Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par « Finanziamento di Ricerca di Ateneo » à L. Baccigalupi, titre du projet « SP-LAY : des spores bactériennes platefrome direct pour l’affichage des protéines ».

1. réaction d’adsorption
<ol><li>Incuber 2, 5 et 10 µg de RDRF avec 2 x 109 de spores purifiées de b. subtilis sauvage dans 200 µL de liaison tampon, citrate de sodium de 50 mM, pH 4,0 (16,7 mM du citrate de sodium dihydraté ; acide citrique 33,3 mM) pendant 1 h à 25 ° C sur un agitateur basculant (Figure 1) .</li>
	<li>Centrifuger les mélanges de liaison (13 000 x g pendant 10 min) pour fractionner les granulés (P2, P5 et P10) et des surnageants (S...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Ce protocole d’adsorption de spore est très simple et intuitive. La réaction est strictement dépendante du pH de la mémoire tampon de réaction et l’efficacité d’adsorption est optimale lorsque le pH acide (pH 5,0 ou plus bas). À des conditions de pH neutre, l’efficacité d’adsorption est faible, et à un pH alcalin, adsorption ne peut survenir. Adsorption optimale est obtenue en utilisant un volume de 200 µL dans des tubes de 1,5 mL (ou garder un ratio similaire) sur un agitateur basculant.
<p class...

Systèmes d’affichage visent à présenter des molécules biologiquement actives sur la surface des micro-organismes et de trouver des applications dans une variété de domaines, des industriels aux biotechnologies médicales et écologiques. En plus des phages1,2 et cellules de divers Gram - positifs et espèces3,4,5,6,7, spores bactériennes ont également été proposé comme systèmes d’affichage par deux approches8,9.
En raison de sa structure particulière, à savoir un cytoplasme déshydraté, entouré par une série de couches protectrices10, la spore offre plusieurs avantages par rapport aux phages et cellule dotés d’écran systèmes8,9. Un premier avantage provient de l’extrême robustesse et stabilité des spores dans des conditions qui seraient préjudiciables à tous les autres cellules10,11. Enzymes et spore-affiche les antigènes sont stables après une conservation à température ambiante12 et protégée de la dégradation à pH faible et des températures élevées,13. Un deuxième avantage des spores est la sécurité de nombreuses espèces sporulées. B. subtilis, b. clausii, b. coagulanset plusieurs autres espèces sont utilisées dans le monde entier comme probiotiques et sont trouvent sur le marché à usage humain ou animal pour des décennies14,15. Cet enregistrement de sécurité exceptionnel est une évidente exigence générale pour un système d’affichage de surface et est particulièrement pertinent lorsque le système est destiné à l’usage humain ou animal,16. Un tiers, un avantage important d’un système d’affichage basé sur spore est qu’il n’a pas de limites pour la taille de la molécule qui doit être exposé. Dans les systèmes phage, une grosse protéine hétérologue peut affecter la structure de la capside, tandis que dans les systèmes basés sur les cellules, il peut affecter la structure de la membrane ou limite/qui risqueraient de la membrane translocation étape17. Les couches protectrices entourant la spore sont composent de plus de 70 différents protéines10 et sont suffisamment souples pour accepter les grosses protéines étrangères sans défaut structurel évident ou une impotence fonctionnelle8. En outre, avec les deux systèmes d’affichage axée sur les spores, la translocation de la membrane de la protéine hétérologue n’est pas requis8,9. En effet, les protéines hétérologues sont soit produites dans le cytoplasme de la cellule-mère et assemblés sur le spore qui se forme dans le même cytoplasme ou adsorbés sur les spores mûres8,9.
Affichage de spore a été initialement obtenu en développant un système génétique pour l’ingénieur de la spore surface18. Ce système génétique reposait sur i) la construction d’une fusion de gènes entre le gène codant pour une protéine de capside de spore (utilisée comme support) et le gène codant pour la protéine d’être affiché - la présence des signaux transcription et traduction de l’endogène gène contrôlera l’expression de la fusion et ii) l’intégration du gène sur le chromosome de b. subtilis d’accorder la stabilité génétique chimérique. Une variété d’antigènes et d’enzymes ont été affichées par cette approche recombinante, à l’aide de diverses protéines de surface des spores comme porteurs et visant à diverses applications possibles, allant de vaccin muqueux à biocatalyseur, biocapteurs, bioremédiation, ou bioanalytiques outil8,13.
Plus récemment, une approche différente de l’affichage de la spore a été développé19. Ce deuxième système est recombinants et repose sur l’adsorption spontanée et extrêmement serrée des molécules sur la surface de spore9. 19,d’antigènes20 et enzymes de13,21 ont été exposés avec efficacité et ont révélé que cette méthode est significativement plus efficace que celui recombinant. Cette approche non permet l’affichage des protéines dans la forme native20 et peut également être utilisée avec autoclave, mort des spores19. Le mécanisme moléculaire de l’adsorption n’a pas été entièrement précisé encore. La charge négative et l’hydrophobicité de la spore ont été proposés en tant que propriétés pertinentes pour l’adsorption13,19,22. Récemment, il a été démontré qu’une protéine de modèle, la protéine auto-fluorescente rouge (RDRF) des coraux Acropora, lorsque adsorbés à la spore, a pu s’infiltrer à travers les couches de surface localisation dans la couche intérieure de23. S’est avéré vrai pour les autres protéines, la localisation interne des protéines hétérologues pourrait expliquer leur stabilité accrue lorsque adsorbé à spores23.
Dans une étude récente, deux enzymes catalysant deux étapes successives de la voie de dégradation de xylan s’affichaient indépendamment sur les spores de b. subtilis et incubés ensemble, ont été en mesure d’effectuer les deux étapes de dégradation21. Spores recueillis après la réaction étaient encore actifs et en mesure de continuer la dégradation xylane lors de l’addition du substrat frais21. Même si une perte d’environ 15 % du produit final a été observée dans la deuxième réaction21, la réutilisabilité des enzymes adsorbés pour unique, ainsi que plusieurs étapes, les réactions constitue un atout important du système d’affichage de la spore.
Pan et al.24 a signalé une approche supplémentaire pour afficher des protéines hétérologues sur la surface des spores : protéines hétérologues (une protéine endoglucanase et une bêta-galactosidase un) produits dans la cellule-mère au cours de la sporulation étaient spontanément enfermé dans le manteau formant des spores, sans avoir besoin d’un transporteur. Ce système d’affichage supplémentaires spore est une combinaison des deux approches décrites jusqu'à présent. En effet, il est recombinant puisque les protéines hétérologues ont été conçus pour être exprimé dans la cellule-mère au cours de la sporulation, tandis que leur Assemblée au sein de la couche a été spontanée et, par conséquent, non24. Cependant, l’efficacité de l’affichage de cette approche supplémentaire reste à être testés et comparés avec les deux autres approches en utilisant les mêmes protéines hétérologues.
Le présent protocole exclut les processus de production de spores et de purification, qui ont été décrits abondamment ailleurs24. Il comprend la réaction d’adsorption, l’évaluation de l’efficacité d’adsorption par microscopie-dot-blot et de fluorescence, et le recyclage des enzymes adsorbés de réaction supplémentaire de tours.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

Les spores bactériennes est une cellule métaboliquement quiescente, formée par une série de couches protectrices entourant un cytoplasme déshydraté. Cette structure particulière rend la spore extrêmement stable et résistant et a suggéré l’utilisation de la spore comme une plate-forme pour afficher des molécules hétérologues. Jusqu’ici, une variété d’antigènes et d’enzymes ont été affichés sur les spores de Bacillus subtilis et de quelques autres espèces, tout d’abord par une approche recombinante et, ensuite, par une méthode simple et efficace de recombinants. Le système d’affichage recombinants repose sur l’adsorption directe de hétérologue molécules sur la surface des spores, en évitant la construction de souches recombinantes et la libération des bactéries génétiquement modifiés dans l’environnement. Molécules adsorbées sont stabilisées et protégés par l’interaction avec les spores, qui limite la dégradation rapide des antigènes et la perte de l’activité enzymatique à des conditions défavorables. Une fois utilisé, spore-adsorbé enzymes peuvent être collectées facilement avec une réduction minimale de l’activité et réutilisés pour tours de réaction supplémentaire. Dans le présent document est montré comment s’adsorber les molécules modèles à spores purifiées de b. subtilis, comment évaluer l’efficacité d’adsorption et la collecte des spores usagés pour les recycler pour nouvelles réactions.

Adsorption réussie peut être évaluée par western Blot. Lors de la réaction, le mélange est fractionné par centrifugation et lavé, et la fraction de pellet (Figure 1) est utilisée pour extraire les protéines de surface. L’extrait est fractionné par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (PAGE), électrotransféré sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) et a réagi contre les anticorps primaires et secondaires. La présence ...

Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Ce protocole porte sur l’utilisation des spores bactériennes comme un outil de nanobiotechnological « en direct » pour adsorber les molécules hétérologues avec diverses activités biologiques. Les méthodes pour mesurer l’efficacité d’adsorption sont également indiqués.

Adsorption de spores comme un système d’affichage recombinants pour les Enzymes et les antigènes

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Les spores bactériennes vivantes présentant des antigènes ou des enzymes sont des nanoparticules fonctionnellement actives qui peuvent être utilisées comme vaccins muqueux ou biocatalyseurs. En principe, n’importe quelle protéine peut être efficacement adsorbée aux spores. Cette technique est simple et ne nécessite aucune manipulation génétique.Par conséquent, aucun rejet d’organismes recombinants dans l’environnement n’est en cause. En plus de la vaccinologie muqueuse pour les humains et les animaux, les spores présentant des enzymes peuvent être développées sous forme de biocatalyseurs réutilisables. Commencez par étiqueter deux fois 10 à la neuvième spores purifiées de type sauvage B.subtilis avec des concentrations de deux concentrations de cinq ou dix microgrammes de DP modèle dans 200 microlitres de tampon liant complétés par du citrate de sodium de 50 millimolaires pendant une heure à 25 degrés Celsius sur un shaker berçant.À la fin de l’incubation, pelleter les mélanges de liaison par centrifugation, et transférer les supernatants dans de nouveaux tubes coniques pour une analyse ultérieure de l’efficacité de l’adsorption. Ensuite, lavez les granulés de spores deux fois avec 200 microlitres de tampon liant par lavage, en réutilisant les granulés dans 100 microlitres de tampon de liaison fraîche après le deuxième lavage. Pour l’extraction des protéines de surface, ajouter 50 microlitres de chaque résuspension adsorbed spore à 50 microlitres de 2X sodium dodecyl sulfate-dithiothreitol pour solubiliser les protéines spore de surface.Après 45 minutes à 65 degrés Celsius, recueillir les mélanges par centrifugation, et exécuter 10 microlitres de chaque volume de protéines extraites supernatant sur une tache occidentale, à l’aide d’un anticorps monoclonal reconnaissant l’étiquette Son présent au N-terminus de mRFP pour identifier les protéines de surface étiquetées. Pour localisé et quantifier les molécules adsorbed par microscopie de fluorescence, ajoutez cinq microlitres de la résuspension adsorbed de spore à 95 microlitres de PBS, et ajoutez cinq microlitres de chaque suspension résultante sur les glissières individuelles de microscope. Placez un couvercle traité à la poly-L-lysine sur chaque diapositive et placez une diapositive sur un stade de microscope à fluorescence.Ensuite, pour chaque champ, enregistrer les images de microscopie de contraste de phase et de fluorescence. Pour l’analyse d’images, ouvrez les images de microscopie de fluorescence dans ImageJ, et sélectionnez Image et Type pour confirmer que toutes les images sont en format huit bits. À partir du menu Analyser, sélectionnez Mesures définies et confirmez que la zone, la densité intégrée et la valeur grise moyenne sont sélectionnées.Utilisez un outil de dessin ou de sélection pour tracer une ligne autour de la spore d’intérêt et sélectionnez Mesurer dans le menu Analyser. Une boîte popup avec une pile de valeurs pour la spore sélectionnée apparaîtra. Après qu’au moins 50 spores ont été sélectionnées, sélectionnez plusieurs régions sans spores, et répétez la mesure pour obtenir une lecture pour la fluorescence de fond.Après avoir obtenu plusieurs mesures de fond, copiez toutes les données de la fenêtre Résultats dans une feuille de calcul et calculez la moyenne de la densité intégrée dans la zone des spores sélectionnées et les valeurs de fluorescence de fond pour obtenir la fluorescence totale par cellule corrigée. Pour l’évaluation indirecte de l’efficacité de l’adsorption, effectuer six dilutions en série doubles de mRFP purifié à une concentration de 0,5 nanogramme par microlitre à un volume final de 250 microlitres par dilution dans le tampon contraignant et un nombre expérimental approprié de dilutions en série doubles de 100 microlitres de chaque échantillon réservé de supernatant contenant la fraction non lié de mRFP de la réaction d’adsorption avec 100 microlitres de tampon liant par dilution. Ensuite, coupez une membrane de nitrocellulose avec une coupure de 0,45 micromètre à une taille de neuf par 10 centimètres, pour couvrir une zone de dilution de cinq échantillons par six points sans s’étendre au-delà du bord du joint de l’appareil de tache à points.Placez la membrane préwet dans l’appareil de tache de point. Vérifiez la taille correcte de la membrane et enlevez les bulles d’air emprisonnées entre la membrane et le joint. Assemblez l’appareil à taches à points tel que décrit par le fabricant et couvrez la partie inutilisée de l’appareil pour empêcher l’air de se déplacer à travers ces puits.Lorsque l’appareil est prêt, chargez la norme dans les deux voies les plus externes et les échantillons dans les voies moyennes avec 100 microlitres de chaque dilution appropriée par puits. Lorsque tous les échantillons ont été chargés, allumez la pompe à vide pendant deux minutes, avant d’arrêter le vide et de permettre aux échantillons de filtrer à travers la membrane par gravité. Après 10 minutes, bien laver chaque puits avec 100 microlitres de PBS.Faire fonctionner la pompe à vide pendant encore cinq minutes. Lorsque le tampon de lavage s’est complètement vidé de l’appareil, pendant que le vide est en place, desserrez les vis et ouvrez soigneusement l’appareil à taches à points. Ensuite, traiter la membrane selon les protocoles standard de tache occidentale.Pour l’analyse densitométrique du filtre, ouvrez ImageJ et définissez chaque point pour mesurer la densité intégrée à l’aide de la commande Analyser, mesurer comme démontré. Pour corriger l’image en arrière-plan, dessinez un cercle dans une zone vide et mesurez sa densité intégrée telle qu’elle est démontrée. Corréler la densité intégrée des points standard avec la quantité de protéines chargées pour obtenir une ligne d’étalonnage, et utiliser la courbe d’étalonnage pour extrapoler la concentration de mRFP de chaque point d’échantillon.La concentration du mRFP restant dans les fractions non liées peut alors être calculée. La présence de protéines de la taille prévue seulement dans les voies chargées d’un extrait des spores adsorbed est indicative d’une réaction réussie d’adsorption. L’évaluation directe de l’efficacité de l’adsorption dépend de la protéine héterologeuse qui a été utilisée et peut être effectuée par microscopie de fluorescence et cytofluorimétrie de la fraction de granulés après la fractionnement de la réaction d’adsorption.La quantification des signaux fluorescents présents sur les spores peut ensuite être effectuée à l’aide d’ImageJ comme démontré. Une analyse indirecte de l’efficacité de l’adsorption peut être effectuée par une analyse par ballonnement de points de la fraction supernatale contenant la protéine non léditée, et l’analyse densitométrique subséquente de la protéine non lédée permet le calcul indirect de la quantité de protéines adsorbées sur les spores. Bien que, en principe, toute protéine puisse être adsorbée pour être utilisé comme vaccins muqueux ou biocatalyseurs, dans la pratique, l’efficacité de l’adsorption dépend des sites protéiques et des propriétés chimiques.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Développement d&#39;un marqueur sélectionnable négatif pour les Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Recherche

Immunologie et infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Une nouvelle méthode de dépistage pour l&#39;évolution dirigée des enzymes thermostables bactériolytique

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Spectrométrie de masse des antigènes glycosphingolipides

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Protégé antigènes fonctionnels globules rouges par la membrane greffage de compacts Polyglycérols hyperbranchés

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Détecter Cortex Fragments Pendant bactérienne Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Purification du compartiment membranaire pour dégradation associés au réticulum endoplasmique des antigènes exogènes dans présentation croisée

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...