Name: confocal imaging of double-stranded rna and pattern recognition receptors in negative-sense rna virus infection
Uploaded: 2019-01-26T15:00:00
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顕微鏡支援のための UTMB イメージングの中核施設とマキシム ・ イワニコフに感謝したいと思います。
この作品は、公衆衛生サービスによって支えられた RO1AI093445 と RO1AI129198 受賞に SP、ch、UTMB コミットメント基金 P84373 と EM を T32 AI007526 を付与します。

1 作成 A549 細胞と JUNV 感染症
<ol><li>ポリ-D-リジン (PDL) に種子 2 x 10 の5ひと肺上皮 A549 細胞は、感染前に 24 時間で 12 ウェルのプレートにガラス coverslips をコーティングしました。</li>
	<li>1.0 プラーク ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 培地 2% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリンとストレプトマイシン (P/S で希釈したセルごとユニットを形成 JUNV13感染症 (MOI) の?...

<ol>
	<li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+RNA+viruses:+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion.">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li><li>Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 6 (2006).</li><li>Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+direct+interaction+of+MDA5+and+the+dsRNA+replicative+intermediate+form+of+positive+strand+RNA+viruses.">Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses.</a> Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).</li><li>Onomoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+an+antiviral+stress+granule+containing+RIG-I+and+PKR+in+viral+detection+and+innate+immunity.">Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity.</a> PLoS One. 7, e43031 (2012).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+detected+by+immunofluorescence+analysis+in+RNA+and+DNA+virus+infections,+including+those+by+negative-sense+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+double-stranded+RNA+colocalizing+with+pattern+recognition+receptors+in+arenavirus+infected+cells.">Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells.</a> Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).</li><li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenavirdae:+The+viruses+and+their+replication.">Arenavirdae: The viruses and their replication.</a> Fields Virology. 2, (2006).</li><li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+interferon+in+Argentine+hemorrhagic+fever.">Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever.</a> The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).</li><li>Levis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+endogenous+interferon+and+the+clinical+evolution+of+patients+with+Argentine+hemorrhagic+fever.">Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever.</a> Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pathogenic+new+world+and+old+world+human+arenaviruses+induce+distinct+interferon+response+in+human+cells.">Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells.</a> Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junin+virus+infection+activates+the+type+I+interferon+pathway+in+a+RIG-I-dependent+manner.">Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).</li><li>Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+pathogenic+new+world+arenavirus+infection+activates+the+pattern+recognition+receptor+protein+kinase+R+without+attenuating+virus+replication+in+human+cells.">Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells.</a> Journal of Virology. 91, 20 (2017).</li><li>Emonet, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+from+cloned+cDNAs+and+in+vivo+characterization+of+recombinant+pathogenic+Romero+and+live-attenuated+Candid#1+strains+of+Junin+virus,+the+causative+agent+of+Argentine+hemorrhagic+fever+disease.">Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease.</a> Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).</li><li>Child, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+the+protein+kinase+R+pathway+in+human+cells+by+Rhesus+Cytomegalovirus.">Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus.</a> Journal of Virology. 92, 6 (2018).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li></ol>

肯定的な感覚の RNA のウイルスは、dsDNA ウイルス dsRNA は J2 アンチ dsRNA の広く使用される抗体を容易に検出されます。ただし、否定的な感覚の RNA のウイルスは、低または2同じ抗体を使用して検出のレベルの下の dsRNA を生成すると考えられています。したがって、ウイルスの RNA と PRR の相互作用の多くの側面は否定的な感覚の RNA のウイルスの明確な主ではありません。J2 ?...

生得の免疫反応の誘導の最初のステップは二本鎖 (ds) RNA によって、パターン認識の受容器 (PRRs) レチノイン酸などの宿主認識 (リグ-私) 受容体 (RLRs) リグが好き-私と黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA-5)1。肯定的な感覚の RNA のウイルスの dsRNA 容易に検出できる J2 または K1 アンチ dsRNA のモノクローナル抗体 (Mab)2を使用しています。DsRNA と PRRs のピコルナ ウイルスなどのプラス鎖 RNA ウイルスの相互作用は、共焦点顕微鏡3を使用して特徴づけられています。ただし、否定的な感覚 RNA ウイルス、PRR と dsRNA の相互作用の可視化とによって妨げられている dsRNA に敏感な抗体の欠如。RNA 蛍光そのままの交配 (魚) は、ウイルスの RNA と PRRs4の可視化に適用されています。それにもかかわらず、魚方法論はターゲット RNA シーケンスの知識が必要です、PRR は共同染色と互換性がない可能性があります。最近、9 5 パン エンテロ ウイルス感染症の診断のため開発された、Mab 見つかり J2 モノクローナル抗体よりも高感度が容易に否定的な感覚の RNA ウイルス感染症5,6に dsRNA を検出します。したがって、Mab 9 5 が斬新で、ウイルスの複製と PRR および否定的な感覚の RNA ウイルスのウイルスの RNA 間の相互作用を検討するときに役立ちます。
アレナは、単一座礁させた、否定的な感覚の RNA ウイルス、ラッサ ウイルス (LASV)、フニン ウイルス (JUNV)、Machupo ウイルス (MACV)、人間7に重度の出血熱の病気を引き起こすなど、いくつかの人間の病原体を含む家族です。JUNV 新世界アレナ ウイルスによって引き起こされるアルゼンチン出血熱の重症や死亡するケースから臨床データを表わす血清 IFN α8,9の異常に高いレベル。病原性の NW アレナ (JUNV、MACV) がない、病原性旧世界アレナ ウイルス科、LASV、型を誘発することを示した私10ひと単球由来樹状細胞におけるインターフェロン (IFN) 応答します。さらに、リグ-私は、センサーの一つを仲介する I 型 IFN の応答 JUNV 感染細胞11。DsRNA 認識のため伝統的に知られている蛋白質キナーゼ (PKR) R 受容体が病原性 NW アレナ ウイルス感染12でアクティブであることが分かった。アレナ ウイルス感染ウイルスに特有な IFN 応答のメカニズムをさらに理解するには、dsRNA ウイルスと細胞質の PRRs の相互作用を視覚化するためのプロトコルの開発を目的とします。
病原性 JUNV、MACV LASV と感染実験は、バイオ セーフティにおける行いますレベル 4 (BSL-4) 施設。したがって、アレナ ウイルス感染で形成された dsRNA のおそらく低レベル、に加えてバイオセイフティ要件を満たす別技術課題ですこれらの高病原性ウイルスのイメージングを行う際。9 5 を用いた抗体と JUNV の Candid1 # ワクチン株、共焦点顕微鏡ベースのプロトコルは dsRNA ウイルス蛋白質、PRR のアレナ ウイルスによる感染細胞で同時に視覚化に正常に使用されているこのレポートに記載されています。BSL2 実験室。プロトコルは、dsRNA と PRR BSL4 施設における病原性アレナ ウイルス感染時に細胞内に分布の可視化に適しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>1:2,000 dilution; Lot #: 1454437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Bio</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>1:2000 dilution; Lot #: 1874804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lung epithelial A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MAb anti-JUNV NP</td>
			<td>BEI</td>
			<td>NA05-AG12</td>
			<td>Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3361</td>
			<td>ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS supplemented with Ca and Mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDL Coated coverslips</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>H-12-1.5-pdl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit MAb MDA-5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab126630</td>
			<td>1:250 dilution; Lot #: GR97758-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombiant Candid#1 strain of JUNV</td>
			<td>Lab generated</td>
			<td>Lab generated</td>
			<td>As previously described in reference 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-376845</td>
			<td>1:1000 dilution; Lot #: AO218</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of double-stranded rna and pattern recognition receptors in negative-sense rna virus infection

二本鎖 (ds) RNA が RNA ウイルス感染複製中間体として生成されます。レチノイン酸などには、[ホストのパターン認識の受容器 (PRRs) による dsRNA の認識 (リグ-私) 受容体 (RLRs) リグが好き-私と黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA-5) は、生得の免疫反応の誘導に 。形成と肯定的な感覚の RNA ウイルス感染における dsRNA の細胞内分布をよく顕微鏡によって特徴づけられています。多く否定的な感覚の RNA のウイルスなどいくつかのアレナは、感染時に生得の免疫反応をトリガーします。しかし、否定的な感覚の RNA のウイルスは dsRNA ウイルス dsRNA の PRR 認識のイメージング研究を妨げるの低レベルを生成すると考えられました。さらに、高い封じ込めバイオ セーフティ レベル設備 (BSL-4) で高病原性アレナでの感染実験を行う必要があります。高病原性 RNA ウイルスのウイルスの RNA と PRRs の相互作用は主研究者は BSL 4 施設に直面する必要がある追加の技術的な課題のため知られています。最近では、もともとパン エンテロ ウイルス検出用モノクローナル抗体 (Mab) (クローン 9 5) は特に伝統的な J2 または K1 アンチ dsRNA の抗体よりも高い感度で dsRNA を検出する発見されています。9 5 を用いて、抗体、dsRNA ウイルス蛋白質、アレナ ウイルスに感染した細胞で同時に PRR を視覚化するために正常に使用されている共焦点の顕微鏡検査プロトコルについて述べる。プロトコルの dsRNA の PRR BSL4 施設における病原性アレナ ウイルス感染細胞分布のイメージングにも適しています

このプロトコルは、配布し、RLRs の間の共存の研究に応用された (リグ-私は、MDA 5) と JUNV 感染細胞における dsRNA。図 1と図 2のように、ウイルス感染の進行につれて dsRNA の蓄積が増加します。MDA-5 (図 1) とリグを集中-(図 2) 信号は、NP、dsRNA の点状の構造の結果発見されました。<...

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Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

二本鎖 RNA ウイルス RNA の複製中に生産は、生来の免疫応答を誘導するパターン認識受容体によって認識できます。否定的な感覚の RNA のウイルスの低レベルの dsRNA と PRRs の相互作用は不明します。アレナ ウイルス科 dsRNA と個々 の細胞における PRR を視覚化する共焦点顕微鏡法を行った。

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

従来の二本鎖RNA検出アッセイは、通常、陰性感覚RNAウイルス感染で形成された二本鎖RNAを検出するのに十分な感度ではない。したがって、二本鎖RNAと宿主パターン認識受容体との相互作用は、これらのウイルスにとってほとんど不可解なままである。このプロトコルを利用して、ウイルス核タンパク質、二本鎖RNA、陰性感覚RNAウイルスの単一細胞レベルでPRRをホストする間の相互作用を可視化し、特徴付けることができる。これは、個々の細胞における二本鎖RNAと2つのウイルスまたは宿主タンパク質標的の同時染色を可能にする多重アッセイである。RNA-FISHアッセイとは異なり、この技術はRNA配列に依存せず、通常はタンパク質標的の抗体検出と互換性があります。感染の24時間前に、200,000個のヒト肺上皮A549細胞をポリ-D-リジンコーティングガラスカバースリップに12ウェルプレートに播種し、37で成長させることで開始します。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Interference in Ticks

ダニのRNA干渉

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

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