Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" naar L. Baccigalupi, titel van het project "SP-LAY: bacteriële sporen als live platform voor eiwitten weergave".

1. adsorptie reactie
<ol><li>Incubeer 2, 5 en 10 µg mRFP met 2 x 109 van B. subtilis wild-type gezuiverde sporen in 200 µL van bindende 50 mM Natriumcitraat, buffer, pH 4.0 (16.7 mM Natriumcitraat dihydraat; 33,3 mM citroenzuur) gedurende 1 uur bij 25 ° C op een rockende shaker (Figuur 1) .</li>
	<li>Centrifugeer het bindende mengsels (13.000 x g gedurende 10 minuten) om fractionate pellets (P2, P5 en P10) en supernatant (S2, S5 en S10). Bewaar het supernata...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Dit protocol spore adsorptie is zeer eenvoudig en ongecompliceerd. De reactie is strikt afhankelijk van de pH van de buffer van de reactie en de efficiëntie van adsorptie is optimaal bij zure pH-waarden (pH 5.0 of lager). Bij neutrale pH-omstandigheden, de efficiëntie van adsorptie is laag, en bij alkalische pH waardes, adsorptie niet kan optreden. Optimale adsorptie wordt verkregen met behulp van een volume van 200 µL in 1,5 mL buizen (of een vergelijkbare verhouding te houden) op een rockende shaker.
<p class="j...

Displaysystemen zijn gericht op de presentatie van biologisch actieve moleculen op het oppervlak van micro-organismen en toepassingen vinden in allerlei velden, uit industriële aan medische en milieu biotechnologie. Naast bacteriofagen1,2 en cellen van verschillende gram-negatieve en -positieve soorten3,4,5,6,7, bacteriële sporen ook geweest voorgesteld als displaysystemen door twee benaderingen8,9.
Door zijn bijzondere structuur, namelijk een gedehydrateerde cytoplasma omringd door een aantal beschermende lagen10, biedt de spore verschillende voordelen ten opzichte van phage en cel-gebaseerde display systemen8,9. Een eerste voordeel komt uit de extreme robuustheid en stabiliteit van sporen op voorwaarden dat zou schade wordt berokkend aan alle andere cellen10,11. Spore-weergegeven antigenen en enzymen zijn stabiel na langdurige opslag bij kamertemperatuur12 en beschermd tegen aantasting bij lage pH en hoge temperaturen13. Een tweede voordeel van sporen is de veiligheid van vele spore-vormende soorten. B. subtilis, B. clausii, B. coagulansen verschillende andere soorten wereldwijd als probiotica worden gebruikt en heb op de markt voor menselijk of dierlijk gebruik voor decennia14,15. Deze uitzonderlijke veiligheidsreputatie is een voor de hand liggende algemene vereiste voor een oppervlakte display systeem en is van bijzonder belang wanneer het systeem is bedoeld voor gebruik voor menselijke of dierlijke16. Een derde is belangrijk voordeel van een display spore-gebaseerd systeem dat het geen beperkingen voor de grootte van het molecuul dat moet worden blootgesteld. In faag gebaseerde systemen, een grote heterologe eiwit kan invloed hebben op de structuur van de Eiwitmantel, terwijl in de cel-gebaseerde systemen, het kan invloed hebben op de structuur van het membraan of kan de membraan translocatie stap17limiet/schaden. De beschermende lagen rond de spore zijn samengesteld uit meer dan 70 verschillende eiwitten10 en zijn flexibel genoeg om goed te keuren van grote buitenlandse eiwitten zonder duidelijk structurele defect of functionele bijzondere waardevermindering8. Bovendien, met beide spore gebaseerde displaysystemen is het membraan translocatie van het heterologe eiwit niet nodig8,9. Inderdaad, heterologe eiwitten zijn ofwel in het cytoplasma van de cel van de moeder geproduceerd en gemonteerd op de spore die vormt in de dezelfde cytoplasma of geadsorbeerd op de volwassen spore8,9.
Spore display was in eerste instantie verkregen door het ontwikkelen van een genetische systeem ingenieur van de spore oppervlakte18. Deze genetische systeem was gebaseerd op ik) de bouw van een gen fusie tussen het gen dat codeert voor een spore vacht eiwit (gebruikt als drager) en de gene codering voor de proteïne worden weergegeven - de aanwezigheid van de transcriptionele en translationele signalen van de endogene gen zal de controle van de expressie van de fusie, en ii) integratie van het chimeer gen op het chromosoom van B. subtilis te verlenen van de genetische stabiliteit. Een scala aan antigenen en enzymen zijn tentoongesteld door deze recombinante aanpak, met behulp van diverse spore oppervlakte eiwitten als dragers en die gericht zijn op verschillende mogelijke toepassingen, variërend van mucosal vaccin aan biokatalysator biosensor, bioremediatie, of bioanalytical gereedschap8,13.
Meer heeft, een andere benadering van spore display onlangs ontwikkelde19. Dit tweede systeem is nonrecombinant en vertrouwt op de spontane en uiterst krap adsorptie van moleculen op de oppervlakte van spore9. Antigenen19,20 en enzymen13,21 efficiënt zijn tentoongesteld en is gebleken dat deze methode is aanzienlijk efficiënter dan de recombinant. Deze nonrecombinant benadering kunt u de weergave van eiwitten in de oorspronkelijke vorm20 en kan ook worden gebruikt met gesteriliseerde met autoclaaf, dood sporen19. Het moleculaire mechanisme van adsorptie is niet volledig opgehelderd nog. De negatieve lading en de hydrophobicity van de spore voorgesteld als relevante eigenschappen voor de adsorptie13,19,22. Onlangs is gebleken dat een model eiwit, de rode autofluorescent proteïne (mRFP) van het koraal Discosoma, wanneer geadsorbeerd aan het spore, kon infiltreren door de oppervlakte lagen lokaliseren in de innerlijke vacht23. Als bewaarheid voor andere proteïnen, uitleggen de interne lokalisatie van de heterologe eiwitten hun verhoogde stabiliteit wanneer geadsorbeerde tot en met23van de sporen.
In een recente studie, twee enzymen katalyseren van twee opeenvolgende stappen van het traject van de afbraak Xylaan hingen onafhankelijk op sporen van B. subtilis en, wanneer geïncubeerd samen konden uitvoeren van beide afbraak stappen21. Sporen verzameld na de reactie waren nog steeds actief en kunnen blijven de Xylaan afbraak op de toevoeging van vers basismateriaal21. Zelfs als een verlies van ongeveer 15% van het eindproduct werd waargenomen in de tweede reactie21, is de herbruikbaarheid van geadsorbeerde enzymen voor één, evenals scriptingregel, reacties een belangrijk bijkomend voordeel van de spore display systeem.
Pan et al.24 gemeld een aanvullende benadering om weer te geven van heterologe eiwitten op het oppervlak van de spore: heterologe eiwitten (een endoglucanase eiwit en een beta-galactosidase een) geproduceerd in de cel van de moeder tijdens de sporevorming werden spontaan ingekapseld in de vormende spore jas, zonder de noodzaak van een vervoerder. Deze bijkomende spore display systeem is een combinatie van deze twee benaderingen die tot nu toe beschreven. Inderdaad, het is recombinant aangezien de heterologe eiwitten zijn ontworpen om te worden uitgedrukt in de cel van de moeder tijdens de sporevorming, terwijl hun vergadering binnen de vacht spontaan was en dus nonrecombinant24. De efficiëntie van de weergave van deze aanvullende benadering blijft echter om te worden getest en vergeleken met de andere twee benaderingen met behulp van de dezelfde heterologe eiwitten.
Dit protocol omvat niet de processen van spore productie en zuivering, die al uitgebreid elders24beschreven. Het omvat de adsorptie-reactie, de evaluatie van de efficiëntie van adsorptie door dot-bevlekken en fluorescentie microscopie, en de recycling van geadsorbeerde enzymen voor aanvullende reactie rondes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

De bacteriële spore is een metabolisch rustige cel, gevormd door een aantal beschermende lagen rond een gedehydrateerde cytoplasma. Deze bijzondere structuur maakt de spore uiterst stabiel en resistente en heeft voorgesteld het gebruik van de spore als een platform voor het weergeven van heterologe moleculen. Tot nu toe een scala aan antigenen en enzymen zijn tentoongesteld op sporen van Bacillus subtilis en een paar andere soorten, in eerste instantie door een recombinant aanpak en, vervolgens, door een eenvoudige en efficiënte nonrecombinant methode. De nonrecombinant display systeem is gebaseerd op de directe adsorptie van heterologe moleculen op het oppervlak van de spore, de bouw van recombinante stammen en de introductie van genetisch gemodificeerde bacteriën in het milieu te voorkomen. Geadsorbeerde moleculen zijn gestabiliseerd en beschermd door de interactie met sporen, waardoor de snelle afbraak van antigenen en het verlies van de enzymactiviteit bij ongunstige omstandigheden wordt beperkt. Zodra gebruikt, kunnen spore-geadsorbeerde enzymen worden verzameld gemakkelijk met een minimale vermindering van activiteit en hergebruikt voor aanvullende reactie rondes. In deze paper wordt weergegeven hoe te adsorberen model moleculen om gezuiverde sporen van B. subtilis, hoe te te evalueren van de doeltreffendheid van adsorptie en hoe verzamelt gebruikte sporen om ze te recyclen voor nieuwe reacties.

Succesvolle adsorptie kan worden geëvalueerd door het westelijke bevlekken. Op de reactie, het mengsel is gefractioneerde door centrifugeren en gewassen, en de Fractie van de pellet (Figuur 1) wordt gebruikt om uit te pakken van de oppervlakte-eiwitten. Het extract is gefractioneerde door SDS polyacrylamide-gelelektroforese (pagina), electrotransferred naar een Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan, en gereageerd tegen de primaire en secundaire ant...

Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Dit protocol is gericht op het gebruik van bacteriële sporen als een "live" nanobiotechnological instrument te adsorberen heterologe moleculen met verschillende biologische activiteit. De methoden voor het meten van de doelmatigheid van de adsorptie worden ook weergegeven.

Spore adsorptie als een Nonrecombinant Display systeem voor enzymen en antigenen

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Levende bacteriële sporen met antigeen of enzymen zijn functioneel actieve nanodeeltjes die kunnen worden gebruikt als mucosale vaccins of biokatalysten. In principe kan elk eiwit efficiënt worden geadsorbeerd op sporen. Deze techniek is eenvoudig en vereist geen genetische manipulatie.Daarom is er geen sprake van het vrijkomen van recombinante organismen in het milieu. Naast mucosale vaccinologie voor mens en dier kunnen sporen met enzymen worden ontwikkeld als herbruikbare biokatalyzers. Begin met het labelen van twee keer 10 tot de negende B.subtilis wild-type gezuiverde sporen met twee-vijf-of 10-microgram concentraties van model RFP in 200 microliter van bindende buffer aangevuld met 50-millimolar natriumcitraat gedurende een uur op 25 graden Celsius op een schommelende shaker.Aan het einde van de incubatie, pellet de bindende mengsels door centrifugatie, en breng de supernatants in nieuwe conische buizen voor latere adsorptie-efficiëntie analyse. Was vervolgens de sporenpellets twee keer met 200 microliterbindbuffer per wasbeurt, waarbij de pellets na de tweede wasbeurt opnieuw worden toegewezen in 100 microliters met verse bindingsbuffer. Voeg voor oppervlakte-eiwitextractie 50 microliter van elke geadsorbeerde sporentractie toe aan 50 microliter 2x natriumdodium dodecylsulfaat-dithiothreitol om de oppervlaktesporeneiwitten op te lossen.Na 45 minuten bij 65 graden Celsius, verzamel de mengsels door centrifugatie, en lopen 10 microliter van elk volume van geëxtraheerde eiwitten supernatant op een westelijke vlek, met behulp van een monoklonale anti-Zijn antilichaam herkennen van de Zijn tag aanwezig op de N-terminus van mRFP om de gelabelde oppervlakte-eiwitten te identificeren. Om de geadsorbeerde moleculen te lokaliseren en te kwantificeren door fluorescentiemicroscopie, voeg vijf microliters van de adsorbeerde sporensteun toe aan 95 microliter pbs en voeg vijf microliter van elke resulterende suspensie toe aan individuele microscoopdia's. Plaats een poly-L-lysine-behandelde coverslip op elke dia, en plaats een dia op een fluorescentie microscoop stadium.Sla vervolgens voor elk veld de fasecontrast- en fluorescentiemicroscopiebeelden op. Open voor beeldanalyse de fluorescentiemicroscopieafbeeldingen in ImageJ en selecteer Afbeelding en tekst om te bevestigen dat alle afbeeldingen in een indeling van acht bits zijn. Selecteer in het menu Analyseren de optie Metingen instellen en bevestig dat Gebied, Geïntegreerde dichtheid en Gemiddelde grijswaarde zijn geselecteerd.Gebruik een teken- of selectiegereedschap om een lijn rond de interessesporen te tekenen en selecteer Meten in het menu Analyseren. Er verschijnt een pop-upvak met een stapel waarden voor het geselecteerde spore. Nadat ten minste 50 sporen zijn geselecteerd, selecteert u verschillende regio's zonder sporen en herhaalt u de meting om een meting voor de achtergrondfluorescentie te verkrijgen.Nadat u verschillende achtergrondmetingen hebt verkrijgt, kopieert u alle gegevens in het venster Resultaten in een spreadsheet en berekent u het gemiddelde van de geïntegreerde dichtheid in het gebied van de geselecteerde sporen en de achtergrondfluorescentiewaarden om de gecorrigeerde fluorescentie per cel te verkrijgen. Voor de evaluatie van de indirecte adsorptie-efficiëntie moet zes tweevoudige seriële verdunningen van gezuiverde mRFP uitvoeren bij een concentratie van 0,5 nanogram per microliter tot een eindvolume van 250 microliter per verdunning in bindende buffer en een passend experimenteel aantal tweevoudige seriële verdunningen van 100 microliter van elk gereserveerd supernatant monster dat de niet-gebonden mRFP-fractie van de adsorptiereactie bevat met 100 microliterbinden van bindende buffer per verdunning. Snijd vervolgens een nitrocellulosemembraan met een afknipper van 0,45 micrometer tot een grootte van negen bij 10 centimeter, om een vijf-monster-bij-zes-dots-van-verdunning gebied te dekken zonder zich uit te breiden tot voorbij de rand van de pakking van de stip vlek apparaat.Plaats het pre-natte membraan in het dot blot-apparaat. Controleer de juiste grootte van het membraan en verwijder eventuele luchtbellen die vast zitten tussen het membraan en de pakking. Monteer het puntvlekapparaat zoals beschreven door de fabrikant en bedek het ongebruikte gedeelte van het apparaat om te voorkomen dat lucht door die putten beweegt.Wanneer het apparaat klaar is, laadt de norm in de twee meest externe rijstroken en de monsters in de middelste rijstroken met 100 microliter van elke geschikte verdunning per put. Wanneer alle monsters zijn geladen, schakelt u de vacuümpomp twee minuten in, voordat u het vacuüm stopt en de monsters door het membraan door de zwaartekracht laten filteren. Na 10 minuten, was elk goed met 100 microliter PBS.Voer de vacuümpomp nog vijf minuten uit. Wanneer de wasbuffer volledig uit het apparaat is afgevoerd, terwijl het vacuüm aan staat, maak je de schroeven los en open je het puntvlekapparaat voorzichtig. Verwerk het membraan vervolgens volgens de standaard western blot-protocollen.Open ImageJ en omtrek elke stip voor densitometrische analyse van het filter om de geïntegreerde dichtheid te meten met behulp van de opdracht Analyseren, Meten zoals aangetoond. Als u een achtergrondcorrectie van de afbeelding wilt aanbrengen, tekent u een cirkel in een leeg gebied en meet u de geïntegreerde dichtheid zoals aangetoond. Correleer de geïntegreerde dichtheid van de standaardstippen met de hoeveelheid geladen eiwit om een kalibratielijn te verkrijgen en gebruik de kalibratiecurve om de concentratie van mRFP van elke monsterstip te extrapoleren.De concentratie van het mRFP dat in de niet-gebonden breuken blijft, kan vervolgens worden berekend. De aanwezigheid van eiwitten van de verwachte grootte alleen in de rijstroken geladen met een extract van de geadsorbeerde sporen is indicatief voor een succesvolle adsorptiereactie. Directe evaluatie van de adsorptie-efficiëntie is afhankelijk van het heterologe eiwit dat is gebruikt en kan worden uitgevoerd door fluorescentiemicroscopie en cytofluorimetrie van de pelletfractie na de fractionering van de adsorptiereactie.Kwantificering van de fluorescerende signalen aanwezig op sporen kan vervolgens worden uitgevoerd met behulp van ImageJ zoals aangetoond. Een indirecte analyse van de adsorptie-efficiëntie kan worden uitgevoerd door een dot blotting-analyse van de supernatant fractie die het niet-gebonden eiwit bevat, en de daaropvolgende densitometrische analyse van het niet-gebonden eiwit maakt de indirecte berekening mogelijk van de hoeveelheid eiwit die op de sporen wordt geadsorbeerd. Hoewel elk eiwit in principe kan worden geadsorbeerd voor gebruik als mucosale vaccins of biokatalysatoren, is de efficiëntie van de adsorptie in de praktijk afhankelijk van de eiwitplaatsen en chemische eigenschappen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Een nieuwe screeningsmethode voor de gerichte evolutie van thermostabiele Bacteriolytic Enzymen

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigenen functionele rode bloedcellen die beschermd worden door de membraan enten van Compact Hypervertakte Polyglycerolen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Detecteren Cortex Fragmenten Tijdens Bacteriële Spore Kiemkracht

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Zuivering van het membraan compartiment voor endoplasmatisch Reticulum-geassocieerde afbraak van exogene antigenen in Cross-presentatie

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...