Name: confocal imaging of double-stranded rna and pattern recognition receptors in negative-sense rna virus infection
Uploaded: 2019-01-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection at JoVE.com

Nous tenons à remercier les installations d’imagerie de base UTMB et Maxim Ivannikov pour microscope.
Ce travail a été soutenu par le Public Health Service accorder RO1AI093445 et RO1AI129198 attribué à SP, UTMB engagement fonds P84373 à CH et T32 AI007526 à EM.

1. préparation des cellules A549 et infection JUNV
<ol><li>Graine 2 x 105 cellules épithéliales pulmonaires humaines A549 sur poly-D-lysine (PDL) enduit lamelles de verre en plaques à puits 12 à 24 heures avant l’infection.</li>
	<li>Préparer des aliquots de 150 mL de JUNV13 à une multiplication d’infection (MOI) de 1,0 plaque formant unité par cellule dilué dans les médias de médium (DMEM) de l’aigle de la modification de Dulbecco additionnés de 2 % sérum fœtal (S...

<ol>
	<li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+RNA+viruses:+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion.">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li><li>Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 6 (2006).</li><li>Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+direct+interaction+of+MDA5+and+the+dsRNA+replicative+intermediate+form+of+positive+strand+RNA+viruses.">Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses.</a> Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).</li><li>Onomoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+an+antiviral+stress+granule+containing+RIG-I+and+PKR+in+viral+detection+and+innate+immunity.">Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity.</a> PLoS One. 7, e43031 (2012).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+detected+by+immunofluorescence+analysis+in+RNA+and+DNA+virus+infections,+including+those+by+negative-sense+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+double-stranded+RNA+colocalizing+with+pattern+recognition+receptors+in+arenavirus+infected+cells.">Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells.</a> Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).</li><li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenavirdae:+The+viruses+and+their+replication.">Arenavirdae: The viruses and their replication.</a> Fields Virology. 2, (2006).</li><li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+interferon+in+Argentine+hemorrhagic+fever.">Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever.</a> The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).</li><li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+endogenous+interferon+and+the+clinical+evolution+of+patients+with+Argentine+hemorrhagic+fever.">Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever.</a> Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pathogenic+new+world+and+old+world+human+arenaviruses+induce+distinct+interferon+response+in+human+cells.">Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells.</a> Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junin+virus+infection+activates+the+type+I+interferon+pathway+in+a+RIG-I-dependent+manner.">Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).</li><li>Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pathogenic+new+world+arenavirus+infection+activates+the+pattern+recognition+receptor+protein+kinase+R+without+attenuating+virus+replication+in+human+cells.">Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells.</a> Journal of Virology. 91, 20 (2017).</li><li>Emonet, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+from+cloned+cDNAs+and+in+vivo+characterization+of+recombinant+pathogenic+Romero+and+live-attenuated+Candid#1+strains+of+Junin+virus,+the+causative+agent+of+Argentine+hemorrhagic+fever+disease.">Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease.</a> Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).</li><li>Child, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+the+protein+kinase+R+pathway+in+human+cells+by+Rhesus+Cytomegalovirus.">Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus.</a> Journal of Virology. 92, 6 (2018).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li></ol>

Pour les virus ARN à polarité positive et virus dsDNA, dsRNA est facilement détectable avec l’anticorps d’anti-dsRNA J2 largement utilisé. Toutefois, les virus à ARN sens négatif sont censés produire dsRNA faible ou au-dessous du niveau de détection en utilisant le même anticorps2. Ainsi, beaucoup d’aspects de l’interaction ARN et PRR virale est en grande partie floue pour les virus à ARN sens négatif. Nous avons tenté de tache de dsRNA arénavirus infection à l’aide de l’...

L’étape initiale de l’induction de la réponse immune innée est reconnaissance hôte de double-brin (ds) RNA par les récepteurs de reconnaissance de modèle (SDRP) tels que l’acide rétinoïque (RIG-je) comme des récepteurs (SRRL) RIG-I et mélanome associée à la différenciation protéine obligatoire 5 (MDA-5)1. Pour les virus ARN de polarité positive, dsRNA habituellement facilement repérables à l’aide de la J2 ou K1 anti-dsRNA anticorps monoclonaux (ACM)2. Interaction entre dsRNA et rer dans les virus à ARN brin positif, comme les picornavirus, a été caractérisée à l’aide de la microscopie confocale3. Toutefois, pour les virus à ARN sens négatif, visualisation et la caractérisation de l’interaction PRR et dsRNA a été entravée par l’absence d’anticorps sensibles d’Arndb. Hybridation in situ fluorescente (FISH) de RNA a été appliquée à la visualisation de viral RNA et PRRs4. Néanmoins, la méthodologie de poisson nécessite la connaissance de l’objectif de la séquence d’ARN et ne peut-être pas être compatible avec PRR conjointement la coloration. Récemment, le 5 de 9 Mab, qui a été initialement développé pour le diagnostic de l’infection à entérovirus-pan, s’est avéré être plus sensible que le Mab J2 et peut facilement détecter les Arndb en sens négatif infection de virus à ARN5,6. Ainsi, Mab 9 5 est un outil utile pour étudier la réplication virale et l’interaction entre le PRR et l’ARN viral pour les virus à ARN de polarité négative et novateur.
Arenavirus sont une famille de virus à ARN monocaténaire, polarité négative, qui comprennent plusieurs pathogènes humains, tels que les virus de Lassa (LASV), le virus Junin (JUNV) et le virus de Machupo (MACV), qui provoquent des maladies de fièvre hémorragique sévère chez les humains,7. Les données cliniques de cas graves et mortels de Argentine fièvre hémorragique causée par le nouveau monde arénavirus JUNV présentent des niveaux anormalement élevés de sérum IFN-α8,9. Nous avons montré que le pathogène arénavirus NW (JUNV et MACV), mais pas les pathogènes du vieux monde arénavirus, LASV, induisent un type j’ai réponse interféron (IFN) dans les cellules dendritiques humaines macrophages dérivés de monocytes,10. En outre, RIG-I est un des capteurs médiant de type I réponse IFN dans les cellules infectées par le JUNV11. Nous avons également constaté que le R (PKR) récepteur kinase, qui est traditionnellement connu pour la reconnaissance de l’Arndb, est activé en pathogènes NW arénavirus infection12. Pour mieux comprendre le mécanisme de réponse IFN spécifiques du virus pendant l’infection arénavirus, visait à élaborer un protocole pour visualiser l’interaction entre l’Arndb virale et le SDRP cytoplasmique.
Expériences d’infection pathogène JUNV, MACV et LASV doivent être réalisées dans la biosécurité de niveau 4 installations (BSL-4). Ainsi, en plus du niveau présumée faible d’Arndb formé en infection arénavirus, satisfaisant aux prescriptions de prévention des risques biotechnologiques est un autre défi technique lors de l’exécution des études d’imagerie pour ces virus hautement pathogènes. En utilisant les 5 9 anticorps et la souche du vaccin Candid1 # de JUNV, un protocole basé sur la microscopie confocal est décrit dans le présent rapport, qui a été utilisé avec succès pour visualiser l’Arndb, protéine virale et PRR simultanément dans les cellules infectées par arénavirus dans Laboratoires BSL2. Le protocole est également adapté pour la visualisation de la distribution intracellulaire de l’Arndb et PRR pendant l’infection pathogène arénavirus dans BSL4 installations.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>1:2,000 dilution; Lot #: 1454437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Bio</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>1:2000 dilution; Lot #: 1874804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung epithelial A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MAb anti-JUNV NP</td>
			<td>BEI</td>
			<td>NA05-AG12</td>
			<td>Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3361</td>
			<td>ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS supplemented with Ca and Mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDL Coated coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>H-12-1.5-pdl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit MAb MDA-5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab126630</td>
			<td>1:250 dilution; Lot #: GR97758-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombiant Candid#1 strain of JUNV</td>
			<td>Lab generated</td>
			<td>Lab generated</td>
			<td>As previously described in reference 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-376845</td>
			<td>1:1000 dilution; Lot #: AO218</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of double-stranded rna and pattern recognition receptors in negative-sense rna virus infection

Double-brin (ds) RNA est produit comme intermédiaire réplicatif pendant l’infection de virus à ARN. Reconnaissance de dsRNA de récepteurs de reconnaissance modèle hôte (SDRP) tels que l’acide rétinoïque (RIG-je) comme des récepteurs (SRRL) RIG-I et mélanome protéine associée à la différenciation 5 (MDA-5) conduit à l’induction de la réponse immunitaire innée. La formation et la distribution intracellulaire de l’Arndb dans l’infection de virus à ARN de polarité positive a été bien caractérisées par microscopie. Plusieurs virus à ARN sens négatif, y compris certains arénavirus, déclenchent la réponse immunitaire innée au cours de l’infection. Toutefois, les virus à ARN sens négatif étaient censés produire de faibles niveaux d’Arndb, qui fait obstacle à l’étude d’imagerie de la reconnaissance de la PRR d’Arndb virale. En outre, des expériences d’infection avec arénavirus hautement pathogène doivent être effectuées dans les installations de niveau de biosécurité de confinement élevé (BSL-4). L’interaction viral RNA / EREP hautement pathogène du virus ARN ignore en grande partie en raison des défis techniques supplémentaires que les chercheurs doivent faire face dans les installations de BSL-4. Récemment, un anticorps monoclonal (ACM) (clone 9 5) initialement utilisé pour la détection de pan-entérovirus s’est avéré de détecter spécifiquement dsRNA avec une sensibilité plus élevée que les anticorps d’anti-dsRNA J2 ou K1 traditionnels. Dans les présentes, en utilisant les 5 9 anticorps, les auteurs décrivent un protocole de microscopie confocale qui a été utilisé avec succès pour visualiser l’Arndb, protéine virale et PRR simultanément dans les cellules infectées par des arénavirus. Le protocole est également adapté aux études de dsRNA et distribution de PRR dans les cellules pathogènes arénavirus infectés dans BSL4 installations d’imagerie.

Ce protocole a été appliqué à l’étude de la distribution et la colocalisation entre les SRRL (RIG-I et MDA-5) et Arndb dans les cellules infectées par le JUNV. Comme le montre la Figure 1 et Figure 2, l’accumulation de dsRNA augmente au fil du temps à mesure que progresse l’infection virale. Concentré de MDA-5 (Figure 1) et RIG-I (Figure 2) signaux trouvée...

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Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

ARN bicaténaire produite lors de la réplication des virus à ARN sont reconnaissables par les récepteurs de reconnaissance de modèle pour induire une réponse immunitaire innée. Pour les virus à ARN sens négatif, l’interaction entre l’Arndb à basse altitude et PRRs reste floue. Nous avons développé une méthode de microscopie confocale afin de visualiser les arénavirus dsRNA et PRR dans des cellules individuelles.

Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

L’essai traditionnel de détection d’ARN à double brin n’est habituellement pas assez sensible pour détecter l’ARN à double brin formé dans l’infection négative-sens de virus d’ARN. Par conséquent, l’interaction entre l’ARN à double brin et les récepteurs de reconnaissance du modèle hôte est restée largement insaisissable pour ces virus. En utilisant ce protocole, nous sommes en mesure de visualiser et de caractériser l’interaction entre la protéine nucléaire virale, l’ARN à double brin et l’hôte d’un PRR à un niveau d’une seule cellule pour le virus de l’ARN à sens négatif. Il s’agit d’un test multiplexe qui permet la coloration simultanée de l’ARN double brin et deux cibles virales ou de protéines hôtes dans les cellules individuelles. Contrairement à l’analyse ARN-FISH, cette technique est indépendante de la séquence arn et généralement compatible avec la détection d’anticorps des cibles protéiques. Commencez 24 heures avant l’infection en ensemencement de 200 000 cellules A549 épithéliales pulmonaires humaines sur des couvercles en verre enduits de Poly-D-Lysine glissés dans des plaques de 12 puits et les cultivant à 37

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