fokus för ett ökat intresse för drogen leveranssystem för cancerbehandling. Lipid-belagd nanopartiklar är inspirerade i struktur och storlek av low-density lipoproteins (LDLs) eftersom cancerceller har ett ökat behov av kolesterol att föröka sig, och detta har utnyttjats som en mekanism för att leverera cytostatika för cancer celler. Dessutom beroende på drogen kemi, kan kapsla in drogen vara fördelaktigt att undvika nedbrytning av läkemedlet under cirkulationen invivo. Därför i denna studie, är denna design används för att tillverka lipid-belagd nanopartiklar av den anticancer läkemedel falcarindiol, som tillhandahåller en potentiella nya leveranssystem för falcarindiol för att stabilisera dess kemiska struktur mot nedbrytning och förbättra dess upptag av tumörer. Falcarindiol nanopartiklar, utformades med en fosfolipid och kolesterol enskiktslager encapsulating renat drog kärnan av partikeln. Lipid enskiktslager beläggningen består av 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC) kolesterol (Chol) och 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) tillsammans med fluorescerande etiketten DiI (molar förhållandet mellan 43:50:5:2). Nanopartiklarna är tillverkade med hjälp av metoden snabb injektion, vilket är en snabb och enkel teknik att fällningen nanopartiklar av bra lösningsmedel för anti lösningsmedel utbyte. Den består av en snabb injektion av etanol lösning som innehåller nanopartiklar beståndsdelar till en vattenfas. Storleken på de fluorescerande nanopartiklarna mäts med dynamisk ljusspridning (DLS) vid 74,1 ± 6,7 nm. Upptaget av nanopartiklarna är testad i humana mesenkymala stamceller (hMSCs) och avbildas med hjälp av fluorescens och konfokalmikroskopi. Upptaget av nanopartiklarna observeras i hMSCs, vilket tyder på en potential för ett sådant stabila drug delivery system för falcarindiol.

Två olika typer av nanopartiklar var fabricerade, nämligen ren falcarindiol nanopartiklar och lipid-belagd falcarindiol nanopartiklar. Olika koncentrationer av lipider och kolesterol testades. I tabell 1visas obestruket nanopartiklar bildas i vatten och mätt i PBS hade en diameter av 71 ± 20,3 nm med en polydispertion index (PDI) på 0.571. Dessa parametrar mättes på en DLS analyzer. De lipid-belagd nanopartiklarna av falcarindiol används i experiment, och så äve...

Watch this Scientific Journal Video about Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Upptag av nya Lipid-belagd nanopartiklar som innehåller Falcarindiol av humana mesenkymala stamceller

Denna artikel beskriver inkapsling av falcarindiol i lipid-belagd 74 nm nanopartiklar. Cellulära upptaget av nanopartiklarna av mänskliga stamceller i lipid droppar övervakas av lysrör och confocal imaging. Nanopartiklar är tillverkade av metoden snabb injektion av lösningsmedel skiftande och deras storlek mäts med dynamisk ljusspridning tekniken.

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Tillverkning av lipidbelagda nanopartiklar med den snabba injektionsmetoden ger ett stabilt drug delivery system för cancerbehandling. Denna teknik är en enkel, snabb, skalbar och reproducerbar teknik för nanopartikel tillverkning som kapslar in hydrofoba läkemedel. Denna teknik är tillämplig för fabricering av diagnostiska och terapeutiska nanopartiklar från hydrfoba material som effektivt kan användas vid flera sjukdomstillstånd.Denna tillverkningsteknik, tillsammans med DLS, kan användas för att studera kärnbildning och tillväxt av hydrofoba material, såsom lipider, proteiner, och polymerer. Att känna till de fysikaliska kemiska egenskaperna hos ditt läkemedelsämne är kritiskt innan du fabricerar nanopartiklarna. Också, se till att använda rätt koncentrationer av beläggning lipider.Visuell demonstration av denna metod är avgörande för att visa enkelheten i tillverkningstekniken och för att visa en framgångsrik leverans av läkemedlet som nanopartiklar till cellerna. Försiktighet måste vidtas vid arbete med kloroform och formaldehyd, och arbeta under en rök huva krävs. Till att börja, dispensera 2,4 milliliter av 250 mikromolar falcarindiol stamlösning upplöst i 70%etanol i en scintillationsflaska.Med hjälp av en provkoncentrator avdunsta vätskefraktionen i cirka fyra timmar för att få torr falcarindiol. Med hjälp av provkoncentratorn levererar du gas över provet i rumstemperatur för att koncentrera provet. När torkat, tillsätt komponenterna som visas här till scintillationsflaskan i en fume huva, se till att rengöra sprutan med kloroform efter tillsats av varje komponent för att undvika korskontaminering.Stäng sedan omedelbart injektionsflaskan som innehåller lipiderna så att lösningsmedlet inte avdunstar och därigenom modifierar koncentrationen. Linda injektionsflaskan med aluminiumfolie för att skydda DiI från ljus och lämna provet över natten i exsiccatorn för att avdunsta kloroformen. Nästa dag, lös det utdekad provet i absolut etanol för att göra en slutlig volym på 1,2 milliliter.Denna lösning representerar den organiska fasen. Ta en 12 milliliter glasflaska och fyll den med nio milliliter renat vatten. Tillsätt sedan en magnetisk loppa i injektionsflaskan som innehåller nio milliliter vatten.Placera injektionsflaskan på en magnetisk omrörare och rör om i 500 varv/min. Fäst därefter en en milliliter glasspruta på dispenseringssystemet och dra långsamt kloroform in och ut ur glassprutan minst 10 gånger. Dosera ut kloroformen i dess avfallsuppsamlare varje gång.Rengöring av sprutan med kloroform hjälper till att undvika all kontaminering. Nu prime sprutan med etanol. Priming ersätter det gamla lösningsmedlet samt tar bort eventuella luftbubblor.Använd sprutan, aspirera en milliliter av den organiska fasen, och sätt in sprutan i glasflaskan fram till mitten av nio milliliter vattenmärket. Bibehåll den stadigt i mitten av injektionsflaskan, och injicera lösningen med 833 mikroliter per sekund genom att trycka på dispenseringsknappen på dispenseringssystemet. Detta genererar 10 mikroliter av 50 mikromolar lipidbelagda nanopartiklar av falcarindiol i 10%etanol.Denna injektionshastighet har visat sig uppnå finaste nanopartiklar med smal partikelstorleksfördelning. Medan du injicerar är det viktigt att se till att nålen sätts in i mitten, stadig och rak. Omedelbart efter injektionen, ta ut injektionsflaskan ur omröraren och för över provet till en 50 milliliter rund bottenkolv.Attackera kolven mot rotationsförångaren, och avdunsta en milliliter av det organiska lösningsmedlet vid rumstemperatur. Var försiktig för att undvika överskott bubbla bildning. Överför nanopartikelupphängningen från kolven till ytterligare en glasflaska av 12 milliliter glas.Se till att volymen är nio milliliter, och sedan dela provet i två 12 milliliter glasflaskor. Tillsätt sedan 0,5 milliliter ultrarent vatten i en av injektionsflaskan och 0,5 milliliter 10X fosfatbuffrad saltlösning i den andra injektionsflaskan. Slå på instrumentet för digital ljusspridning, och ställ in önskad temperatur på 20 grader Celsius tills den stabiliseras.Ställ sedan in instrumentparametrarna enligt bilden här. Fyll plast cuvette med en milliliter nanopartikel suspension, och starta mätningen. Rapportera den uppmätta storleken beroende på vilket lösningsmedel som användes.Frö cirka 50, 000 celler på sterila 1,5 täckslilar placerade i sex-brunnsplatta för att erhålla en celltäthet på cirka 30%Lägg sedan till odlingsmedium för att ha en slutlig volym på tre milliliter i varje brunn. Inkubera cellerna i 24 timmar under standardkulturförhållanden. Nästa dag, tillsätt tre mikroliter av nanopartikellösningen för en slutlig falcarindiolkoncentration av fem mikromolar.Sedan tillbaka cellerna till inkubatorn i 24 timmar. Efter 24 timmars behandling, tvätta cellerna två gånger med PBS, och sedan fixa dem i 4%formaldehyd i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter fixering, permeabilize cellerna med 0,1%Triton X-100 i 30 minuter.Tvätta dem sedan två gånger med PBS, och fläcka dem med 250 mikroliter av 300 nanomolar DAPI i fem minuter, skyddad från ljus. Placera luckan på en bild med hjälp av en droppe PBS. Vänd dig till en 150x subjektiv, och överföra bilden till scenen i ett brett fält fluorescens mikroskop utrustad med en elektron multiplicerad CCD kamera.Bildceller med hjälp av GFP-LP-kanalen. Dessutom, kontrollera upptaget av nanopartiklar i cellerna genom att ta confocal mikroskopi bilder med hjälp av en 63x olja mål med en numerisk bländare på 1,4. Bild DiI med hjälp av en argon laser på 514 nanometer och DAPI med hjälp av en två-foton laser på 780 nanometer.Obestrukna nanopartiklar av falcarindiol bildas i vatten och mätt i PBS visade hög polydispersity, med PD index på 0,571. Detta värde anger bred och icke-uniform fördelning av partikelstorlekar. I motsats till detta lipidbelagda nanopartiklar av falcarindiol fabricerade i denna video var av 74,1 nanometer med en polydispersity index på 0,182, anges en relativt monodisperse och enhetlig fördelning av partikel storlekar.Som en första observation av nanopartiklarna inuti cellerna förvärvades epifluorescensmikroskopibilder efter 24 timmars behandling. Nanopartiklarna visualiserades som vita, ljusa prickar, och det kunde vara en hypotes om att nanopartiklar var belägna inuti cellerna som omger kärnan. För att kontrollera att falcarindiol nanopartiklar hade kommit in i cellerna, utfördes confocal mikroskopi på cellerna också.Ett stort antal nanopartiklar visas här, utspridda i cytoplasman i varje cell. Dessa resultat visar att nanopartiklar fungerar som ett stabilt drug delivery system för falcarindiol. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att injicera lösningen vid rätt injektion hastighet, hålla sådd stadig, i mitten, för att säkerställa korrekt blandning.Detta förfarande kan användas för alla hydrofoba läkemedel för att formulera terapeutiska nanopartiklar eller för bildbehandlingsmedel att formulera diagnostiska nanopartiklar som kan användas i olika sjukdomstillstånd, såsom cancer. Denna teknik möjliggjorde mer forskning som skall genomföras på den mekanism genom vilken nanopartiklarna tas upp av celler, liksom dess levande cell avbildning och på att studera anticancer effekten av läkemedlet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Användning av mänskliga perivaskulär stamceller för benuppbyggnad

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Alginat mikrokapselkomposition som en 3D-plattform för förökning och differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESC) till olika linjer

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utveckling, expansion och<em&gt; In vivo</em&gt; Övervakning av humana NK celler från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmerings stamceller i terapeutiska Angiogenes använda biologiskt nedbrytbara polymera nanopartiklar

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Beställa enskilda celler och Single Embryon i 3D Förlossning: En ny enhet för hög halt Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimera Utmätning av Human mesenkymala stamceller på Poly (ε-kaprolakton) Electrospun Garner

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Korrelat Ljus- och elektronmikroskopi Använda Quantum Dot Nanopartiklar

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av mesenkymala stamceller från mänskliga alveolära periostet och effekter av D-Vitamin på osteogent aktivitet av periostet-derived celler

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalbar Generation av Mogna Cerebellar Organoids från Mänskliga Pluripotenta stamceller och karakterisering av Immunfärgning

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...