Name: mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2019-02-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une subvention de R01 (CA200572) du NIH au PS Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l’Institut National du Cancer ou les instituts nationaux de Health.The bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans étudier la conception, la collecte de données et l’analyse, décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

Tous les travaux d’animaux a été approuvé par la Mayo Clinic IACUC.
1. préparation des matières, Solutions et Bases de matrice 3D
<ol><li>Couper 500 µm et 105 µm en polypropylène maillages en 76 mm par carrés de 76 mm. Plier chaque carré en deux deux fois pour créer un plus petit carré plié. Place un 500 µm et le µm un 105 maillage carré dans une pochette autoclavable.</li>
	<li>Le filet en polypropylène autoclave places, ainsi que deux paires de ciseaux et pinces.</li>
	<...

<ol>
	<li>Rooman, I., Real, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma+and+acinar+cells:+a+matter+of+differentiation+and+development.">Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development.</a> Gut. 61 (3), 449-458 (2012).</li><li>Stanger, B. Z., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+in+pancreas+development+and+regeneration.">Control of cell identity in pancreas development and regeneration.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).</li><li>Caldas, C., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutation+and+pancreatic+adenocarcinoma.">K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma.</a> International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li><li>Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+blocks+Kras-dependent+reprogramming+of+acini+into+pancreatic+cancer+precursor+lesions+in+mice.">Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).</li><li>Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+pancreatic+neoplasia+of+ductal+phenotype+induced+by+acinar+cell+targeting+of+mutant+Kras+in+transgenic+mice.">Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice.</a> Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).</li><li>Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+7+controls+pancreatic+acinar+cell+transdifferentiation+by+activating+the+Notch+signaling+pathway.">Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-secreted+cytokines+drive+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia+through+NF-kappaB+and+MMPs.">Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs.</a> Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).</li><li>De La, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Kras+reprogram+pancreatic+acinar+cells+to+ductal+intraepithelial+neoplasia.">Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).</li><li>Habbe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+induction+of+murine+pancreatic+intraepithelial+neoplasia+(mPanIN)+by+acinar+cell+targeting+of+oncogenic+Kras+in+adult+mice.">Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+KRas-Induced+Mitochondrial+Oxidative+Stress+in+Acinar+Cells+Upregulates+EGFR+Signaling+to+Drive+Formation+of+Pancreatic+Precancerous+Lesions.">Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions.</a> Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).</li><li>Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+using+unauthenticated,+over-passaged+cell+lines:+how+much+more+data+do+we+need.">The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need.</a> Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).</li><li>Gout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+primary+pancreatic+acinar+cells.">Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D.">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).</li></ol>

La durée relativement courte pour isolement, infection et des cellules acineuses primaires de placage est un avantage de cette méthode. En revanche, cultivant des cellules acineuses d’une excroissance de l’explant nécessite peu de temps pratique, mais il faut sept jours pour l’excroissance des cellules acineuses13. Un protocole alternatif pour isolement acineuses14 note une méthode très courte pour obtenir des cellules acineuses ; Cependant, EGF est une composan...

Métaplasie acineux-à-canalaire (SMA) est un mécanisme de protection au cours de la pancréatite et un processus clé de développement de cancer du pancréas1 qui nécessite une vision mécaniste complémentaire au volant. Alors que l’inflammation induite par la SMA est réversible2, oncogène KRAS mutations, qui sont présentes dans 90 % des cas de cancer du pancréas3, empêchent la différenciation vers un phénotype acineuses4,,5, 6. Culturing et la différenciation des cellules acineuses primaires dans des cellules canalaires en culture 3D permet d’étudier les mécanismes moléculaires régissant le processus d’ADM, qui est difficile à étudier in vivo. Ces ex vivo études permettent la visualisation en temps réel du SMA, ses pilotes et ses régulateurs. Plusieurs pilotes de processus de SMA, et le mécaniste insight sur leurs voies de signalisation en aval, ont été identifiés ou vérifiées à l’aide de l’ici décrit la méthode. Il s’agit d’induction de SMA par TGF-α (alpha de facteur de croissance transformant)-médiée par l’expression de MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) et l’activation de l’encoche7, ainsi que RANTES (réglée sur activation, cellule normale de T exprimée et sécrétée ; également connu chemokine ligand 5 ou CCL5) et TNFα (facteur de nécrose tumorale alpha)-induite par ADM grâce à l’activation de NF-κB (nuclear factor-κB)8. Un médiateur supplémentaire du SMA est oncogène KRas9,10, ce qui provoque une augmentation de stress oxydatif qui améliore le processus de SMA par augmentation de l’expression de l’EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique) et ses ligands, EGF ( facteur de croissance épidermique) et TGF-α11.
Alors que l’utilisation de lignées cellulaires de cancer du pancréas est commune pour des études in vitro, cultures de cellules primaires offrent de nombreux avantages. Par exemple, les cellules acineuses primaires de souris non-transgéniques ou souris associées à des mutations initiatrice, commeG12Dde Kras, sont le modèle le plus approprié pour l’étude de l’événement début du SMA parce que les cellules présentent des mutations rares et contrôlées, qui sont connus pour être présents au début du développement d’un cancer du pancréas. Il s’agit en revanche de nombreuses lignées cellulaires de cancer du pancréas qui présentent des mutations multiples et variées d’expression selon le passage numéro12. En outre, les voies de signalisation identifiés par de tels moyens ont été vérifiées par les études chez l’animal. Une mise en garde de l’utilisation des cellules acineuses primaires, c’est qu’ils ne peuvent pas transfecter possible de lignées cellulaires cancéreuses typique.
La méthode ci-après détaille les techniques d’isolement de cellules acineuses, culture 3D qui imite le SMA en ajoutant des stimulants ou en modulant l’expression de la protéine par infection adénovirale ou des gènes, ainsi que re-isolement de cellules au point de terminaison pour approfondir les analyses.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2181px;" width="2179">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">37 &#176;C shaking incubator</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SHKE4000-7</td>
			<td style="width:1487px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:357px;">5% CO2, 37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:167px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:171px;">NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Absorbent pad, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Adenovirus, Ad-GFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:171px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">BD Precision Glide Needle 21G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">305167</td>
			<td>Use as pins for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Beaker, 600 mL</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">FB-101-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bleach, 8.25%</td>
			<td style="width:167px;">Clorox</td>
			<td style="width:171px;">31009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell Recovery Solution</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354253</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix recovery solution&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Collagenase Type I, Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C0130-1G</td>
			<td>Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D1756</td>
			<td>Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:167px;">Decon Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:171px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F0926-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glass slide, 8-well</td>
			<td style="width:167px;">Lab-Tek</td>
			<td style="width:171px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH3048801</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ice bucket, rectangular</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">07-210-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-812-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Minigrip</td>
			<td style="width:171px;">SBL2X69S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lentiviral Packaging Mix, Virapower</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">44-2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Matrigel</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">356234</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Parafilm</td>
			<td style="width:167px;">Bemis</td>
			<td style="width:171px;">PM992</td>
			<td>Referred to as &#39;plastic paraffin film&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 10 &#181;l</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1110-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 1000 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:171px;">24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 200 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1111-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet-Aid</td>
			<td style="width:167px;">Drummond</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P10, 1-10 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P20, 2-20 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P200, 20-200 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 10 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 25 ml</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 5 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 12-well</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 24-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 6-well</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:171px;">TR-1003-G</td>
			<td>Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 105 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 500 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">Soybean Trypsin Inhibitor 8</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:171px;">17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Spatula</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TGF-&#945;</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:171px;">239-A-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Type I Rat Tail Collagen</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Waymouth MB 752/1 Medium (powder)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">W1625-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Weigh boat, hexagonal, medium&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture

La différenciation des cellules acineuses de canalaire au cours de la pancréatite et dans le développement précoce du cancer du pancréas est un processus essentiel qui nécessite une étude plus approfondie. Pour comprendre les mécanismes de régulation métaplasie acineux-à-canalaire (SMA), ex vivo culture 3D et différenciation des cellules acineuses primaires aux cellules canalaires offre de nombreux avantages par rapport aux autres systèmes. Avec la technique ci-après, modulation de l’expression de la protéine est simple et rapide, nécessitant un seul jour d’isoler, stimuler ou virale infecter et commencer la mise en culture des cellules acineuses primaires afin d’étudier le processus d’ADM. Contrairement à l’utilisation de la matrice de la membrane basale, l’ensemencement des amas de cellules acineuses en collagène I matrice extracellulaire, permet aux cellules acineuses de conserver leur identité acineuse avant toute manipulation. C’est très important lors de l’essai de la contribution des diverses composantes de l’induction de l’ADM. Non seulement les effets des cytokines ou d’autres facteurs de façon ectopique administrées testables grâce à cette technique, mais la contribution de la commune des mutations, expression de la protéine accrue ou précipitation d’expression de la protéine est testable par infection virale du cellules acineuses primaires, à l’aide des vecteurs adénovirus ou des gènes. En outre, les cellules peuvent être ré-isolés du collagène ou de la matrice de la membrane basale au point de terminaison et analysés pour l’expression de la protéine.

Achèvement du protocole ci-après se produit dans la journée et lors de la stimulation, ADM se voit dans 3-5 jours. La figure 1 illustre la séquence de la méthode, auquel cas les étapes 1 à 4 sont terminés le premier jour. Cela comprend la préparation, isolation acineuse, infection virale et un enfoncement dans collagène ou de la matrice de la membrane basale. Tandis que la matrice de la membrane basale induit des ADM, les cellules acineuses dans col...

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Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Imitant et manipuler une métaplasie acineux-à-canalaire pancréatique en Culture cellulaire 3D

Isolement des cellules acineuses primaire, modulation expression ou l’activité de protéines, la culture et des applications en aval sont abondamment utiles ex vivo étude de métaplasie acineux-à-canalaire (SMA), un événement précoce dans le développement du cancer du pancréas.

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Notre protocole offre une visualisation directe de la métaplasie acinaire-ductale et permet l’étude de la contribution de facteurs administrés par voie extra-utérinique ou de modulation protéique à ce processus. Le principal avantage de cette technique est que la métaplasie acinar-ductale peut être vue en temps réel et des études de signalisation cellulaire peuvent être effectuées. Pour disséquer le pancréas d’une souris euthanasiée, épinglez d’abord les pattes de la souris au couvercle en polystyrène, en l’orientant de sorte que la queue soit face au chercheur et pulvérisez l’abdomen avec 70% d’éthanol.Utilisez des forceps autoclavés pour soulever la fourrure et la peau à la ligne médiane, et avec des ciseaux autoclavés, faire une incision à travers la fourrure et la peau de l’ouverture urétrale à la cage thoracique diaphragme. Faire des incisions supplémentaires à gauche et à droite pour couper la fourrure et la peau, créant une vue claire de la cavité abdominale. Ensuite, coupez dans la doublure péritonéale, au milieu et à droite et à gauche et tirez-la loin des organes.Utilisez les forceps pour soulever les intestins et les déplacer vers le côté gauche de la souris, créant de l’espace pour voir le pancréas rose clair attaché à la rate ovale foncée, rouge. Le tissu pancréatique aura une texture douce et spongieuse. Découpez le pancréas, qui longe l’estomac, entrelacé avec les intestins.Séparez la rate du pancréas et placez le pancréas dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de HBSS, avec une fois la streptomiline de pénicilline et transférez-le au capot d’écoulement laminaire. Versez le contenu du tube dans un bateau de pesage vide et utilisez des forceps pour laver le pancréas en le tourbillonnant. Ensuite, utilisez les forceps pour déplacer le pancréas à un deuxième bateau de pesage contenant HBSS avec streptomycine pénicilline et laver à nouveau en tourbillonnant.Déplacez le pancréas vers le troisième bateau de pesage contenant HBSS avec de la streptomycine de pénicilline et commencez à couper le pancréas en cinq millimètres ou en petits morceaux. Pour verser le contenu du bateau de pesage dans un tube frais de 50 millilitres, utilisez d’abord les forceps pour déplacer les morceaux de pancréas dans le liquide pendant que le bateau est incliné. Une fois que les pièces ne sont plus fixées au bateau, versez son contenu dans le tube.Ramasser les morceaux restants avec les forceps et laver les forceps dans le tube. Après avoir centrifugé le tube à 931 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant deux minutes, utilisez une pipette de cinq millilitres pour enlever le HBSS et toute graisse flottante. Ajouter cinq millilitres de collagène dilués dans HBSS.Fermez le tube et assurez-vous d’un couvercle scellé en enveloppant le tube dans un film de paraffine en plastique. Placez-le dans un incubateur, en secouant à 220 rPM à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ce qui donnera la solution trouble, et peu de morceaux de tissu restants.Pour arrêter la dissociation, placez le tube sur la glace et ajoutez cinq millilitres de HBSS froid avec 5%FBS. Après avoir centrifugé à 931 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant deux minutes, retirez le supernatant à l’aide d’une pipette de cinq millilitres. Suspendre à nouveau la pastille dans 10 millilitres de HBSS avec 5%FBS, et centrifugeuse à nouveau à 931 fois la gravité pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.Retirez le supernatant à l’aide d’une pipette de cinq millilitres et répétez cette étape avec un autre 10 millilitres de HBSS avec 5%FBS. Puis suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres de HBSS avec 5%FBS. Utilisez une pipette P1000 pour filtrer la suspension cellulaire d’un millilitre à la fois à travers un maillage de 500 micromètres dans un tube de 50 millilitres.Pour laver les cellules pancréatiques restantes à travers le maillage, ajouter cinq millilitres supplémentaires de HBSS avec 5%FBS. Ensuite, utilisez une pipette P1000 pour passer ce filtrate d’un millilitre à la fois à travers le maillage de 105 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Pipette doucement cette suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres contenant HBSS avec 30%FBS, qui formera une couche de suspension cellulaire au sommet.Centrifugeuse cette suspension cellulaire à 233 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant deux minutes et enlever le surnatant. Suspendre à nouveau la pastille contenant les cellules Acinar dans un seul milieu complet de Waymouth. Puisqu’un pancréas est suffisant pour deux infections virales, divisez la suspension cellulaire entre les couvercles de deux plaques de 35 millimètres, ce qui permet l’infection en suspension.Pour l’infection adénoovirale, ajouter le virus à une dilution de 1/1000 au couvercle de chaque plaque et tourbillonner. Placer les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Tourbillonnez toutes les 15 minutes pendant la première heure et continuez l’incubation pendant deux heures supplémentaires.Pour faire un gel de collagène, combinez sept millilitres de collagène de queue de rat de type un, 700 microlitres de 10 fois le milieu de Waymouth et 466,6 microlitres de 0,34 hydroxyde de sodium molaire dans un tube de 50 millilitres sur la glace pour faire du gel de collagène. Dans un tube de 50 millilitres, mélanger des volumes égaux de suspension cellulaire et de gel de collagène après trois heures d’incubation et mélanger délicatement. Plaque 2000 microlitres, un puits à la fois dans une plaque de six puits tout en gardant la plaque sur la glace et tourbillonner pour répartir uniformément la couche cellulaire de collagène.Pour solidifier le milieu, incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite 1,5 millilitres par puits d’une fois le milieu complet de Waymouth avec stimulus ou inhibiteurs désirés. Changez le milieu le lendemain, puis tous les deux jours.Selon le stimulus utilisé, la métaplasie acinaire-ductal ou SMA peut être observée entre le troisième jour et le cinquième jour. 24 heures après l’infection par l’adénovirus GFP, des images de cellules intégrées dans la matrice de collagène ou de membrane du sous-sol, ont montré que l’infection était efficace. À cinq jours après l’infection, les cellules incorporées dans le collagène ont formé des structures de conduit-comme une fois stimulées avec 50 nanogrammes par millilitre d’alpha de TGF.Les cellules intégrées dans la matrice membranaire du sous-sol formaient des structures en forme de conduit en l’absence d’un stimulus à cinq jours après l’infection. Alors que de plus grands conduits ont été formés lors de la stimulation avec 50 nanogrammes par millilitre de TGF alpha. Un des points les plus critiques dans le protocole est la longueur de la digestion des collagènes.Une bonne digestion est indiquée par une solution trouble et quelques morceaux de tissu restants.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocole pour Rapid Post-mortem Culture cellulaire de Diffuse Intrinsic Pontine gliome (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

L&#39;évaporation de réduction Culture Condition Augmente la reproductibilité de la formation multicellulaire Spheroid en plaques de microtitration

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Préparation et test métabolique des co-cultures 3-dimensional sphéroïde de fibroblastes et de cellules de cancer du pancréas

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Vérifier dans un modèle de Culture cellulaire 3D basé sur l’ellipsoïde tête et cou, carcinome épidermoïde de la thérapie

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolement des cellules souches des cultures sphéroïdes tridimensionnelles

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Un modèle murin de résection orthotopique du cancer du pancréas

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Pancréatectomie distale assistée par robot avec résection de l’axe coeliaque (DP-CAR) pour le cancer du pancréas: planification et technique chirurgicales

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...