Name: confocal imaging of double-stranded rna and pattern recognition receptors in negative-sense rna virus infection
Uploaded: 2019-01-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection at JoVE.com

Vorremmo ringraziare l'UTMB imaging core strutture e Maxim Ivannikov per assistenza di microscopio.
Questo lavoro è stato supportato dal servizio sanitario pubblico concedere RO1AI093445 e RO1AI129198 assegnato a SP, UTMB impegno fondo P84373 a CH e T32 AI007526 di EM.

1. preparazione di cellule A549 e JUNV infezione
<ol><li>Cellule epiteliali di seme 2 x 105 polmonari umane A549 sulla poli-D-lisina (PDL) rivestito vetrini coprioggetti in 12 pozzetti a 24 ore prima dell'infezione.</li>
	<li>Preparare aliquote di 150 mL di JUNV13 a una moltiplicazione di infezione (MOI) di 1,0 placca formando unità per cella diluito in media Medium (DMEM) dell'Aquila di Dulbecco per volta completati con 2% siero bovino fetale (FBS) e 1%, penicillina e streptomicina ...

<ol>
	<li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+RNA+viruses:+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion.">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li><li>Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 6 (2006).</li><li>Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+direct+interaction+of+MDA5+and+the+dsRNA+replicative+intermediate+form+of+positive+strand+RNA+viruses.">Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses.</a> Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).</li><li>Onomoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+an+antiviral+stress+granule+containing+RIG-I+and+PKR+in+viral+detection+and+innate+immunity.">Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity.</a> PLoS One. 7, e43031 (2012).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+detected+by+immunofluorescence+analysis+in+RNA+and+DNA+virus+infections,+including+those+by+negative-sense+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+double-stranded+RNA+colocalizing+with+pattern+recognition+receptors+in+arenavirus+infected+cells.">Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells.</a> Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).</li><li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenavirdae:+The+viruses+and+their+replication.">Arenavirdae: The viruses and their replication.</a> Fields Virology. 2, (2006).</li><li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+interferon+in+Argentine+hemorrhagic+fever.">Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever.</a> The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).</li><li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+endogenous+interferon+and+the+clinical+evolution+of+patients+with+Argentine+hemorrhagic+fever.">Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever.</a> Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pathogenic+new+world+and+old+world+human+arenaviruses+induce+distinct+interferon+response+in+human+cells.">Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells.</a> Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junin+virus+infection+activates+the+type+I+interferon+pathway+in+a+RIG-I-dependent+manner.">Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).</li><li>Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pathogenic+new+world+arenavirus+infection+activates+the+pattern+recognition+receptor+protein+kinase+R+without+attenuating+virus+replication+in+human+cells.">Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells.</a> Journal of Virology. 91, 20 (2017).</li><li>Emonet, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+from+cloned+cDNAs+and+in+vivo+characterization+of+recombinant+pathogenic+Romero+and+live-attenuated+Candid#1+strains+of+Junin+virus,+the+causative+agent+of+Argentine+hemorrhagic+fever+disease.">Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease.</a> Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).</li><li>Child, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+the+protein+kinase+R+pathway+in+human+cells+by+Rhesus+Cytomegalovirus.">Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus.</a> Journal of Virology. 92, 6 (2018).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li></ol>

Per senso positivo RNA virus e virus dsDNA, dsRNA è facilmente rilevato con l'anticorpo di anti-dsRNA J2 ampiamente utilizzato. Tuttavia, virus del RNA negativo-senso si ritiene che producono il dsRNA ad un livello basso o sotto il livello di rilevamento utilizzando lo stesso anticorpo2. Così, molti aspetti di interazione virale RNA e PRR sono in gran parte poco chiari per virus del RNA negativo-senso. Abbiamo tentato di macchiare per dsRNA in arenavirus infezione usando l'anticorpo J2 ma i segn...

Il primo passo dell'induzione della risposta immunitaria innata è riconoscimento di host di double-stranded RNA (ds) dai recettori di riconoscimento di pattern (PRRs) come l'acido retinoico (RIG-io) come recettori (RLRs) RIG-io e melanoma differenziazione-associato proteina obbligatoria 5 (MDA-5)1. Per i virus del RNA di senso positivo, dsRNA può solitamente essere facilmente individuata utilizzando anticorpi monoclonali (Mab) anti-dsRNA J2 o K12. Interazione tra dsRNA e PRRs in positivo-incagliano i virus del RNA, come picornavirus, è stata caratterizzata mediante microscopia confocale3. Tuttavia, per il negativo-senso virus a RNA, visualizzazione e caratterizzazione dell'interazione PRR e dsRNA è stato ostacolato dalla mancanza di anticorpi sensibili a dsRNA. Ibridazione in situ fluorescente (FISH) di RNA è stato applicato per la visualizzazione di virale RNA e PRRs4. Tuttavia, la metodologia di pesce richiede la conoscenza del target sequenza di RNA e potrebbe non essere compatibile con la PRR co-macchiatura. Recentemente, il 5 9 Mab, che è stato originariamente sviluppato per la diagnosi di pan-enterovirus, infezione, è stato trovato per essere più sensibile il Mab J2 e può facilmente rilevare dsRNA in negativo-senso RNA virus infezione5,6. Così, Mab 9 5 è un romanzo e strumento utile per studiare la replicazione virale e l'interazione tra PRR e RNA virale per-senso RNA virus.
Arenavirus sono una famiglia di virus del RNA singolo-incagliato, negativo-senso, che comprendono diversi patogeni umani, come virus di Lassa (LASV), Junín virus (JUNV) e virus di Machupo (MACV), che causano malattie febbre emorragica severa in esseri umani7. Dati clinici da mortali e gravi casi di argentino febbre emorragica causata dal nuovo mondo arenavirus JUNV esibiscono livelli insolitamente elevati di siero IFN-α8,9. Abbiamo dimostrato che il patogeno arenavirus NW (JUNV e MACV), ma non i patogeni vecchio mondo arenavirus, LASV, indurre un tipo ho risposta di interferone (IFN) in cellule dentritiche monocito-derivate umane10. Inoltre, RIG-I è uno dei sensori di mediare la reazione di tipo I IFN in cellule infettate JUNV11. Abbiamo anche trovato che il recettore di R (PKR) della chinasi di proteina, che è tradizionalmente conosciuto per il riconoscimento di dsRNA, è attivato in patogeni NW arenavirus infezione12. Per capire meglio il meccanismo di risposta IFN virus-specifica durante l'infezione arenavirus, abbiamo mirato a sviluppare un protocollo per visualizzare l'interazione tra dsRNA virale e la PRRs citoplasmico.
Esperimenti di infezione con patogeni JUNV, MACV e LASV devono essere eseguite in biosicurezza 4 (BSL-4) strutture di livello. Così, oltre al livello presumibilmente basso di dsRNA formata nell'infezione arenavirus, soddisfare i requisiti di biosicurezza è un'altra sfida tecnica durante l'esecuzione di studi di formazione immagine per questi virus ad alta patogenicità. Utilizzando il 5 9 anticorpo e il ceppo vaccinale Candid1 # di JUNV, un protocollo basato su microscopia confocale è descritto in questo rapporto, che è stato usato con successo per visualizzare dsRNA, proteina virale e PRR contemporaneamente in cellule infettate da arenavirus in Laboratori BSL2. Il protocollo è anche adatto per la visualizzazione della distribuzione intracellulare di dsRNA e PRR durante l'infezione patogena arenavirus in strutture BSL4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>1:2,000 dilution; Lot #: 1454437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Bio</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>1:2000 dilution; Lot #: 1874804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung epithelial A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MAb anti-JUNV NP</td>
			<td>BEI</td>
			<td>NA05-AG12</td>
			<td>Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3361</td>
			<td>ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS supplemented with Ca and Mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDL Coated coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>H-12-1.5-pdl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit MAb MDA-5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab126630</td>
			<td>1:250 dilution; Lot #: GR97758-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombiant Candid#1 strain of JUNV</td>
			<td>Lab generated</td>
			<td>Lab generated</td>
			<td>As previously described in reference 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-376845</td>
			<td>1:1000 dilution; Lot #: AO218</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of double-stranded rna and pattern recognition receptors in negative-sense rna virus infection

Doppia elica (ds) RNA è prodotto come un intermedio replicativo durante l'infezione da virus a RNA. Riconoscimento di dsRNA da recettori di riconoscimento di pattern host (PRRs) come l'acido retinoico (RIG-io) come recettori (RLRs) RIG- ed il melanoma differenziazione-collegata della proteina 5 (MDA-5) conduce all'induzione della risposta immunitaria innata. La formazione e la distribuzione intracellulare di dsRNA in senso positivo l'infezione del virus del RNA è stata ben caratterizzata da microscopia. Molti virus del RNA negativo-senso, tra cui alcuni arenavirus, innescare la risposta immunitaria innata durante l'infezione. Tuttavia, virus del RNA negativo-senso sono stati pensati per produrre bassi livelli di dsRNA, che ostacola il studio di imaging del riconoscimento PRR di dsRNA virale. Inoltre, esperimenti di infezione con patogenicità arenavirus devono essere eseguiti in strutture di contenimento elevato biosicurezza livello (BSL-4). L'interazione tra RNA virale e PRRs per virus altamente patogeno del RNA è in gran parte sconosciuto a causa di ulteriori sfide tecniche che i ricercatori devono affrontare nelle strutture BSL-4. Recentemente, un anticorpo monoclonale (Mab) (clone 5 9) originariamente utilizzato per il rilevamento di pan-enterovirus è stato trovato per rilevare in modo specifico il dsRNA con una sensibilità maggiore rispetto gli anticorpi di anti-dsRNA J2 o K1 tradizionale. Nel presente documento, utilizzando il 5 9 anticorpo, descriviamo un protocollo di microscopia confocale che è stato usato con successo per visualizzare dsRNA, proteina virale e PRR contemporaneamente in singole cellule infettate da arenavirus. Il protocollo è anche adatto per studi di dsRNA e distribuzione PRR in cellule patogene arenavirus infettati in BSL4 strutture di formazione immagine.

Questo protocollo è stato applicato per studiare la distribuzione e la colocalizzazione tra il RLRs (RIG-I e MDA-5) e dsRNA in cellule infettate da JUNV. Come illustrato nella Figura 1 e Figura 2, l'accumulo di dsRNA aumenta nel tempo come progredisce l'infezione virale. Concentrato di MDA-5 (Figura 1) e RIG-I (Figura 2) segnali sono stati trovati colocalized con le str...

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Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

RNA double-stranded prodotto durante la replicazione del virus RNA possa essere riconosciuto dai recettori di riconoscimento di pattern per indurre una risposta immunitaria innata. Per i virus del RNA negativo-senso, l'interazione tra il basso livello dsRNA e PRRs rimane poco chiaro. Abbiamo sviluppato un metodo di microscopia confocale per visualizzare arenavirus dsRNA e PRR in singole celle.

Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Il tradizionale saggio di rilevamento dell'RNA a doppio filamento di solito non è abbastanza sensibile da rilevare l'RNA a doppio filamento formato nell'infezione da virus dell'RNA a senso negativo. Pertanto l'interazione tra RNA a doppio filamento e recettori del riconoscimento del modello ospite è rimasta in gran parte sfuggente per questi virus. Utilizzando questo protocollo siamo in grado di visualizzare e caratterizzare l'interazione tra proteina nucleare virale, RNA a doppio filamento e ospitare un PRR a livello a singola cellula per il virus dell'RNA a senso negativo. Questo è un saggio multiplex che consente la colorazione simultanea dell'RNA a doppio filamento e di due bersagli proteici virali o ospiti nelle singole cellule. A differenza del saggio RNA-FISH questa tecnica è indipendente dalla sequenza di RNA e di solito compatibile con il rilevamento di anticorpi di bersagli proteici. Inizia 24 ore prima dell'infezione seminando 200.000 cellule epiteliali polmonari umane A549 su coperchi di vetro rivestito in poli-D-lisina scivola in piastre da 12 po 'e coltivandole a 37

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