Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
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这项工作得到了 "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" 至 L. Baccigalupi 的支持, 项目标题为 "SP-LAY: 细菌孢子作为蛋白质显示的活平台"。

1. 吸附反应
<ol><li>用 2 x 10 9 b 培养2、5和10μg 的 mRFP . 在25°c 的摇摇振动台上, 在200μl 结合缓冲液中, 在50μl 的结合缓冲液中, 在50μm 柠檬酸钠、ph 4.0 (16.7 mm 柠檬酸钠二水; 33.3 mm 柠檬酸) 中, 在1小时内使用..</li>
	<li>离心将结合混合物 (13, 000 x g , 10分钟) 离心为分馏颗粒 (p2、P5 和 p10) 和上清液 (s2、S5 和 s10)。储存上清液, 用于对步骤3.2 中描述的吸附效率?...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

这种孢子吸附协议非常简单和直接。反应严格取决于反应缓冲液的 pH 值, 在酸性 ph 值 (pH 值5.0 或更低) 下, 吸附效率最佳。在中性 pH 条件下, 吸附效率较低, 在碱性 pH 值下, 可能不会发生吸附。在摇摆机上使用 1.5 Ml 管中的200μl 体积 (或保持相似的比例) 获得最佳吸附。
吸附非常紧密, 在相同的反应缓冲液 ph 值下使用缓冲液清洗不会导致吸附蛋白的任何释放。使用碱性缓冲液清...

显示系统旨在在微生物表面呈现生物活性分子, 并在从工业到医疗和环境生物技术等多个领域寻找应用。除了噬菌体1,2和细胞的各种革兰氏阴性和阳性物种3,4,5, 6, 7, 细菌孢子也已提出作为显示系统的两个方法8,9。
由于其特殊的结构, 即脱水的细胞质包围了一系列保护层10,孢子提供了几个优势, 比基于噬体和细胞为基础的显示系统8,9。第一个优势来自孢子在对所有其他细胞 10、11 有害的条件下的极端鲁棒性和稳定性。在室温12下长时间储存后, 显示酶的抗原和酶是稳定的, 在低 ph 值和高温度13下防止降解。孢子的第二个优点是许多孢子形成物种的安全性。b. 枯草、b. clausii、b. 凝血和其他几个物种在世界各地被用作益生菌, 并已在人类或动物市场上销售了14、15.这种特殊的安全记录是表面显示系统的一个明显的一般要求, 在该系统用于人类或动物时尤其重要.基于孢子的显示系统的第三个重要优点是, 它对必须暴露的分子的大小没有限制。在基于噬体的系统中, 大型异源蛋白可能会影响衣壳的结构, 而在细胞基系统中, 可能会影响膜的结构, 或可能会限制/损害膜的移位步骤17。孢子周围的保护层由70多个不同的蛋白质10 组成, 具有足够的灵活性, 可以接受大的外来蛋白质, 而不会出现任何明显的结构缺陷或功能障碍8。此外, 在两种基于孢子的显示系统中, 不需要异源蛋白的膜移位 8,9。事实上, 异源蛋白要么在母细胞细胞质中产生, 并聚集在在同一细胞质中形成的孢子上, 要么吸附在成熟的孢子8,9上。
孢子显示最初是通过开发一个基因工程系统来设计孢子表面 18。这个基因系统是基于 i) 在基因编码为孢子涂层蛋白质 (用作载体) 和基因编码之间的结构在被显示的蛋白质-的存在转录和翻译信号的内源性基因将控制融合的表达, ii) 在b.枯草染色体上整合嵌合基因, 以获得遗传稳定性。这种重组方法显示了各种抗原和酶, 使用各种孢子表面蛋白作为载体, 并针对各种潜在的应用, 从黏膜疫苗到生物催化剂、生物传感器、生物修复, 或生物分析工具8,13。
最近, 开发了一种不同的孢子显示方法.这第二个系统是非重组的, 依赖于分子在孢子表面9上的自发和极其紧密的吸附。抗原19、20和酶13、21已有效显示, 该方法明显高于重组方法。这种非重组方法允许以原生形式20显示蛋白质, 也可与蒸压、死亡孢子19 一起使用。吸附的分子机制尚未得到充分的澄清。提出了孢子的负电荷和疏水性, 作为与吸附13、19、22 有关的特性。最近, 研究表明, 珊瑚瘤的一种模型蛋白, 即红色自荧光蛋白 (mrfp), 吸附在孢子中, 能够通过内涂层中的表面层渗透 23.如果证明其他蛋白质是正确的, 异源蛋白的内部定位可以解释它们在吸附到孢子 23时更高的稳定性。
在最近的一项研究中, 两种催化木兰降解途径连续两个步骤的酶在枯草芽孢杆菌孢子上独立显示, 当一起孵育时, 能够同时完成这两个降解步骤21。反应后收集的孢子仍然活跃, 能够在添加新鲜底物21后继续木兰降解。即使在第二反应21中观察到最终产物约15% 的损失, 单次吸附酶的可重用性以及多步骤的反应也是孢子显示系统的另一个重要优势。
Pan 等人报告了在孢子表面显示异源蛋白的另一种方法: 在孢子过程中, 母细胞产生的异源蛋白 (一种内聚糖酶蛋白和β-半乳糖苷酶) 是自发产生的包裹在成型的孢子涂层, 不需要载体。这种额外的孢子显示系统是迄今为止所描述的两种方法的组合。事实上, 它是重组的, 因为异源蛋白被设计成在孢子过程中在母细胞中表达, 而它们在涂层中的组装是自发的, 因此, 非重组 24.然而, 这种附加方法的显示效率仍有待测试, 并通过使用相同的异源蛋白与其他两种方法进行比较。
本议定书不包括孢子的生产和净化过程, 其他地方对这些过程作了广泛的描述。它包括吸附反应、点印迹和荧光显微镜对吸附效率的评价, 以及吸附酶对其他反应轮的回收利用。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

细菌孢子是一种代谢静止的细胞, 由一系列保护层围绕脱水的细胞质形成。这种特殊的结构使孢子极其稳定和耐药, 并建议使用孢子作为显示异源分子的平台。到目前为止, 在枯草芽孢杆菌和其他几种物种的孢子上都显示了各种抗原和酶, 最初是用重组方法, 然后是用一种简单有效的非重组方法。非重组显示系统是基于在孢子表面直接吸附异源分子, 避免了重组菌株的构建和转基因细菌在环境中的释放。吸附分子通过与孢子的相互作用得到稳定和保护, 从而限制了抗原的快速降解和酶活性在不利条件下的丧失。一旦使用, 孢子吸附酶可以很容易地收集与最小的活性减少和再利用额外的反应轮。本文介绍了如何吸附模型分子对枯草芽孢的纯化, 如何评价吸附效率, 以及如何收集使用过的孢子进行回收, 以获得新的反应。

成功的吸附可以通过西方印迹来评估。反应后, 通过离心和洗涤对混合物进行分离, 并使用颗粒分数 (图 1) 提取表面蛋白质。该提取物由 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 进行分离, 电转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜, 并对原发和二级抗体产生反应。预期大小的蛋白质的存在, 只有在充满吸附孢子提取物的车道上, 就表明吸附反应是成功的 (图 2</s...

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Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

该议定书的重点是利用细菌孢子作为 "活" 纳米生物技术工具来吸附具有各种生物活性的异源分子。并给出了测定吸附效率的方法。

作为酶和抗原的非重组显示系统的孢子吸附

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

显示抗原或酶的活细菌孢子是功能活性纳米粒子，可用作粘膜疫苗或生物催化剂。原则上，任何蛋白质都可以有效地吸附到孢子上。这种技术很简单，不需要任何基因操作。因此，不向环境中释放重组生物体。除了人类和动物的粘膜真空学外，显示酶的孢子还可以开发为可重复使用的生物催化器。首先在200微升结合缓冲液中用2-5或10微克的型号RFP的2-5或10微克的野生类型纯化孢子标记两次10至第九B.subtilis野生型纯化孢子，在摇床上用50毫摩尔柠檬酸钠补充一小时，温度为25摄氏度。在孵化结束时，通过离心对结合混合物进行颗粒化，将超热剂转移到新的锥形管中，以便随后进行吸附效率分析。然后，每次洗涤用200微升的结合缓冲液洗两次孢子颗粒，在第二次洗涤后将颗粒重新用100微升的新鲜结合缓冲液中重新填充。对于表面蛋白提取，将每个吸附孢子的50微升重新吸收到50微升的2X二苯丙酸钠-二硫磷，使表面孢子蛋白溶解。在65摄氏度下45分钟后，通过离心收集混合物，并在西印上运行每卷提取的蛋白质上清液的10微升，使用单克隆抗他抗体识别在MRFPN术语N-1inus的他的标签，以识别标记的表面蛋白质。要通过荧光显微镜对吸附分子进行定位和定量化，在PBS的95微升中加入5个吸附孢子再悬浮的微升，并在单个显微镜幻灯片上添加5微升。将聚 L-Lysine 处理的盖玻片放在每张幻灯片上，然后将一张幻灯片放在荧光显微镜舞台上。然后，对于每个字段，保存相位对比度和荧光显微镜图像。对于图像分析，请在 ImageJ 中打开荧光显微镜图像，然后选择"图像"和"类型"以确认所有图像的八位格式。从"分析"菜单中，选择"设置测量"，并确认选择了"面积、集成密度"和"平均灰色"值。使用绘图或选择工具围绕感兴趣的孢子绘制一条线，然后从"分析"菜单中选择"测量"。将出现一个弹出窗口，其中显示所选孢子的值堆栈。选择至少50个孢子后，选择几个没有任何孢子的区域，然后重复测量以获得背景荧光的读数。获得多个背景测量后，将结果窗口中的所有数据复制到电子表格中，并计算选定孢子区域中集成密度的平均值和背景荧光值，以获得校正的每个细胞荧光总量。对于间接吸附效率评估， 以每微升0.5纳米的浓度进行六次纯化mRFP的两倍序列稀释，最终每稀释250微升，并适当实验每个保留的上清样品的100微升，包含吸附反应的未绑定mRFP分数，每微升100微升的附着缓冲液。接下来，将一个0.45微米切口的硝基纤维素膜切成9到10厘米大小，覆盖一个五样本六点的稀释区域，而不会延伸到点印装置垫片的边缘之外。将预编织膜放在点印装置中。检查膜的正确尺寸，并清除夹在膜和垫片之间的任何气泡。按照制造商的说明组装点印装置，并覆盖设备未使用的部分，以防止空气通过这些孔。当设备准备就绪时，将标准加载到两个最外部的通道中，将样品加载到中间通道中，每井每井适当稀释 100 微升。装入所有样品后，打开真空泵两分钟，然后停止真空，并允许样品通过重力过滤通过膜。10分钟后，用100微升PBS清洗每井。再运行真空泵五分钟。当洗涤缓冲液完全从设备中排出时，当真空打开时，松开螺钉并小心地打开点印装置。然后，根据标准的西方印迹协议处理膜。对于滤波器的密度分析，打开 ImageJ 并勾勒出每个点，使用"分析、测量"命令测量集成密度（如所示）。要对图像进行背景校正，请在空区域中绘制一个圆，并测量其集成密度，如所示。将标准点的综合密度与加载的蛋白质量关联，以获得校准线，并使用校准曲线推断每个样品点的 mRFP 浓度。然后可以计算未绑定分数中剩余的 mRFP 的浓度。仅在含有吸附孢子提取物的通道中存在预期大小的蛋白质，这表明吸附反应是成功的。吸附效率的直接评价取决于已经使用的异质蛋白，在吸附反应的分馏后，可以通过荧光显微镜和细胞荧光测量对颗粒分数进行。然后可以使用图像J对孢子上存在的荧光信号进行定量，如所示。通过对含有未绑定蛋白质的上清液分数进行点印迹分析，可以间接分析吸附效率，随后对未绑定蛋白质进行密度分析，可以间接计算吸附到孢子上的蛋白质数量。虽然，原则上，任何蛋白质都可以吸附用作粘膜疫苗或生物催化剂，但在实践中，吸附的效率取决于蛋白质位点和化学性质。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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科研

免疫与感染

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