Name: mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2019-02-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en R01 tilskud (CA200572) fra NIH til PS. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Cancer Institute eller de nationale institutter Health.The finansieringskilderne spillede ingen rolle i studere design, dataindsamling og analyse, beslutning om at udgive, eller forberedelse af manuskriptet.

Alle dyr arbejde blev godkendt af Mayo Clinic IACUC.
1. forberedelse af materialer, løsninger og 3-dimensionel Matrix baser
<ol><li>Skåret 500 µm og 105 µm polypropylen masker ind 76 mm af 76 mm firkanter. Fold hver firkant i halv to gange for at skabe en mindre foldede kvadrat. Sted en 500 µm og en 105 µm mesh square i et autoklaverbart pose.</li>
	<li>Autoklave polypropylen mesh pladser, samt to par af saks og pincet.</li>
	<li>
Gøre 100 mL 10 x Waymouths løsning. Rør 1 h?...

<ol>
	<li>Rooman, I., Real, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma+and+acinar+cells:+a+matter+of+differentiation+and+development.">Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development.</a> Gut. 61 (3), 449-458 (2012).</li><li>Stanger, B. Z., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+in+pancreas+development+and+regeneration.">Control of cell identity in pancreas development and regeneration.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).</li><li>Caldas, C., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutation+and+pancreatic+adenocarcinoma.">K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma.</a> International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li><li>Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+blocks+Kras-dependent+reprogramming+of+acini+into+pancreatic+cancer+precursor+lesions+in+mice.">Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).</li><li>Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+pancreatic+neoplasia+of+ductal+phenotype+induced+by+acinar+cell+targeting+of+mutant+Kras+in+transgenic+mice.">Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice.</a> Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).</li><li>Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+7+controls+pancreatic+acinar+cell+transdifferentiation+by+activating+the+Notch+signaling+pathway.">Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-secreted+cytokines+drive+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia+through+NF-kappaB+and+MMPs.">Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs.</a> Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).</li><li>De La, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Kras+reprogram+pancreatic+acinar+cells+to+ductal+intraepithelial+neoplasia.">Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).</li><li>Habbe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+induction+of+murine+pancreatic+intraepithelial+neoplasia+(mPanIN)+by+acinar+cell+targeting+of+oncogenic+Kras+in+adult+mice.">Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+KRas-Induced+Mitochondrial+Oxidative+Stress+in+Acinar+Cells+Upregulates+EGFR+Signaling+to+Drive+Formation+of+Pancreatic+Precancerous+Lesions.">Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions.</a> Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).</li><li>Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+using+unauthenticated,+over-passaged+cell+lines:+how+much+more+data+do+we+need.">The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need.</a> Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).</li><li>Gout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+primary+pancreatic+acinar+cells.">Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D.">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).</li></ol>

Den relativt korte tidsrum isolation, infektion og plating primære acinar celler er en fordel ved denne metode. Derimod dyrkning acinar celler fra en eksplantat udvækst kræver lidt hands-on tid, men det tager syv dage for udvækst af acinar celler13. En alternativ protokol for acinar isolation14 bemærker en meget kort metode til at indhente acinar celler; EGF er imidlertid et væsentligt element i at holde acinar celler i live, når isoleret ved hjælp af denne protokol...

Acinar til duktalt metaplasi (ADM) er en beskyttende mekanisme under pancreatitis og en nøglen oparbejde kørsel bugspytkirtelkræft udvikling1 der kræver yderligere mekanistiske indblik. Mens betændelse-induceret ADM er reversibel2, forhindre muterede KRAS mutationer, der er til stede i 90% af kræft i bugspytkirtlen sager3, differentiering tilbage til en acinar fænotype4,5, 6. Culturing og differentiere primære acinar celler i duktalt celler i 3D kultur giver mulighed for undersøgelse af de molekylære mekanismer, der regulerer ADM proces, som er vanskelige at studere in vivo. Sådan ex vivo undersøgelser aktiverer real-time visualisering af ADM, dets drivere og dens lovgiverne. Flere drivere af ADM proces, samt mekanistiske indblik på deres downstream signaling veje, er blevet identificeret eller verificeret ved hjælp af her beskrevne metode. Disse omfatter ADM induktion af TGF-α (omdanne vækst faktor alfa)-medieret udtryk af MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) og aktivering af Notch7, samt RANTES (reguleret på aktivering, normal T celle udtrykt og udskilles; også kendt som chemokine ligand 5 eller CCL5) og TNFα (tumor nekrose faktor alfa)-induceret ADM gennem aktivering af NF-κB (nuclear factor-κB)8. En yderligere mægler af ADM er muterede KRas9,10, som medfører en stigning i oxidativ stress, som øger ADM proces gennem øget udtryk for EGFR (epidermal vækstfaktor receptor) og dens ligander, EGF ( epidermal vækstfaktor) og TGF-α11.
Mens brugen af pancreas cancer cellelinjer er fælles for in vitro-undersøgelser, giver primære cellekulturer mange fordele. For eksempel, primære acinar celler fra ikke-Transgene mus eller mus husly igangsættende mutationer, såsom KrasG12D, er den mest hensigtsmæssige model for at studere de tidlige begivenhed af ADM fordi cellerne har par og kontrolleret mutationer, som er kendt for at være til stede tidligt i bugspytkirtelkræft udvikling. Dette er i modsætning til mange pancreas cancer cellelinjer, der har flere mutationer og varierede udtryk baseret på passage nummer12. Derudover er signaling veje identificeret af sådanne midler blevet bekræftet ved dyreforsøg. En advarsel af ved hjælp af primær acinar celler er, at de ikke kan være transfekteret, som typisk kræft cellelinjer kan.
Metoden heri detaljer teknikker til acinar celle isolation, 3D kultur, der efterligner ADM ved at tilføje stimulanser eller modulerende protein udtryk via adenoviral eller lentiviral infektion, samt fornyet dyrkning af celler på slutpunktet for yderligere analyser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2181px;" width="2179">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">37 &#176;C shaking incubator</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SHKE4000-7</td>
			<td style="width:1487px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:357px;">5% CO2, 37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:167px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:171px;">NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Absorbent pad, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Adenovirus, Ad-GFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:171px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">BD Precision Glide Needle 21G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">305167</td>
			<td>Use as pins for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Beaker, 600 mL</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">FB-101-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bleach, 8.25%</td>
			<td style="width:167px;">Clorox</td>
			<td style="width:171px;">31009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell Recovery Solution</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354253</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix recovery solution&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Collagenase Type I, Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C0130-1G</td>
			<td>Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D1756</td>
			<td>Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:167px;">Decon Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:171px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F0926-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glass slide, 8-well</td>
			<td style="width:167px;">Lab-Tek</td>
			<td style="width:171px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH3048801</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ice bucket, rectangular</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">07-210-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-812-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Minigrip</td>
			<td style="width:171px;">SBL2X69S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lentiviral Packaging Mix, Virapower</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">44-2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Matrigel</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">356234</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Parafilm</td>
			<td style="width:167px;">Bemis</td>
			<td style="width:171px;">PM992</td>
			<td>Referred to as &#39;plastic paraffin film&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 10 &#181;l</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1110-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 1000 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:171px;">24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 200 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1111-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet-Aid</td>
			<td style="width:167px;">Drummond</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P10, 1-10 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P20, 2-20 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P200, 20-200 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 10 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 25 ml</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 5 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 12-well</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 24-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 6-well</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:171px;">TR-1003-G</td>
			<td>Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 105 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 500 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">Soybean Trypsin Inhibitor 8</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:171px;">17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Spatula</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TGF-&#945;</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:171px;">239-A-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Type I Rat Tail Collagen</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Waymouth MB 752/1 Medium (powder)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">W1625-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Weigh boat, hexagonal, medium&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture

Differentiering af acinar celler til duktalt celler under pancreatitis og i den tidlige udvikling af kræft i bugspytkirtlen er en vigtig proces, der kræver yderligere undersøgelse. For at forstå mekanismerne, der tilbyder regulerer acinar til duktalt metaplasi (ADM), ex vivo 3D kultur og differentiering af primær acinar celler til duktalt celler mange fordele i forhold til andre systemer. Med teknikken heri er graduering af protein udtryk enkel og hurtig, som kræver kun én dag til at isolere, stimulere eller viralt inficere og begynde, dyrkning af primære acinar celler til at undersøge ADM proces. I modsætning til ved hjælp af basalmembranen matrix, seeding af acinar celle klynger i kollagen jeg ekstracellulære matrix, giver mulighed for acinar celler til at bevare deres acinar identitet før manipulation. Dette er afgørende, når afprøvning af forskellige komponenter til induktion af ADM. bidrag Ikke alene er effekt af cytokiner eller andre ectopically administreret faktorer testbare gennem denne teknik, men bidrag af almindelige mutationer, øget protein udtryk eller knockdown ekspression af proteiner er testbare via viral infektion i primære acinar celler, ved hjælp af adenoviral eller lentiviral vektorer. Derudover celler kan isoleres igen fra kollagen eller basalmembranen matrix på slutpunktet og analyseret for protein udtryk.

Afslutningen af protokollen heri opstår inden for en dag og efter stimulation, ADM er set i 3-5 dage. Figur 1 viser rækkefølgen af metoden, hvorved trin 1 til 4 er afsluttet på den første dag. Dette omfatter forberedelse, acinar isolation, virusinfektion og nedstøbning i kollagen eller basalmembranen matrix. Mens matrixen basalmembranen inducerer ADM, acinar celler i kollagen jeg kræver en stimulus, som TGF-α, underkastes differentiering til duktalt c...

Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Efterligne og manipulere med pancreas Acinar til duktalt metaplasi i 3-dimensionelle cellekultur

Primære acinar celle isolation, protein udtryk eller aktivitet graduering, kultur og down-stream programmer er særdeles nyttige i ex vivo undersøgelse af acinar til duktalt metaplasi (ADM), en tidlig begivenhed i udviklingen af kræft i bugspytkirtlen.

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Vores protokol tilbyder direkte visualisering af Acinar-til-Ductal Metaplasia og giver mulighed for undersøgelse af bidraget fra ektopisk administrerede faktorer eller protein modulering til denne proces. Den største fordel ved denne teknik er, at Acinar-til-Ductal Metaplasia kan ses i realtid og celle signalering undersøgelser kan udføres. At dissekere bugspytkirtlen fra en aflivet mus, først pin poterne af musen til polystyren låget, orientere det, så halen står over for forskeren og spray maven med 70% ethanol.Brug autoklavede kraftvipper til at løfte pels og hud på midterlinjen, og med autoklaveret saks, foretage et snit gennem pels og hud fra urethral åbning til membran brystkasse område. Lav yderligere indsnit til venstre og højre for at skære væk pels og hud, hvilket skaber et klart overblik over bughulen. Derefter skæres ind i bughindeforet, ned i midten og til højre og venstre og træk det væk fra organerne.Brug de virpinte til at løfte tarmene og flytte dem til venstre side af musen, hvilket skaber plads til at se den lyserøde bugspytkirtel knyttet til den mørke, røde, ovale milt. Bugspytkirtlen væv vil have bløde, svampet tekstur. Skær bugspytkirtlen, som løber langs maven, sammenflettet med tarmene.Adskå milten fra bugspytkirtlen og læg bugspytkirtlen i et 50 milliliterrør indeholdende 10 milliliter HBSS, med én gang penicillin streptomycin og overføre det til laminar flow hætte. Hæld indholdet af røret i en tom vejer båd og bruge antævladt til at vaske bugspytkirtlen ved hvirvlende det. Brug derefter pincet til at flytte bugspytkirtlen til en anden vejebåd, der indeholder HBSS med penicillin streptomycin og vaskes igen ved at hvirvle.Flyt bugspytkirtlen til den tredje vejebåd, der indeholder HBSS med penicillin streptomycin og begynde at skære bugspytkirtlen i fem millimeter eller mindre stykker. For at hælde indholdet af vejebåden i en frisk 50 milliliter rør, først bruge de virf kant til at flytte bugspytkirtlen stykker i væsken, som båden bliver tippet. Når stykkerne ikke længere er fastgjort til båden, hæld dens indhold i røret.Saml eventuelle resterende stykker op med snævn og vask snævrene i røret. Efter centrifugering røret ved 931 gange tyngdekraften ved fire grader Celsius i to minutter, skal du bruge en fem milliliter pipette til at fjerne HBSS og flydende fedt. Tilsæt fem milliliter kollagen fortyndet i HBSS.Rørret røret lukkes, og der skal sikres et forseglet låg ved at vie røret i plastparaffinfilm. Placer den i en kuvøse, ryster ved 220 RPM ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Hvilket vil give den uklare opløsning, og få resterende væv stykker.For at stoppe dissociationen anbringes røret på is og tilsættes fem milliliter kold HBSS med 5%FBS. Efter centrifugering ved 931 gange tyngdekraften ved fire grader Celsius i to minutter, skal du fjerne supernatanten ved hjælp af en fem milliliter pipette. Re-suspendere pellet i 10 milliliter HBSS med 5%FBS, og centrifuge igen ved 931 gange tyngdekraften i to minutter ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten med en pipette på fem milliliter, og gentag dette trin med yderligere 10 milliliter HBSS med 5%FBS. Derefter re-suspendere pellet i fem milliliter AF HBSS med 5%FBS. Brug en P1000-pipette til at filtrere celleophænget en milliliter ad gangen gennem et 500 mikrometermaske i et 50 milliliterrør.For at vaske eventuelle resterende pancreas celler gennem masken, tilsæt yderligere fem milliliter HBSS med 5% FBS. Brug derefter en P1000-pipette til at overføre denne filtrate en milliliter ad gangen gennem 105 mikrometermasken i et 50 milliliterrør. Forsigtigt pipette denne celle suspension i en 50 milliliter rør, der indeholder HBSS med 30% FBS, som vil danne et lag af celle suspension øverst.Centrifuge denne celle suspension på 233 gange tyngdekraften ved fire grader Celsius i to minutter og fjerne supernatant. Re-suspendere pellet indeholder Acinar celler i én gang Waymouth's komplette medium. Da en bugspytkirtel er tilstrækkelig til to virusinfektioner, opdele celle suspension mellem lågene på to 35 millimeter plader, som giver mulighed for infektion i suspension.For adenoviral infektion, tilsæt virus ved en 1/1000 fortynding til låget af hver plade og hvirvle. Placer pladerne i en cellekultur inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Hvirvle hver 15 minutter for den første time og fortsætte inkubationen i yderligere to timer.For at lave en kollagen gel, kombinere syv milliliter af type en rotte hale kollagen, 700 mikroliter af 10 gange Waymouth medium og 466,6 mikroliter af 0,34 molar natriumhydroxid i en 50 milliliter rør på is til at gøre kollagen gel. I et 50 milliliterrør kombineres lige store mængder celleaffjedring og kollagengel efter tre timers inkubation og bland forsigtigt. Plade 2000 mikroliter, en brønd ad gangen i en seks brønd plade og samtidig holde pladen på is og hvirvle til jævnt distribuere kollagen celle lag.For at størkne mediet inkuberes pladen i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid i 30 minutter. Derefter tilsættes 1,5 milliliter pr. brønd på én gang Waymouths komplette medium med den ønskede stimulus eller inhibitorer. Skift mediet den følgende dag og derefter hver anden dag.Afhængigt af stimulus anvendes, Acinar-til-Ductal Metaplasia eller ADM kan observeres mellem dag tre og dag fem. 24 timer efter infektion med GFP adenovirus, billeder af celler indlejret i kollagen eller kælder membran matrix, viste, at infektionen var effektiv. På fem dage efter infektion, celler indlejret i kollagen dannet kanal-lignende strukturer, når stimuleret med 50 nanogram per milliliter TGF alpha.Celler indlejret i kælderen membran matrix dannet kanal-lignende strukturer i mangel af en stimulus på fem dage efter infektion. Der henviser til større kanaler blev dannet ved stimulation med 50 nanogram per milliliter TGF alpha. Et af de mest kritiske punkter i protokollen er længden af kollagen fordøjelsen.Korrekt fordøjelse er angivet ved en uklar opløsning og få resterende væv stykker.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokol til Rapid Post-mortem Cell Culture af Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Fordampning-reducerende Kultur Betingelse Øger Reproducerbarhed af flercellet Sfæroide Formation i mikrotiterplader

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Forberedelse og metaboliske analyse af 3-dimensionelle klumpformet Co kulturer af kræft i bugspytkirtlen celler og fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi test i en klumpformet-baseret 3D celle kultur Model for hoved og hals planocellulært karcinom

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering af Stem-lignende celler fra 3-dimensionelle sfæriske kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Overvågning af kræftcelleinvasion og T-cellecytotoksicitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

En orthotopic Resectional Mouse Model af kræft i bugspytkirtlen

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisteret Distal Pancreatectomy med cøliaki akse Resektion (DP-CAR) for kræft i bugspytkirtlen: Kirurgisk planlægning og teknik

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablering af 3-dimensionelle sfæroider fra patientafledte tumorprøver og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...