Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" til L. Baccigalupi, projekttitel "SP-LAY: bakteriel sporer som live platform for proteiner display".

1. adsorption reaktion
<ol><li>Inkuber 2, 5 og 10 µg for mRFP med 2 x 109 i B. subtilis vildtype renset sporer i 200 µL af bindende buffer, 50 mM natriumcitrat, pH 4.0 (16,7 mM natriumcitrat dihydrat; 33.3 mM citronsyre) i 1 time ved 25 ° C på en vuggende shaker (figur 1) .</li>
	<li>Der centrifugeres bindende blandinger (13.000 x g i 10 min.) for at fractionate pellets (P2, P5 og P10) og supernatanter (S2, S5 og S10). Gemme analysere for indirekte evalueri...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Protokollens spore adsorption er meget enkel og ligetil. Reaktionen er strengt afhængig reaktion buffer pH-værdi og effektivitet af adsorption er optimal på sure pH-værdi (pH 5.0 eller lavere). På neutral pH betingelser, effektiviteten af adsorption er lavt, og på alkalisk pH værdier, adsorption kan ikke forekomme. Optimal adsorption er opnået med et rumfang på 200 µL i 1,5 mL rør (eller at holde et lignende forhold) på en vuggende shaker.
Adsorptionen er meget stram, og vasker med...

Display-systemer er rettet mod præsenterer biologisk aktive molekyler på overfladen af mikroorganismer og at finde programmer i en række forskellige områder, fra industrielle medicinske og miljømæssige bioteknologi. Ud over phages1,2 og celler i forskellige Gram-negative og -positive arter,3,4,5,6,7, har bakteriesporer også været foreslået som display systemer af to tilgange8,9.
På grund af sin særlige struktur, nemlig en dehydreret cytoplasma omgivet af en række beskyttende lag10, giver spore adskillige fordele i forhold til fag - og cellebaserede display systemer8,9. En første fordel kommer fra den ekstreme robusthed og stabilitet af sporer på betingelser, der ville være skadelig for alle andre celler10,11. Spore-vises antigener og enzymer er stabil efter længere tids opbevaring ved stuetemperatur12 og beskyttet mod nedbrydningen ved lav pH og høje temperaturer13. En anden fordel af sporer er sikkerheden for mange sporedannelse danner arter. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, og flere andre arter bruges verden over som probiotika og har været på markedet for menneskers eller dyrs brug for årtier14,15. Denne ekstraordinære sikkerhedsstatistik er en indlysende generelle krav for en overflade displaysystem og er af særlig relevans, når systemet er beregnet til konsum eller foderbrug Brug16. En tredje, er vigtig fordel af en spore-baseret displaysystem at det ikke har begrænsninger for størrelsen af molekylet, der skal udsættes. I phage-baserede systemer, en stor heterolog protein kan påvirke strukturen af kapsid, mens i celle-baserede systemer, det kan påvirke struktur af membran eller kan grænse/forringe membran translokation trin17. De beskyttende lag omkring spore er sammensat af mere end 70 forskellige proteiner10 og er fleksibel nok til at acceptere store udenlandske proteiner uden nogen indlysende konstruktionsfejl eller funktionelle svækkelse8. Derudover med både spore-baseret display systemer er membran omplantning af heterolog protein ikke kræves8,9. Faktisk er heterolog proteiner enten fremstillet i mor cellen cytoplasma og samlet på den spore, der er danner i samme cytoplasmaet eller adsorberet på modne spore8,9.
Spore display blev oprindeligt fremstillet ved at udvikle et genetisk system ingeniør spore overflade18. Denne genetiske systemet var baseret på jeg) opbygningen af et gen fusion mellem det gen, der koder for en spore frakke protein (anvendes som bærestof) og genet koder for proteinet skal vises - tilstedeværelsen af det transkriptionel og translationel signaler af den endogene gen vil kontrollere udtrykket af den fusion, og ii) integration af kimære-gen på B. subtilis kromosom at yde genetisk stabilitet. En bred vifte af antigener og enzymer, der vises af denne rekombinant tilgang, ved hjælp af forskellige sporedannelse overflade proteiner som luftfartsselskaber og sigter mod forskellige potentielle applikationer, der spænder fra slimhinden vaccine til biocatalyst, biosensor, bioremediering, eller bioanalytisk værktøj8,13.
For nylig har har en anderledes tilgang af spore display været udviklede19. Dette andet system er nonrecombinant og bygger på den spontane og yderst stramme adsorption af molekyler på spore overflade9. Antigener19,20 og enzymer13,21 har været effektivt vises og har afsløret, at denne metode er betydeligt mere effektiv end den rekombinante. Denne nonrecombinant tilgang giver mulighed for visning af proteiner i oprindelig form20 og kan også bruges med autoklaveres, død sporer19. Den molekylære mekanisme af adsorption er ikke fuldt klarlagt endnu. Den negative ladning og hydrophobicity af spore er blevet foreslået som egenskaber for relevante for adsorption13,19,22. For nylig, har det vist at en model protein, røde autofluorescent protein (mRFP) af de koraller Discosoma, når adsorberet til spore, kunne infiltrere gennem de overflade lag lokalisering i indre frakke23. Hvis viste sig rigtigt for andre proteiner, kan interne lokaliseringen af de heterolog proteiner forklare deres øget stabilitet, når adsorberet til sporer23.
I en nylig undersøgelse, to enzymer katalysere to successive trin af Nedbrydningsvejen xylan var uafhængigt vises på sporer af B. subtilis , og når inkuberes sammen, var i stand til at udføre både nedbrydning trin21. Sporer indsamlet efter reaktionen var stadig aktive og kan fortsætte xylan nedbrydning ved tilsætning af friske substrat21. Selvom et tab på omkring 15% af det endelige produkt blev observeret i den anden reaktion21, er genbrugelighed af adsorberet enzymer til enkelt, såvel som Multi-trins, reaktioner en yderligere vigtig fordel af spore displaysystem.
Pan et al.24 rapporterede en yderligere tilgang til at vise heterolog proteiner på spore overfladen: heterolog proteiner (en endoglucanase protein og en beta-galactosidase en) produceret i cellen mor under sporulering var spontant indkapslet i den dannende spore pels, uden savn i en transportør. Denne yderligere spore displaysystem er en kombination af de to metoder beskrevet så langt. Faktisk er det rekombinante da heterolog proteiner blev manipuleret til at være udtrykt i cellen mor under sporulering, mens deres forsamling inden for pelsen var spontan og derfor nonrecombinant24. Effektiviteten af visning af denne yderligere tilgang er imidlertid fortsat at blive testet og sammenlignet med de andre to tilgange ved hjælp af de samme heterolog proteiner.
Denne protokol udelukker processer af spore produktion og rensning, som er blevet beskrevet udførligt andetsteds24. Det omfatter adsorption reaktion, evaluering af effektiviteten af adsorption af dot-blotting og Fluorescens mikroskopi, og genbrug af adsorberet enzymer til yderligere reaktion runder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

Den bakterielle spore er en metabolisk inaktiv celle, dannet af en række beskyttende lag omkring en dehydreret cytoplasma. Denne ejendommelige struktur gør at spore yderst stabil og modstandsdygtig og har foreslået brugen af spore som en platform til at vise heterolog molekyler. Hidtil har en bred vifte af antigener og enzymer er blevet vist på sporer af Bacillus subtilis og et par andre arter, i første omgang af en rekombinant tilgang og derefter, efter en enkel og effektiv metode, nonrecombinant. Nonrecombinant display-system er baseret på direkte adsorption af heterolog molekyler på spore overflade, undgå opførelsen af rekombinant stammer og frigivelsen af genetisk modificerede bakterier i miljøet. Adsorberede molekyler er stabiliseret og beskyttet af samspillet med sporer, som begrænser den hurtige forringelse af antigener og tabet af enzymaktivitet på ugunstige betingelser. Når udnyttet, kan spore-adsorberet enzymer indsamlet nemt med en minimal reduktion af aktivitet og genbrugt til yderligere reaktion runder. I dette papir er vist sådan adsorberes model molekyler til renset sporer af B. subtilis, sådan at evaluere effektiviteten af adsorption, og hvordan de skal indsamle brugte sporer for at genbruge dem til nye reaktioner.

Vellykket adsorption kan vurderes ved western blotting. Ved reaktionen, blandingen er fraktioneret ved centrifugering og vaskes, og pellet brøkdel (figur 1) bruges til at udtrække de overflade proteiner. Ekstraktet er fraktioneret af SDS polyacrylamid gelelektroforese (side), electrotransferred til en polyvinylidene fluorid (PVDF) membran, og reagerede mod primære og sekundære antistoffer. Tilstedeværelsen af proteiner af den forventede størrelse, kun i...

Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Denne protokol fokuserer på brugen af bakteriesporer som en "levende" nanobiotechnological redskab til adsorberes heterolog molekyler med forskellige biologiske aktiviteter. Metoder til at måle effektiviteten af adsorption er også vist.

Spore Adsorption som et Nonrecombinant displaysystem for enzymer og antigener

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Levende bakteriesporer, der viser antigen eller enzymer, er funktionelt aktive nanopartikler, der kan anvendes som slimhindevacciner eller biokatalysatorer. I princippet kan ethvert protein effektivt adsorberes til sporer. Denne teknik er enkel og kræver ingen genetisk manipulation.Der er derfor ikke tale om udslip af rekombinante organismer i miljøet. Ud over slimhindevaccinologi for mennesker og dyr kan sporer, der viser enzymer, udvikles som genanvendelige biokatalysere. Begynd med at mærke to gange 10 til den niende B.subtilis wild-type renset sporer med to-fem-eller 10-mikrogram koncentrationer af model RFP i 200 mikroliter af bindende buffer suppleret med 50-millimolar natriumcitrat i en time ved 25 grader Celsius på en vuggende shaker.Ved inkubationens afslutning pellets bindingsblandingerne ved centrifugering, og supernatanterne overføres til nye koniske rør til efterfølgende adsorptionseffektivitetsanalyse. Derefter vaskes sporepillerne to gange med 200 mikroliter af bindende buffer pr. vask, der opslænger pellets i 100 mikroliter af frisk bindingsbuffer efter den anden vask. For overflade protein ekstraktion, tilsættes 50 mikroliter af hver adsorberet spore resuspension til 50 mikroliter af 2X natrium dodecyli sulfat-dithiothreitol at opløse overfladen spore proteiner.Efter 45 minutter ved 65 grader Celsius, indsamle blandinger ved centrifugering, og køre 10 mikroliter af hvert volumen af ekstraherede proteiner supernatant på en vestlig skamplet, ved hjælp af en monoklonal anti-Hans antistof anerkender Hans tag til stede på N-terminus af mRFP at identificere de mærkede overflade proteiner. For at lokalisere og kvantificere adsorberede molekyler ved fluorescensmikroskopi skal der tilsættes fem mikroliter af adsorberet sporerepension til 95 mikroliter PBS, og der tilsættes fem mikroliter af hver resulterende suspension på individuelle mikroskopdias. Placer en poly-L-lysin-behandlet coverslip på hvert dias, og placer et dias på en fluorescens mikroskop fase.Gem derefter fasekontrast- og fluorescensmikroskopibillederne for hvert felt. Til billedanalyse skal du åbne fluorescensmikroskopibillederne i ImageJ og vælge Billede og tekst for at bekræfte, at alle billederne er i otte-bit format. Vælg Angiv målinger i menuen Analysér, og bekræft, at Område, Integreret tæthed og Middelgråværdi er markeret.Brug et tegnings- eller markeringsværktøj til at tegne en streg rundt om den sporede interesse, og vælg Målér i menuen Analysér. Der vises en pop op-boks med en stak værdier for den valgte spore. Når mindst 50 sporer er valgt, skal du vælge flere regioner uden sporer og gentage målingen for at opnå en aflæsning for baggrundsfluorescensen.Når du har fået flere baggrundsmålinger, skal du kopiere alle dataene i vinduet Resultater til et regneark og beregne gennemsnittet af den integrerede tæthed i området for de valgte sporer og baggrundsfluorescensværdierne for at opnå den korrigerede total-per-celle fluorescens. Til vurdering af indirekte adsorptionseffektivitet udføre seks dobbelt sålede fortyndinger af renset mRFP ved en koncentration på 0,5-nanogram pr. mikroliter til et endeligt volumen på 250 mikroliter pr. fortynding i bindingsbuffer og et passende forsøgsantal af tofoldige serielle fortyndinger af 100 mikroliter af hver reserveret supernatantprøve, der indeholder den ubundne mRFP-fraktion af adsorptionen med 100 mikroliter af bindende buffere. Dernæst skæres en nitrocellulosemembran med en 0,45-mikrometer cutoff til en ni-by-10-centimeter størrelse, for at dække en fem-prøve-by-seks-prikker-af-fortynding område uden at strække ud over kanten af pakningen af dot blot apparat.Anstæn skal fordøbes i dot blot-apparatet. Kontroller membranens korrekte størrelse, og fjern eventuelle luftbobler, der er fanget mellem membranen og pakningen. Dot blot-apparatet monteres som beskrevet af fabrikanten, og den ubrugte del af apparatet samles for at forhindre luft i at bevæge sig gennem disse brønde.Når apparatet er klar, skal standarden indlæses i de to mest udvendige baner og prøverne i de midterste baner med 100 mikroliter af hver passende fortynding pr. brønd. Når alle prøverne er blevet indlæst, tændes vakuumpumpen i to minutter, før du stopper vakuumet og lader prøverne filtrere gennem membranen ved tyngdekraft. Efter 10 minutter vaskes hver brønd med 100 mikroliter PBS.Kør vakuumpumpen i yderligere fem minutter. Når vaskebufferen er helt drænet fra apparatet, mens vakuumet er tændt, løsnes skruerne, og dotblommer apparatet åbnes forsigtigt. Derefter behandle membranen i henhold til standard vestlige blot protokoller.Hvis du vil foretage densitometrisk analyse af filteret, skal du åbne ImageJ og skitsere hver prik for at måle den integrerede tæthed ved hjælp af kommandoen Analysér, Målpunkt som vist. Hvis du vil foretage en baggrundskorrektion af billedet, skal du tegne en cirkel i et tomt område og måle dets integrerede tæthed som vist. Korreler standardpternes integrerede masseitet med mængden af belastet protein for at opnå en kalibreringslinje, og brug kalibreringskurven til at ekstrapolere koncentrationen af mRFP for hver prøvep-plads.Koncentrationen af den mRFP, der er tilbage i de ubundne brøker, kan derefter beregnes. Tilstedeværelsen af proteiner af den forventede størrelse kun i baner lastet med et uddrag af adsorberedsporerne er tegn på en vellykket adsorption reaktion. Direkte evaluering af adsorptionseffektiviteten afhænger af det heterologe protein, der er blevet brugt og kan udføres ved fluorescensmikroskopi og cytofluorimetri af pelletfraktionen efter fraktionering af adsorptionsreaktionen.Kvantificering af de fluorescerende signaler, der er til stede på sporer, kan derefter udføres ved hjælp af ImageJ som påvist. En indirekte analyse af adsorptionseffektiviteten kan udføres ved en dot blotting analyse af supernatantfraktionen, der indeholder det ubundne protein, og efterfølgende densitometrisk analyse af det ubundne protein gør det muligt indirekte beregning af mængden af protein adsorberet på sporerne. Selv om ethvert protein i princippet kan adsorberes til brug som slimhindevacciner eller biokatalysatorer, afhænger adsorptionens effektivitet i praksis af proteinstederne og de kemiske egenskaber.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

En ny screeningsmetode til den Rettede Udviklingen i Termostabile bakteriolytisk Enzymes

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Massespektrometrisk analyse af glycosphingolipid antigener

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funktionelle røde blodlegemer ved The Membrane podning af Compact hyperforgrenet Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Afsløring Cortex Fragmenter Under Bakteriel Spore Spiring

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Rensning af membran til kabinen for endoplasmatiske Reticulum-associerede nedbrydning af eksogene antigener i Cross-præsentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Udtryk af eksogene antigener i Mycobacterium bovis BCG Vaccine via ikke-genetiske overflade dekoration med begærlighed-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infektioner som Screening-værktøjer for identifikation af Viral hæmmende og vært Antiviral faktorer

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...