Name: mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture
Uploaded: 2019-02-11T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en R01 grant (CA200572) fra NIH til PS. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Cancer Institute eller den nasjonale institutter Health.The organer ikke hadde noen rolle i studie design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere, eller manuskriptet.

Alle dyr arbeid ble godkjent av Mayo Clinic IACUC.
1. utarbeidelse av materialer, løsninger og 3-dimensjonale Matrix baser
<ol><li>Cut 500 µm og 105 µm polypropylen maskene til 76 mm ved 76 mm firkanter. Brett hver rute halvparten to ganger for å opprette en mindre brettet firkant. Sted en 500 µm og en 105 µm maske square i en autoclavable-posen.</li>
	<li>Autoclave polypropylen maske firkanter, samt to par saks og tang.</li>
	<li>
Gjøre 100 mL 10 x Waymouths løsning. Rør 1 ...

<ol>
	<li>Rooman, I., Real, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma+and+acinar+cells:+a+matter+of+differentiation+and+development.">Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development.</a> Gut. 61 (3), 449-458 (2012).</li><li>Stanger, B. Z., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+identity+in+pancreas+development+and+regeneration.">Control of cell identity in pancreas development and regeneration.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).</li><li>Caldas, C., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K-ras+mutation+and+pancreatic+adenocarcinoma.">K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma.</a> International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Sox9-dependent+acinar-to-ductal+reprogramming+as+the+principal+mechanism+for+initiation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).</li><li>Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+blocks+Kras-dependent+reprogramming+of+acini+into+pancreatic+cancer+precursor+lesions+in+mice.">Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).</li><li>Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+pancreatic+neoplasia+of+ductal+phenotype+induced+by+acinar+cell+targeting+of+mutant+Kras+in+transgenic+mice.">Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice.</a> Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).</li><li>Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+7+controls+pancreatic+acinar+cell+transdifferentiation+by+activating+the+Notch+signaling+pathway.">Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-secreted+cytokines+drive+pancreatic+acinar-to-ductal+metaplasia+through+NF-kappaB+and+MMPs.">Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs.</a> Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).</li><li>De La, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Kras+reprogram+pancreatic+acinar+cells+to+ductal+intraepithelial+neoplasia.">Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).</li><li>Habbe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+induction+of+murine+pancreatic+intraepithelial+neoplasia+(mPanIN)+by+acinar+cell+targeting+of+oncogenic+Kras+in+adult+mice.">Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).</li><li>Liou, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+KRas-Induced+Mitochondrial+Oxidative+Stress+in+Acinar+Cells+Upregulates+EGFR+Signaling+to+Drive+Formation+of+Pancreatic+Precancerous+Lesions.">Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions.</a> Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).</li><li>Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+using+unauthenticated,+over-passaged+cell+lines:+how+much+more+data+do+we+need.">The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need.</a> Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).</li><li>Gout, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+primary+pancreatic+acinar+cells.">Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+cytoskeletal+organization+of+invasive+cancer+cells+in+3D.">Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).</li></ol>

Den relativt kort tidsperiode for isolasjon, infeksjon og plating primære acinar celler er en fordel med denne metoden. Derimot dyrking acinar celler fra en explant utvekst krever lite hands-on tid, men det tar sju dager for resultatet av acinar celler13. En alternativ protokoll for acinar isolasjon14 notater en svært kort metode for å få acinar celler. men er EGF en viktig komponent i å holde acinar cellene i live når isolert bruker denne protokollen. Siden EGF stimu...

Acinar til ductal Metaplasi (ADM) er en beskyttende mekanisme pankreatitt og en viktig prosess kjører bukspyttkjertelkreft utvikling1 som krever ytterligere mekanistisk innsikt. Mens betennelse-indusert ADM er reversibel2, hindre kreftfremkallende KRAS mutasjoner, som finnes i 90% av bukspyttkjertelkreft tilfeller3, differensiering tilbake til en acinar fenotypen4,5, 6. Culturing og skille primære acinar celler i ductal celler i 3D kultur tillater studie av molekylære mekanismer regulere ADM prosessen, som er vanskelig å studere i vivo. Slike ex vivo studier aktiverer sanntids visualisering av ADM, driverne og sine regulatorer. Flere drivere av ADM prosessen, samt mekanistisk innsikt i deres nedstrøms signalveier, har blitt identifisert eller bekreftet bruker her beskrevet metoden. Disse inkluderer ADM induksjon av TGF-î± (alfa-transformere vekstfaktor)-mediert uttrykk for MMP-7 (matrise metalloproteinase-7) og aktivering av hakk7, samt RANTES (reguleres på aktivisering, normal T celle uttrykt og utskilles; også kjent som chemokine ligand 5 eller CCL5) og TNFα (tumor nekrose faktor alfa)-indusert ADM gjennom aktivering av NF-κB (kjernefysiske faktor-κB)8. En ekstra formidler av ADM er kreftfremkallende KRas9,10, som fører til en økning i oksidativt stress som forbedrer ADM prosessen gjennom økt uttrykk for EGFR (epidermal vekstfaktor reseptor) og dens ligander, EGF ( epidermal vekstfaktor) og TGF-α11.
Bruk av bukspyttkjertelkreft linjer er vanlig for in vitro studier, tilby primært cellekulturer mange fordeler. For eksempel, primære acinar celler fra ikke-transgene mus eller mus skjuler initiering mutasjoner, som KrasG12D, er den mest passende modellen for å studere hendelsen tidlig for ADM fordi cellene har noen og kontrollert mutasjoner, som kjent for å være tidlig i bukspyttkjertelkreft utvikling. Dette er i kontrast til mange bukspyttkjertelkreft cellelinjer som har flere mutasjoner og variert uttrykk basert på passering nummer12. I tillegg har signalveier identifisert av slike midler blitt bekreftet av dyrestudier. En påminnelse ved å bruke primære acinar celler er at de ikke kan være transfected som typisk kreftcelle linjer kan.
Metoden her detaljer teknikker av acinar cellen aisolering, 3D kultur som etterligner ADM ved å legge sentralstimulerende midler eller modulerende protein uttrykk via adenoviral eller lentiviral, samt re isolering av celler på endepunktet for videre analyser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2181px;" width="2179">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">37 &#176;C shaking incubator</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SHKE4000-7</td>
			<td style="width:1487px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:357px;">5% CO2, 37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:167px;">NUAIRE</td>
			<td style="width:171px;">NU-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">50 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Absorbent pad, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">1420662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Adenovirus, Ad-GFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:171px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">BD Precision Glide Needle 21G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">305167</td>
			<td>Use as pins for dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Beaker, 600 mL</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">FB-101-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bleach, 8.25%</td>
			<td style="width:167px;">Clorox</td>
			<td style="width:171px;">31009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell Recovery Solution</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354253</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix recovery solution&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Collagenase Type I, Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C0130-1G</td>
			<td>Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D1756</td>
			<td>Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:167px;">Decon Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:171px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F0926-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91127-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glass slide, 8-well</td>
			<td style="width:167px;">Lab-Tek</td>
			<td style="width:171px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH3048801</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ice bucket, rectangular</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:171px;">07-210-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">01-812-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Minigrip</td>
			<td style="width:171px;">SBL2X69S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lentiviral Packaging Mix, Virapower</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">44-2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Matrigel</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">356234</td>
			<td>Referred to as &#39;basement membrane matrix&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Parafilm</td>
			<td style="width:167px;">Bemis</td>
			<td style="width:171px;">PM992</td>
			<td>Referred to as &#39;plastic paraffin film&#39; in the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 10 &#181;l</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1110-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 1000 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Olympus Plastics</td>
			<td style="width:171px;">24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet tips, 200 &#181;l&#160;</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:171px;">1111-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipet-Aid</td>
			<td style="width:167px;">Drummond</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P10, 1-10 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P20, 2-20 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PIPETMAN Classic P200, 20-200 &#956;l</td>
			<td style="width:167px;">Gilson</td>
			<td style="width:171px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 10 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 25 ml</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pipettes, 5 ml&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 12-well</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 24-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:171px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Plate, 6-well</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:171px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:171px;">TR-1003-G</td>
			<td>Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 105 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Polypropylene Mesh, 500 &#181;m&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:171px;">146418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">14568-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:171px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:171px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:357px;">Soybean Trypsin Inhibitor 8</td>
			<td style="width:167px;">Gibco</td>
			<td style="width:171px;">17075029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Spatula</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TGF-&#945;</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:171px;">239-A-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Type I Rat Tail Collagen</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:171px;">354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Waymouth MB 752/1 Medium (powder)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">W1625-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Weigh boat, hexagonal, medium&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:171px;">02-202-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mimicking and manipulating pancreatic acinar-to-ductal metaplasia in 3-dimensional cell culture

Differensiering av acinar celler ductal celler under pankreatitt og i den tidlige utviklingen av bukspyttkjertelkreft er en viktig prosess som krever videre studier. For å forstå mekanismene gir regulerer acinar til ductal Metaplasi (ADM), ex vivo 3D kultur og differensiering av primære acinar celler ductal celler mange fordeler over andre systemer. Med teknikken her er modulering av protein uttrykk enkel og rask, krever bare én dag å isolere, stimulere eller virally infisere og begynne dyrking primære acinar celler for å undersøke ADM prosessen. I motsetning til hjelp av kjelleren membran matrise, den såing av acinar celle klynger i kollagen jeg ekstracellulær matrix, lar acinar celler å beholde sin acinar identitet før manipulering. Dette er viktig når testing bidrag av ulike komponenter til induksjon av ADM. Ikke bare er effekten av cytokiner eller andre ectopically administrert faktorer testbare gjennom denne teknikken, men bidraget fra vanlige mutasjoner, økt protein uttrykk eller knockdown protein uttrykk er testbare via viral infeksjon av primære acinar celler, ved hjelp av adenoviral eller lentiviral vektorer. Videre celler kan være nytt isolert fra kollagen eller kjelleren membran matrise på sluttpunktet og analysert for protein uttrykk.

Gjennomføring av protokollen her skjer innen en dag og ved stimulering, ADM er sett i 3-5 dager. Figur 1 viser en rekke metoden der trinn 1 til 4 er fullført på den første dagen. Dette inkluderer forberedelse, acinar isolasjon, virusinfeksjon og forankring i kollagen eller kjelleren membran matrix. Mens kjelleren membran matrix induserer ADM, acinar celler i kollagen jeg kreve en stimulans, som TGF-α, gjennomgå differensiering ductal celler. På dag 1, ...

Watch this Scientific Journal Video about Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture at JoVE.com

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Etterligne og manipulere bukspyttkjertelen Acinar til Ductal Metaplasi i 3-dimensjonale cellekultur

Primære acinar cellen aisolering, protein uttrykk eller aktivitet modulasjon, kultur og ned-stream programmer er helt nyttig i ex vivo studie av acinar til ductal Metaplasi (ADM), en tidlig hendelse i utviklingen av bukspyttkjertelkreft.

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Vår protokoll tilbyr direkte visualisering av Acinar-to-Ductal Metaplasia og tillater studiet av bidrag av ektopisk administrerte faktorer eller proteinmodulering til denne prosessen. Den største fordelen med denne teknikken er at Acinar-to-Ductal Metaplasia kan sees i sanntid og cellesignalstudier kan utføres. For å dissekere bukspyttkjertelen fra en eutanisert mus, fest først musens poter til polystyrenlokket, orienterer det slik at halen vender mot forskeren og sprayer magen med 70% etanol.Bruk autoklavert tang for å løfte pels og hud på midtlinjen, og med autoklavet saks, gjør et snitt gjennom pels og hud fra urinrøret åpningen til membranen ribbebur området. Gjør ekstra snitt til venstre og høyre for å kutte bort pels og hud, og skape en klar utsikt over bukhulen. Deretter skjærer du inn i det bukhinneale fôret, ned i midten og til høyre og venstre og trekker det bort fra organene.Bruk tangen til å løfte tarmene og flytte dem til venstre side av musen, og skape plass til å se den lysrosa bukspyttkjertelen festet til den mørke, røde, ovale milten. Bukspyttkjertelvevet vil ha myk, svampete tekstur. Klipp ut bukspyttkjertelen, som går langs magen, sammenflettet med tarmene.Skill milten fra bukspyttkjertelen og legg bukspyttkjertelen i et 50 milliliter rør som inneholder 10 milliliter HBSS, med en gang penicillin streptomycin og overfør den til laminær strømningshette. Hell innholdet i røret i en tom veiebåt og bruk tang til å vaske bukspyttkjertelen ved å virvle den. Deretter bruker du tangen til å flytte bukspyttkjertelen til en annen veiebåt som inneholder HBSS med penicillin streptomycin og vask igjen ved å virvle.Flytt bukspyttkjertelen til den tredje veiebåten som inneholder HBSS med penicillin streptomycin og begynn å kutte bukspyttkjertelen i fem millimeter eller mindre stykker. For å helle innholdet i veiebåten i et friskt 50 milliliter rør, bruk først tangene til å flytte bukspyttkjertelbitene inn i væsken når båten tippes. Når bitene ikke lenger er festet til båten, hell innholdet i røret.Plukk opp eventuelle gjenværende stykker med tangen og vask tangene i røret. Etter å ha sentrifugert røret ved 931 ganger tyngdekraften ved fire grader Celsius i to minutter, bruk en fem milliliter pipette for å fjerne HBSS og flytende fett. Tilsett fem milliliter kollagenase fortynnet i HBSS.Lukk røret og sørg for et forseglet lokk ved å pakke røret i plastparafinfilm. Plasser den i en inkubator, rist ved 220 RPM ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Som vil gi den uklare løsningen, og få gjenværende vevsstykker.For å stoppe dissosiasjonen, legg røret på is og tilsett fem milliliter kald HBSS med 5% FBS. Etter sentrifugering på 931 ganger tyngdekraften på fire grader Celsius i to minutter, fjern supernatanten ved hjelp av en fem milliliter pipette. Re-suspendere pellet i 10 milliliter HBSS med 5% FBS, og sentrifuge igjen på 931 ganger tyngdekraften i to minutter ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten ved hjelp av en fem milliliter pipette og gjenta dette trinnet med ytterligere 10 milliliter HBSS med 5% FBS. Deretter re-suspendere pellet i fem milliliter hbss med 5% FBS. Bruk en P1000 pipette til å filtrere cellefjæringen ett milliliter om gangen gjennom et 500 mikrometernett i et 50 milliliter rør.For å vaske eventuelle gjenværende bukspyttkjertelceller gjennom nettet, legg til ytterligere fem milliliter HBSS med 5% FBS. Bruk deretter en P1000 pipette til å passere denne filtratet ett milliliter om gangen gjennom 105 mikrometernettet til et 50 milliliter rør. Pipette denne cellefjæringen forsiktig i et 50 milliliter rør som inneholder HBSS med 30% FBS, som vil danne et lag med cellefjæring øverst.Sentrifuge denne celle suspensjon på 233 ganger tyngdekraften på fire grader Celsius i to minutter og fjerne supernatant. Suspender pelleten som inneholder Acinar-cellene på en gang Waymouths komplette medium. Siden en bukspyttkjertel er tilstrekkelig for to virusinfeksjoner, del cellesuspensjonen mellom lokkene på to 35 millimeter plater, noe som gjør det mulig for infeksjon i suspensjon.For adenoviral infeksjon, tilsett viruset ved en 1/1000 fortynning til lokket på hver plate og virvle. Plasser platene i en cellekultur inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Virvle hvert 15 minutt i den første timen og fortsett inkubasjonen i ytterligere to timer.For å lage en kollagengel, kombiner syv milliliter av type en rottehalekollagen, 700 mikroliter av 10 ganger Waymouths medium og 466,6 mikroliter av 0,34 molar natriumhydroksid i et 50 milliliter rør på is for å lage kollagengel. I et 50 milliliter rør kombinerer du like mengder cellefjæring og kollagengel etter tre timers inkubasjon og bland forsiktig. Plate 2000 mikroliter, en brønn om gangen i en seks brønnplate mens du holder platen på is og virvler for å fordele kollagencellelaget jevnt.For å størkne mediet, inkuber platen i en cellekultur inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 30 minutter. Tilsett deretter 1,5 milliliter per brønn av en gang Waymouths komplette medium med ønsket stimulans eller hemmere. Endre mediet neste dag og deretter annenhver dag.Avhengig av stimulansen som brukes, kan Acinar-to-Ductal Metaplasia eller ADM observeres mellom dag tre og dag fem. 24 timer etter infeksjon med GFP adenovirus, bilder av celler innebygd i kollagen eller kjellermembranmatrise, viste at infeksjonen var effektiv. På fem dager etter infeksjon, celler innebygd i kollagen dannet duct-lignende strukturer når stimulert med 50 nanograms per milliliter TGF alfa.Celler innebygd i kjellermembranmatrise dannet kanallignende strukturer i fravær av en stimulans på fem dager etter infeksjon. Mens større kanaler ble dannet ved stimulering med 50 nanograms per milliliter TGF alfa. Et av de mest kritiske punktene i protokollen er lengden på kollagenasefordøyelsen.Riktig fordøyelse er indikert av en uklar løsning og få gjenværende vevsstykker.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Fordampning reduserende Kultur Forhold Øker reproduserbarhet av Flercellede spheroid Dannelse i mikrotiterplater

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Forberedelse og metabolske analysen av 3-dimensjonale Spheroid co kulturer av kreft i bukspyttkjertelen celler og fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi Testing i en Spheroid-basert 3D celle kultur modell for hodet og nakken Squamous celle Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering av Stem-lignende celler fra 3-dimensjonale spheroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Overvåking av kreftcelleinvasjon og T-celle cytotoksisitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

En ortotopisk reseksjonell musemodell av kreft i bukspyttkjertelen

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robotassistert distal pankreatektomi med celiac akse reseksjon (DP-CAR) for bukspyttkjertelkreft: Kirurgisk planlegging og teknikk

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablering av 3-dimensjonale sfæroider fra pasientavledede tumorprøver og evaluering av deres følsomhet overfor legemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...