Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها "فينانزيامينتو di اتينيو دي ريشيركا" للأم باكسيجالوبي، عنوان المشروع "وضع SP: الجراثيم البكتيرية كمنصة لايف لعرض البروتينات".

1-الامتزاز رد فعل
<ol><li>احتضان 2 و 5 و 10 ميكروغرام من مرفب مع 2 x 109 باء-نجحت البرية من نوع الجراثيم المنقاة في 200 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت، وسترات الصوديوم 50 مم، pH 4.0 (16.7 مم سترات الصوديوم ثنائي هيدرات؛ حمض الستريك 33.3 مم) ح 1 عند 25 درجة مئوية على شاكر هزاز (الشكل 1) .</li>...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

هذا البروتوكول الامتزاز بوغ جداً بسيط ومباشر. أن رد الفعل يعتمد كلياً على درجة الحموضة من رد فعل المخزن المؤقت وكفاءة الامتزاز الأمثل في قيم الأس الهيدروجيني الحمضية (pH 5.0 أو أقل). في ظروف الأس الهيدروجيني المحايدة، وكفاءة الامتزاز منخفض، وفي قيم الأس الهيدروجيني قلوية، وقد لا يحدث الامتز?...

عرض النظم تهدف إلى تقديم النشيطة بيولوجيا الجزيئات على السطح للكائنات الحية الدقيقة وإيجاد التطبيقات في مجموعة متنوعة من المجالات، من الصناعي للتكنولوجيات الأحيائية الطبية والبيئية. وبالإضافة إلى فاجيس1،2 وخلايا مختلفة الغرام-وإيجابية الأنواع3،4،5،،من67، كانت أيضا الجراثيم البكتيرية اقترحه كأنظمة العرض نهجين8،9.
بسبب هيكلها غريبة، هي المجففة السيتوبلازم محاطة بسلسلة من10من طبقات واقية، بوغ يوفر العديد من المزايا بالعاثية-ويستند إلى الخلية عرض نظم8،9. ميزة أولى يأتي من الشدة القصوى واستقرار الجراثيم في الظروف التي تكون ضارة لكل أخرى الخلايا10،11. عرض بوغ المستضدات والأنزيمات مستقرة بعد التخزين في درجة حرارة الغرفة12 لفترات طويلة، والحماية من تدهور في درجة الحموضة منخفضة وارتفاع درجات الحرارة13. وميزة ثانية للجراثيم هو سلامة العديد من الأنواع تشكيل بوغ. باء-نجحت، كلاوسي، كواجولانس باء، والعديد من الأنواع الأخرى المستخدمة في جميع أنحاء العالم البروبيوتيك وقد تم في السوق للاستخدام البشري أو الحيواني لعقود14،15. هذا سجل سلامة استثنائية شرط عامة واضحة لنظام عرض سطحي ويتسم بأهمية خاصة عند النظام معد للاستخدام البشري أو الحيواني16. ثالث، هو ميزة هامة لنظام العرض القائم على بوغ أن ليس لديه قيود الحجم جزيء التي قد يتعرض. في الأنظمة المستندة إلى بالعاثية، بروتين مغايرة كبيرة قد تؤثر على الهيكل من قفيصه، بينما في الأنظمة المستندة إلى الخلية، فإنه قد تؤثر على هيكل الغشاء أو قد حد/تنال الخطوة إزفاء غشاء17. الطبقات الواقية المحيطة بوغ تتألف من أكثر من 70 البروتينات المختلفة10 وهي مرنة بما يكفي لقبول كبير البروتينات الخارجية دون أي خلل هيكلي واضح أو إعاقة وظيفية8. وبالإضافة إلى ذلك، مع كل أنظمة العرض القائم على بوغ، إزفاء غشاء من البروتين مغايرة ليس مطلوب8،9. في الواقع، البروتينات مغايرة هي أما أنتجت في السيتوبلازم الخلية الأم وتجميعها في بوغ أن يتشكل في السيتوبلازم نفسه أو تمتز على8،بوغ ناضجة9.
في البداية حصل عرض بوغ وضع نظام وراثية مهندس السطحية سبور18. يستند هذا النظام الوراثي أنا) بناء التحام الجينات بين ترميز الجينات لبروتين معطف سبور (تستخدم ناقل) وترميز الجينات للبروتين أن يكون عرض-وجود إشارات النسخي ومتعدية الجنسيات ذاتية سيتم التحكم في الجينات تعبير الانصهار، والثاني) التكامل تشيميريك الجينات على كروموسوم ب-نجحت منح الاستقرار الوراثي. وقد تم عرض مجموعة متنوعة من مولدات المضادات، والأنزيمات بهذا النهج المؤتلف، استخدام مختلف البروتينات السطحية بوغ الناقلين وتهدف مختلف التطبيقات المحتملة، تتراوح بين لقاح المخاطية بيوكاتاليست، بيوسينسور، والمعالجة البيولوجية، أو بيواناليتيكال أداة8،13.
في الآونة الأخيرة، تم اتباع نهج مختلف لعرض سبور19من البلدان المتقدمة النمو. هذا النظام الثاني هو نونريكومبينانت، ويعتمد على الامتزاز عفوية وضيق للغاية من الجزيئات على السطح سبور9. المستضدات19،20 والأنزيمات13،21 أظهروا كفاءة وقد كشفت عن أن هذا الأسلوب إلى حد كبير أكثر كفاءة من المؤتلف. هذا النهج نونريكومبينانت يتيح عرض البروتينات في النموذج الأصلي20 ويمكن أن تستخدم أيضا مع يعقم، وموت الجراثيم19. الآلية الجزيئية الامتزاز لم تماما يتضح حتى الآن. شحنة سالبة و hydrophobicity بوغ اقترحت كخصائص ذات صلة لل19،13،الامتزاز22. في الآونة الأخيرة، قد ثبت أن نموذج بروتين، البروتين أوتوفلوريسسينت الأحمر (مرفب) للشعاب المرجانية ديسكوسوما، عندما تمتز إلى بوغ، تمكنت من التسلل عبر الطبقات السطحية إضفاء الطابع المحلي في معطف الداخلية23. الترجمة الداخلية من البروتينات مغايرة إذا ثبت صحيحاً للبروتينات الأخرى، يمكن أن يفسر زيادة الاستقرار عندما تمتز إلى جراثيم23.
في دراسة أجريت مؤخرا، عامين الإنزيمات تحفيز الخطوات المتتابعة اثنين من مسار التدهور زيلان تم عرضها بشكل مستقل على جراثيم من باء-نجحت ، وعندما المحتضنة معا، كانت قادرة على القيام بكل الخطوات تدهور21. الجراثيم التي جمعت بعد رد فعل كانت لا تزال نشطة وقادرة على مواصلة تدهور زيلان عند إضافة الركازة جديدة21. حتى لو كان قد لوحظ فقدان حوالي 15% المنتج النهائي في الرد الثاني21، إعادة استخدام الإنزيمات الممتزة لردود فعل واحد، فضلا عن الخطوة متعددة، ميزة هامة إضافية من نظام العرض بوغ.
وأفادت عموم et al.24 نهج إضافية لعرض مغايرة البروتينات على سطح بوغ: البروتينات مغايرة (بروتين اندوجلوكاناسي وبيتا-جالاكتوسيداسي واحدة) تنتج في الخلية الأم خلال تبوغ كانت عفوية المغطى في تشكيل معطف بوغ، دون الحاجة إلى الناقل. هذا النظام عرض إضافية بوغ مزيج من النهجين وصف حتى الآن. وفي الواقع، أنها المؤتلف منذ كانت هندسة البروتينات مغايرة ليمكن التعبير عنها في الخلية الأم خلال تبوغ، بينما كانت هذه الجمعية داخل المعطف عفوية، ومن ثم نونريكومبينانت24. ومع ذلك، يظل كفاءة عرض هذا النهج الإضافية لفحصها ومقارنة مع هذين النهجين الآخرين باستخدام نفس البروتينات مغايرة.
هذا البروتوكول لا يشمل عمليات إنتاج بوغ وتنقية، التي وصفت على نطاق واسع في أماكن أخرى24. يتضمن رد فعل الامتزاز، تقييم كفاءة الامتزاز بالفحص المجهري النشاف دوت والأسفار، وجولات إعادة التدوير للإنزيمات الممتزة لإضافية للرد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

بوغ البكتيرية خلية أيضي هادئة، يتكون من سلسلة من الطبقات الواقية المحيطة السيتوبلازم المجففة. يجعل في بوغ مستقرة للغاية ومقاومة هذا الهيكل غريبة وقد اقترح استخدام بوغ كمنصة لعرض جزيئات مغايرة. وحتى الآن، تم عرض مجموعة متنوعة من مولدات المضادات، والأنزيمات على أبواغ عصيات نجحت ، وعدد قليل من الأنواع الأخرى، في البداية بنهج المؤتلف، ومن ثم، باستخدام أسلوب نونريكومبينانت بسيطة وفعالة. ويستند نظام العرض نونريكومبينانت الامتزاز المباشر من جزيئات مغايرة على السطح بوغ، تجنب بناء سلالات المؤتلف والإفراج عن البكتيريا المعدلة وراثيا في البيئة. استقرت الجزيئات الممتزة والمحمية بالتفاعل مع الجراثيم، مما يحد من التدهور السريع لمولدات المضادات، والخسارة في نشاط إنزيم في ظروف غير مواتية. متى تستخدم، يمكن جمعها بسهولة مع تخفيض الحد أدنى من نشاط الإنزيمات تمتز بوغ واستخدامها لجولات إضافية للرد. يرد في هذه الورقة كيف أن الجسميات الجزيئات النموذجية لجراثيم المنقي من باء-نجحتوكيفية تقييم كفاءة الامتزاز وكيفية جمع الجراثيم المستخدمة إعادة تدويرها لردود فعل جديدة.

ويمكن تقييم الامتزاز ناجحة من النشاف الغربية. بناء على رد فعل، هذا الخليط هو مجزأ بالطرد المركزي وغسلها، والكسر بيليه (الشكل 1) ويستخدم لاستخراج البروتينات السطحية. الاستخراج مجزأ من الحزب الديمقراطي الصربي polyacrylamide هلام التفريد (صفحة)، اليكتروترانسفيريد...

Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

ويركز هذا البروتوكول على استخدام الجراثيم البكتيرية كأداة نانوبيوتيتشنولوجيكال "حية" الجسميات جزيئات مغايرة مع مختلف الأنشطة البيولوجية. وترد أيضا أساليب لقياس كفاءة الامتزاز.

الامتزاز بوغ كنظام عرض نونريكومبينانت للإنزيمات والمضادات

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

الجراثيم البكتيرية الحية عرض مستضد أو الإنزيمات هي الجسيمات النانوية النشطة وظيفيا التي يمكن استخدامها كلقاحات المخاطية أو الكائنات الحيوية. من حيث المبدأ ، يمكن أن يكون أي بروتين مُمتزاً بكفاءة إلى جراثيم. هذه التقنية بسيطة ولا تتطلب أي تلاعب وراثي.ولذلك، لا ينطوي على إطلاق الكائنات المؤتلفة في البيئة. بالإضافة إلى علم الفاكراسة المخاطية للبشر والحيوانات، يمكن تطوير الجراثيم التي تعرض الإنزيمات باعتبارها تربية حيوية قابلة لإعادة الاستخدام. تبدأ من خلال وضع العلامات مرتين 10 إلى التاسع B.subtilis البرية من النوع الجراثيم النقية مع تركيزات اثنين خمسة أو 10 ميكروغرام من نموذج RFP في 200 ميكرولترات من العازلة ملزمة تستكمل مع سترات الصوديوم 50 ملليمولار لمدة ساعة واحدة في 25 درجة مئوية على شاكر هزاز.في نهاية الحضانة، بيليه الخلائط ملزمة عن طريق الطرد المركزي، ونقل المابس إلى أنابيب مخروطية جديدة لتحليل كفاءة الامتزاز اللاحقة. ثم، وغسل الكريات بوغ مرتين مع 200 ميكرولترات من العازلة ملزمة لكل غسل، resuspending الكريات في 100 ميكرولترات من العازلة ملزمة جديدة بعد الغسيل الثاني. لاستخراج البروتين السطحي، إضافة 50 ميكرولترات من كل اضمح اإمتزاز spore resuspension إلى 50 ميكرولترات من 2X الصوديوم دوديسيل كبريتات-dithiothreitol ل solubilize البروتينات البوغ السطح.بعد 45 دقيقة في 65 درجة مئوية، وجمع الخلائط عن طريق الطرد المركزي، وتشغيل 10 ميكرولترات من كل حجم من البروتينات المستخرجة supernatant على لطخة غربية، وذلك باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة له الاعتراف له الوسم الحاضر في N-terminus من mRFP لتحديد البروتينات السطحية المسمى. لتوطين وقياس الجزيئات الممتزة عن طريق المجهر الفلوريس، إضافة خمسة ميكرولترات من spore مضمّنة resuspension إلى 95 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وإضافة خمسة ميكرولترات من كل تعليق الناتجة على شرائح المجهر الفردية. ضع غطاءً متعدد الليسين يعالج على كل شريحة، ووضع شريحة واحدة على مرحلة مجهر الفلوريسين.ثم، لكل حقل، حفظ الطور النقيض وفلوريسنس صور المجهر. لتحليل الصور، افتح صور المجهر الفلوريس في ImageJ، وحدد صورة ونوع لتأكيد أن جميع الصور في تنسيق ثمانية بت. من القائمة تحليل، حدد تعيين القياسات، وتأكد من تحديد المنطقة، الكثافة المتكاملة، و متوسط قيمة الرمادي.استخدم أداة رسم أو تحديد لرسم خط حول بوغ الاهتمام، وحدد قياس من القائمة تحليل. سيظهر مربع منبثق مع كومة من القيم لـ بوغ المحدد. بعد ما لا يقل عن 50 الجراثيم قد تم اختيار، واختيار عدة مناطق دون أي جراثيم، وتكرار القياس للحصول على قراءة لفلوريسنس الخلفية.بعد الحصول على عدة قياسات خلفية، نسخ كافة البيانات في إطار النتائج في جدول بيانات، وحساب متوسط الكثافة المتكاملة في منطقة الجراثيم المختارة والقيم الفلورية الخلفية للحصول على الفلورس مجموع لكل خلية مصححة. لتقييم كفاءة الامتزاز غير المباشر، تنفيذ ستة شقين التخفيفات التسلسلية من mRFP المنقاة في تركيز 0.5 نانوغرام لكل ميكرولتر إلى حجم نهائي من 250 ميكرولترتر لكل تخفيف في العازلة ملزمة وعدد تجريبي مناسب من اثنين أضعاف التخفيف المسلسل من 100 ميكرولترات من كل عينة فائقة محفوظة تحتوي على mRFP غير منضم من رد فعل الكسر مع 100 ميكروليتر من الربط لكل تخفيف. بعد ذلك، قطع غشاء نيتروسيلولوز مع قطع 0.45 ميكرومتر إلى حجم تسعة في 10 سنتيمترات، لتغطية منطقة خمس عينات من ست نقاط من التخفيف دون تمديد وراء حافة طوقا جهاز لطخة نقطة.ضع غشاء الأعشاب المسبقة في جهاز لطخة النقطة. تحقق من الحجم الصحيح للغشاء ، وإزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين بين الغشاء والحشية. تجميع جهاز لطخة نقطة كما وصفها الشركة المصنعة، وتغطية الجزء غير المستخدم من الجهاز لمنع الهواء من التحرك من خلال تلك الآبار.عندما يكون الجهاز جاهزاً، قم بتحميل المعيار في أكثر الممرات الخارجية العينتين والعينات في الممرات الوسطى مع 100 ميكرولترات من كل تخفيف مناسب في البئر. عندما تم تحميل جميع العينات، قم بتشغيل مضخة الفراغ لمدة دقيقتين، قبل إيقاف الفراغ والسماح للعينات لتصفية من خلال الغشاء عن طريق الجاذبية. بعد 10 دقائق، يغسل كل جيدا مع 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.تشغيل مضخة فراغ لمدة خمس دقائق أخرى. عندما استنزفت العازلة الغسيل تماما من الجهاز، في حين أن الفراغ هو على، وتخفيف مسامير وفتح بعناية جهاز نقطة لطخة. ثم، معالجة الغشاء وفقا لبروتوكولات بقعة الغربية القياسية.لتحليل قياس الكثافة للتصفية، افتح ImageJ و ارسم كل نقطة لقياس الكثافة المتكاملة باستخدام الأمر تحليل، قياس كما هو موضح. لإجراء تصحيح الخلفية للصورة، رسم دائرة في منطقة فارغة، وقياس كثافة المتكاملة كما هو موضح. ربط الكثافة المتكاملة للنقاط القياسية مع كمية البروتين المحملة للحصول على خط المعايرة، واستخدام منحنى المعايرة لاستقراء تركيز mRFP لكل نقطة عينة.ويمكن بعد ذلك حساب تركيز mRFP المتبقي في الكسور غير المنضمة. وجود البروتينات من الحجم المتوقع فقط في الممرات المحملة بمستخرج من الجراثيم الممتزة يدل على تفاعل الامتزاز الناجح. يعتمد التقييم المباشر لكفاءة الامتزاز على البروتين غير المتناهي الذي تم استخدامه ويمكن إجراؤه عن طريق المجهر الفلوري والمنظار السيتوفلوري للكسر الكسر بعد تجزئة تفاعل الامتزاز.يمكن بعد ذلك إجراء التحديد الكمي للإشارات الفلورية الموجودة على الجراثيم باستخدام ImageJ كما هو موضح. ويمكن إجراء تحليل غير مباشر لكفاءة الامتزاز من خلال تحليل نقطة النشاف من الكسر الفائق الذي يحتوي على البروتين غير منضم، والتحليل الكثافة اللاحقة للبروتين غير منضم يسمح الحساب غير المباشر لكمية البروتين الممزخرة على الجراثيم. على الرغم من أنه ، من حيث المبدأ ، يمكن امتصاص أي بروتين لاستخدامه كلقاحات مخاطية أو لقاحات حيوية ، فإن كفاءة الامتزاز تعتمد في الممارسة العملية على مواقع البروتين والخصائص الكيميائية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

وضع علامة سلبية لإختيار a المتحولة الحالة للنسج</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

A طريقة الفرز الجديد للمن التطور الموجه للجراثيم الانزيمات بالحرارة

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

تحليل الطيفي الشامل من المستضدات Glycosphingolipid

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

محمي مستضدات خلايا الدم الحمراء وظيفية بواسطة الغشاء مسمار Polyglycerols Hyperbranched الاتفاق

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

تنقية المقصورة غشاء للتدهور المرتبطة هيولى المستضدات خارجية المنشأ في العرض التقديمي عبر

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

التعبير عن "المستضدات خارجية المنشأ" في لقاح BCG متفطره bovis عبر "زخرفة سطح" عدم الوراثية مع نظام عبدين-البيوتين

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...