Name: mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2019-02-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch einen R01 Grant (CA200572) von der NIH, PS. unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder den nationalen Instituten Health.The Förderer keine Rolle in hatte studieren, Design, Datenerhebung und -Analyse, Entscheidung veröffentlichen, oder die Zubereitung des Manuskripts.

Alle tierische Arbeit wurde von der Mayo Klinik IACUC genehmigt.
1. Vorbereitung des 3-dimensionalen Matrix Grundlagen, Materialien und Lösungen
<ol><li>Schneiden Sie 500 µm und 105 µm Polypropylen Netze in 76 mm 76 mm Quadrate. Falten Sie jedes Quadrat in der Mitte zweimal erstelle ich ein kleiner gefalteten Quadrat. Platz 1 500 µm und eine 105 µm mesh Platz in einem Beutel autoklavierbar.</li>
	<li>Autoklaven Polypropylen mesh-Plätze sowie zwei Paare von Scheren und Pinzetten.</li>
	...

<ol>
	<li>Rooman, I., Real, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma+and+acinar+cells:+a+matter+of+differentiation+and+development.">Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development.</a> Gut. 61 (3), 449-458 (2012).</li><li>Stanger, B. Z., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+in+pancreas+development+and+regeneration.">Control of cell identity in pancreas development and regeneration.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).</li><li>Caldas, C., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutation+and+pancreatic+adenocarcinoma.">K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma.</a> International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li><li>Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+blocks+Kras-dependent+reprogramming+of+acini+into+pancreatic+cancer+precursor+lesions+in+mice.">Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).</li><li>Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+pancreatic+neoplasia+of+ductal+phenotype+induced+by+acinar+cell+targeting+of+mutant+Kras+in+transgenic+mice.">Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice.</a> Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).</li><li>Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+7+controls+pancreatic+acinar+cell+transdifferentiation+by+activating+the+Notch+signaling+pathway.">Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-secreted+cytokines+drive+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia+through+NF-kappaB+and+MMPs.">Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs.</a> Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).</li><li>De La, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Kras+reprogram+pancreatic+acinar+cells+to+ductal+intraepithelial+neoplasia.">Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).</li><li>Habbe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+induction+of+murine+pancreatic+intraepithelial+neoplasia+(mPanIN)+by+acinar+cell+targeting+of+oncogenic+Kras+in+adult+mice.">Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+KRas-Induced+Mitochondrial+Oxidative+Stress+in+Acinar+Cells+Upregulates+EGFR+Signaling+to+Drive+Formation+of+Pancreatic+Precancerous+Lesions.">Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions.</a> Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).</li><li>Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+using+unauthenticated,+over-passaged+cell+lines:+how+much+more+data+do+we+need.">The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need.</a> Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).</li><li>Gout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+primary+pancreatic+acinar+cells.">Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D.">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).</li></ol>

Die relativ kurze Zeitspanne für Isolation, Infektion und Plattieren primäre acinar Zellen ist ein Vorteil dieser Methode. Im Gegensatz dazu Kultivierung acinar Zellen aus einem modellabhängigen Auswuchs erfordert wenig Arbeitsaufwand beträgt, aber es dauert sieben Tage für Auswuchs von acinar Zellen13. Ein alternatives Protokoll für acinar Isolierung14 weist eine sehr kurze Methode zur Erlangung acinar Zellen; EGF ist jedoch ein wesentlicher Bestandteil in lebendig a...

Acinar-duktale Metaplasie (ADM) ist ein Schutzmechanismus bei Pankreatitis und ein Schlüsselprozess fahren Bauchspeicheldrüsenkrebs Entwicklung1 , das weitere mechanistische Einblicke erfordert. Während Entzündung induziert ADM reversibel2, Onkogene KRAS -Mutationen, die in 90 % der Bauchspeicheldrüsenkrebs Fällen3vorhanden sind, zu verhindern, dass Differenzierung zurück zu einer acinar Phänotyp4,5, 6. Culturing und Differenzierung der primäre acinar Zellen in duktale Zellen in 3D Culture ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen zur Regulierung des ADM-Prozess, der schwierig ist, in-vivo Studie. Diese ex-Vivo-Studien ermöglichen Echtzeit-Visualisierung von ADM, seine Fahrer und ihre Aufsichtsbehörden. Mehrere Fahrer der ADM-Prozess sowie die mechanistische Einblicke auf ihre nachgeschaltete Signalwege identifiziert wurden oder verifiziert mit der hier beschriebenen Methode. Dazu gehören ADM Induktion durch TGF-α (transformierende Wachstumsfaktor Alpha)-vermittelten Expression von MMP-7 (Matrix Metalloproteinase-7) und Aktivierung des Notch-7sowie RANTES (reguliert auf Aktivierung, normale T-Zelle ausgedrückt und abgesondert; auch bekannt als Chemokin Liganden 5 oder CCL5) und TNF (Tumor-Nekrose-Faktor Alpha)-induzierte ADM durch Aktivierung von NF-κB (nuclear Factor-κB)8. Ein zusätzliche Vermittler der ADM ist Onkogene KRas9,10, die einen Anstieg der oxidativen Stress verursacht, das erhöht den ADM-Prozess durch erhöhte Expression von EGFR (Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor) und seinen Liganden, EGF ( epidermalen Wachstumsfaktor) und TGF-α-11.
Während der Nutzung der pankreatischen Krebszelllinien für in-vitro-Studien üblich, bieten primären Zellkulturen viele Vorteile. Zum Beispiel sind primäre acinar Zellen von nicht-transgenen Mäusen oder Mäuse beherbergen initiierende Mutationen, wie KrasG12D, das am besten geeignete Modell für das Studium der frühen Veranstaltung von ADM, weil die Zellen verfügen über nur wenige und kontrollierte Mutationen, die sind dafür bekannt, bereits während der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs vorhanden sein. Dies steht im Gegensatz zu vielen pankreatischer Krebs-Zelllinien, die mehrere Mutationen haben und abwechslungsreich Ausdruck basiert auf Durchgang Nummer12. Darüber hinaus wurden die Signalwege identifiziert mit solchen Mitteln von tierexperimentellen Studien überprüft. Eine Einschränkung der Verwendung von primärer acinar Zellen ist, dass sie wie typische Krebszelllinien transfiziert werden können nicht.
Die Methode hierin beschreibt die Techniken der acinar Zelle isoliert, 3D Culture, die ADM imitiert, indem Stimulanzien oder Modulation der Proteinexpression durch adenoviralen oder Lentivirale Infektion sowie erneute Isolation von Zellen am Endpunkt für weitere Analysen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2181px;" width="2179">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">37 &#176;C shaking incubator</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SHKE4000-7</td>
			<td style="width:1487px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:357px;">5% CO2, 37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:167px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:171px;">NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Absorbent pad, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Adenovirus, Ad-GFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:171px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">BD Precision Glide Needle 21G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">305167</td>
			<td>Use as pins for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Beaker, 600 mL</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">FB-101-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bleach, 8.25%</td>
			<td style="width:167px;">Clorox</td>
			<td style="width:171px;">31009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell Recovery Solution</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354253</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix recovery solution&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Collagenase Type I, Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C0130-1G</td>
			<td>Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D1756</td>
			<td>Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:167px;">Decon Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:171px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F0926-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glass slide, 8-well</td>
			<td style="width:167px;">Lab-Tek</td>
			<td style="width:171px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH3048801</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ice bucket, rectangular</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">07-210-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-812-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Minigrip</td>
			<td style="width:171px;">SBL2X69S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lentiviral Packaging Mix, Virapower</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">44-2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Matrigel</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">356234</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Parafilm</td>
			<td style="width:167px;">Bemis</td>
			<td style="width:171px;">PM992</td>
			<td>Referred to as &#39;plastic paraffin film&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 10 &#181;l</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1110-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 1000 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:171px;">24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 200 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1111-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet-Aid</td>
			<td style="width:167px;">Drummond</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P10, 1-10 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P20, 2-20 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P200, 20-200 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 10 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 25 ml</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 5 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 12-well</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 24-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 6-well</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:171px;">TR-1003-G</td>
			<td>Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 105 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 500 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">Soybean Trypsin Inhibitor 8</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:171px;">17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Spatula</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TGF-&#945;</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:171px;">239-A-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Type I Rat Tail Collagen</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Waymouth MB 752/1 Medium (powder)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">W1625-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Weigh boat, hexagonal, medium&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture

Die Differenzierung der acinar Zellen duktale Zellen bei Pankreatitis und in der frühen Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist ein Schlüsselprozess, die weitere Untersuchung erfordert. Um die Mechanismen zu verstehen bietet regulierende acinar-duktale Metaplasie (ADM), ex-Vivo-3D-Kultur und Differenzierung der primären acinar Zellen zu Duktuszellen viele Vorteile gegenüber anderen Systemen. Mit der Technik hierin ist die Modulation der Proteinexpression einfach und schnell, erfordert nur einen Tag zu isolieren, zu stimulieren oder Viral infizieren und Kultivierung der primäre acinar Zellen untersuchen die ADM-Prozess zu beginnen. Im Gegensatz zu mit Basalmembran Matrix, die Aussaat des acinar Zellcluster im Kollagen ich extrazellulären Matrix ermöglicht acinar Zellen behalten ihre acinar Identität vor Manipulation. Dies ist wichtig, beim Testen des Beitrags der verschiedenen Komponenten zur Induktion von ADM. Nicht nur sind die Effekte der Zytokine oder andere ectopically verabreichten Faktoren testbar durch diese Technik, sondern der Beitrag der gemeinsamen Mutationen, erhöhte Protein-Expression oder Knockdown von Protein-Expression ist überprüfbar über virale Infektion der primäre acinar Zellen, mit adenoviralen oder Lentivirale Vektoren. Darüber hinaus können Zellen von Kollagen oder Basalmembran Matrix am Endpunkt wieder isoliert und analysiert werden für Protein-Expression.

Fertigstellung des Protokolls hierin erfolgt innerhalb eines Tages und nach Stimulation, ADM ist in 3-5 Tagen zu sehen. Abbildung 1 zeigt den Ablauf des Verfahrens, wobei die Schritte 1 bis 4 am ersten Tag abgeschlossen sind. Dazu gehören Vorbereitung, acinar Isolation, Virusinfektion und Einbettung in Kollagen oder Basalmembran Matrix. Während die Basalmembran Matrix ADM induziert, acinar Zellen innerhalb Kollagen ich benötige einen Reiz, wie TGF-α, unte...

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Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur

Primäre acinar Zelle isoliert, Protein-Expression oder Aktivität-Modulation, Kultur und Downstream-Anwendungen eignen sich reichlich in der Ex Vivo Studie des acinar-duktale Metaplasie (ADM), einem frühen Ereignis in der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs.

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Unser Protokoll bietet eine direkte Visualisierung der Acinar-zu-Ductal Metaplasie und ermöglicht die Untersuchung des Beitrags von ektopisch verabreichten Faktoren oder Proteinmodulation zu diesem Prozess. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Acinar-zu-Ductal Metaplasie in Echtzeit betrachtet werden kann und Zellsignalstudien durchgeführt werden können. Um die Bauchspeicheldrüse von einer eingeschläferten Maus zu sezieren, heften Sie zuerst die Pfoten der Maus an den Polystyroldeckel, orientieren Sie sie so, dass der Schwanz dem Forscher zugewandt ist, und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol.Verwenden Sie autoklavierte Zangen, um das Fell und die Haut an der Mittellinie zu heben, und mit autoklavierter Schere, machen Sie einen Schnitt durch das Fell und die Haut von der Harnröhrenöffnung bis zum Zwerchfell Rippenkäfigbereich. Machen Sie zusätzliche Einschnitte nach links und rechts, um das Fell und die Haut zu schneiden, wodurch eine klare Sicht auf die Bauchhöhle. Dann in die Peritoneal-Futter schneiden, in der Mitte und nach rechts und links und ziehen Sie es weg von den Organen.Verwenden Sie die Zange, um den Darm zu heben und sie auf die linke Seite der Maus zu bewegen, wodurch Platz geschaffen wird, um die hellrosa Bauchspeicheldrüse zu sehen, die an der dunklen, roten, ovalen Milz befestigt ist. Das Bauchspeicheldrüsengewebe wird eine weiche, schwammige Textur haben. Schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse, die entlang des Magens läuft, inVerbindung mit dem Darm.Trennen Sie die Milz von der Bauchspeicheldrüse und legen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein 50-Milliliter-Rohr mit 10 MilliliterHBSS, mit einem Mal Penicillin Streptomycin und übertragen Sie es auf die laminare Strömungshaube. Gießen Sie den Inhalt des Rohres in ein leeres Wägeboot und verwenden Sie Zangen, um die Bauchspeicheldrüse zu waschen, indem Sie sie wirbeln. Dann verwenden Sie die Zange, um die Bauchspeicheldrüse zu einem zweiten Wägeboot mit HBSS mit Penicillin Streptomycin zu bewegen und wieder durch Wirbelwaschen zu waschen.Bewegen Sie die Bauchspeicheldrüse auf das dritte Wägeboot mit HBSS mit Penicillin Streptomycin und beginnen Sie, die Bauchspeicheldrüse in fünf Millimeter oder kleinere Stücke zu schneiden. Um den Inhalt des Wägebootes in ein frisches 50-Milliliter-Rohr zu gießen, verwenden Sie zuerst die Zange, um die Bauchspeicheldrüsenstücke in die Flüssigkeit zu bewegen, während das Boot gekippt wird. Sobald die Teile nicht mehr am Boot befestigt sind, gießen Sie ihren Inhalt in die Röhre.Nehmen Sie alle verbleibenden Teile mit den Zangen auf und waschen Sie die Zange im Rohr. Nachdem Sie das Rohr zwei Minuten lang bei 931-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um den HBSS und jedes schwimmende Fett zu entfernen. Fügen Sie fünf Milliliter Kollagenase in HBSS verdünnt.Schließen Sie das Rohr und stellen Sie einen versiegelten Deckel sicher, indem Sie das Rohr in Eine Paraffinfolie aus Kunststoff einwickeln. Legen Sie es in einen Inkubator, schütteln Bei 220 RPM bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Das ergibt die trübe Lösung und nur noch wenige Gewebestücke.Um die Dissoziation zu stoppen, legen Sie die Röhre auf Eis und fügen Sie fünf Milliliter kalte HBSS mit 5%FBS hinzu. Nach der Zentrifugierung bei 931-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius für zwei Minuten, entfernen Sie den Überstand mit einer Fünf-Milliliter-Pipette. Das Pellet in 10 Milliliter HBSS mit 5%FBS wieder aufhängen und bei 931-facher Schwerkraft für zwei Minuten bei vier Grad Celsius wieder zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand mit einer Fünf-Milliliter-Pipette und wiederholen Sie diesen Schritt mit weiteren 10 MilliliterHBSS mit 5%FBS. Dann setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter HBSS mit 5%FBS wieder auf. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Zellsuspension jeweils einen Milliliter durch ein 500-Mikrometer-Netz in ein 50-Milliliter-Rohr zu filtern.Um alle verbleibenden Bauchspeicheldrüsenzellen durch das Netz zu waschen, fügen Sie weitere fünf Milliliter HBSS mit 5%FBS hinzu. Verwenden Sie dann eine P1000 Pipette, um dieses Filtrat jeweils einen Milliliter durch das 105 Mikrometer-Netz in ein 50-Milliliter-Rohr zu leiten. Pipetten Sie diese Zellsuspension vorsichtig in ein 50-Milliliter-Rohr mit HBSS mit 30%FBS, das oben eine Schicht zellaufhängung bildet.Zentrifugieren Sie diese Zellsuspension bei 233-facher Schwerkraft bei vier Grad Celsius für zwei Minuten und entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet, das die Acinar-Zellen enthält, in einem kompletten Medium von Waymouth wieder auf. Da eine Bauchspeicheldrüse für zwei Virusinfektionen ausreicht, teilen Sie die Zellsuspension zwischen den Deckeln von zwei 35-Millimeter-Platten auf, was eine Infektion in der Suspension ermöglicht.Bei einer adenoviralen Infektion fügen Sie das Virus mit einer Verdünnung von 1/1000 auf den Deckel jeder Platte und wirbeln. Legen Sie die Platten in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%CO2. In der ersten Stunde alle 15 Minuten wirbeln und die Inkubation für weitere zwei Stunden fortsetzen.Um ein Kollagen-Gel herzustellen, kombinieren Sie sieben Milliliter Rattenschwanzkollagen, 700 Mikroliter des 10-fachen Waymouth-Mediums und 466,6 Mikroliter 0,34 Mol-Natriumhydroxid in einer 50-Milliliter-Röhre auf Eis, um Kollagengel herzustellen. In einem 50-Milliliter-Rohr, kombinieren gleiche Volumina von Zellsuspension und Kollagen-Gel nach drei Stunden Inkubation und sanft mischen. Platte 2000 Mikroliter, einer gut nach dem anderen in einer sechs Brunnenplatte, während die Platte auf Eis zu halten und wirbeln, um gleichmäßig die Kollagen-Zellschicht zu verteilen.Um das Medium zu erstarren, inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 30 Minuten. Dann fügen Sie 1,5 Milliliter pro Brunnen von einem Mal Waymouth s komplettes Medium mit gewünschten Stimulus oder Inhibitoren. Ändern Sie das Medium am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag.Je nach verwendeter Stimulus kann Acinar-to-Ductal Metaplasia oder ADM zwischen Tag drei und Tag fünf beobachtet werden. 24 Stunden nach der Infektion mit GFP-Adenovirus, Bilder von Zellen in Kollagen oder Keller Membran Matrix eingebettet, zeigte, dass die Infektion effizient war. Fünf Tage nach der Infektion bildeten in Kollagen eingebettete Zellen kanalähnliche Strukturen, wenn sie mit 50 Nanogramm pro Milliliter TGF-Alpha stimuliert wurden.Zellen, die in die Kellermembranmatrix eingebettet sind, bildeten kanalähnliche Strukturen, wenn an fünf Tagen nach der Infektion kein Stimulus zur Folge hatte. Während größere Kanäle bei Stimulation mit 50 Nanogramm pro Milliliter TGF alpha gebildet wurden. Einer der kritischsten Punkte im Protokoll ist die Länge der Kollagenaseverdauung.Die richtige Verdauung wird durch eine trübe Lösung und wenige verbleibende Gewebestücke angezeigt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ein Protokoll für schnelle Post-mortem-Zellkultur von Diffuse Intrinsic Ponsgliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Forschung

Krebsforschung

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Verdunstungsmindernde Kultur Zustand Erhöht die Reproduzierbarkeit von mehrzelligen Sphäroidformation in Mikrotiterplatten

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

Ein orthotopisches Resektions-Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robotergestützte distale Pankreatektomie mit Zöliakie-Achsenresektion (DP-CAR) bei Bauchspeicheldrüsenkrebs: Operationsplanung und -technik

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...