Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch "Finanziamento di Ricerca di Ateneo", L. Baccigalupi, Projekttitel "SP-LAY: bakterielle Sporen als live-Plattform für die Anzeige der Proteine".

1. Adsorption Reaktion
<ol><li>Inkubieren Sie 2, 5 und 10 µg des mRFP mit 2 x 109 von B. Subtilis Wildtyp gereinigte Sporen in 200 µL Puffer, 50 mM Natriumcitrat, pH 4.0 (16,7 mM Natriumcitrat Dihydrat; 33,3 mM Zitronensäure) für 1 h bei 25 ° C auf einem schaukelnden Shaker (Abbildung 1) verbindlich .</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Bindung Mischungen (13.000 X g für 10 min) um Pellets (P2, P5 und P10) und Überstände (S2, S5 und S10) fraktionieren. Spe...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. 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G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Dieses Spore-Adsorption-Protokoll ist sehr einfach und unkompliziert. Die Reaktion richtet sich streng nach den pH-Wert des Puffers Reaktion und die Effizienz der Adsorption ist optimal bei sauren pH-Werten (pH 5,0 oder niedriger). Im neutralen pH-Bedingungen die Effizienz der Adsorption ist gering, und bei alkalischen pH-Werten Adsorption kann nicht auftreten. Mit einem Volumen von 200 µL in 1,5 mL Röhrchen (oder ein ähnliches Verhältnis zu halten) auf einen rockigen Shaker optimalen Adsorption ergibt.
<p class=...

Display-Systeme sollen biologisch aktive Molekülen auf der Oberfläche von Mikroorganismen zu präsentieren und finden Anwendungen in den unterschiedlichsten Bereichen von Industrie, Medizin- und Umwelttechnik Biotechnologien. Neben Phagen1,2 und Zellen von verschiedenen gram-positive Art3,4,5,6,7, wurden ebenfalls Bakteriensporen als Display-Systeme von zwei Ansätze8,9vorgeschlagen.
Wegen seiner besonderen Struktur, nämlich eine dehydrierte Zytoplasma umgeben von einer Reihe von Schutzschichten10, bietet die Spore mehrere Vorteile gegenüber Phagen und zellbasierte Display Systeme8,9. Ein erste Vorteil ist die extreme Robustheit und Stabilität der Sporen zu Konditionen, die für alle anderen Zellen10,11schädlich wäre. Spore-Anzeige Antigene und Enzyme sind stabil, nach längerer Lagerung bei Raumtemperatur12 und vor Abbau bei niedrigem pH-Wert und hohen Temperaturen13 geschützt. Ein zweiter Vorteil der Sporen ist die Sicherheit vieler Spore-bildenden Arten. B. Coagulans, B. Subtilis, B. Clausiiund mehrere andere Arten werden weltweit als Probiotika verwendet und wurden auf dem Markt für den menschlichen oder tierischen Einsatz für Jahrzehnte14,15. Diese außergewöhnliche Sicherheitsbilanz ist eine offensichtliche allgemeine Voraussetzung für ein DGM-Anzeige-System und ist von besonderer Bedeutung, wenn das System für menschlichen oder tierischen Gebrauch16vorgesehen ist. Ein Drittel ist wichtiger Vorteil der eine Spore-basierte Display-System, dass es keinen Beschränkungen für die Größe des Moleküls, die ausgesetzt werden. In Phagen-basierten Systemen eine große heterologen Proteinen beeinträchtigen die Struktur der das Kapsid während in Zell-basierte Systeme, es kann Einfluss auf die Struktur der Membran oder Grenze/beeinträchtigen können die Membran Translokation Schritt17. Rund um die Spore Schutzschichten bestehen aus mehr als 70 verschiedene Proteine10 und sind flexibel genug, um große Fremdeiweiße ohne offensichtlich Konstruktionsfehler oder Funktionsbeeinträchtigung8akzeptieren. Darüber hinaus ist die Membran Translokation des heterologen Proteins mit beiden Spore-basierte Display-Systeme nicht erforderlich8,9. In der Tat heterologen Proteine entweder in der Mutterzelle Zytoplasma hergestellt und montiert auf der Spore, die im gleichen Zytoplasma bildet oder adsorbiert an der Reifen Spore8,9.
Spore-Anzeige wurde zunächst durch die Entwicklung einer genetischen Systems um die Spore Oberfläche18Ingenieur erhalten. Dieses genetische System beruhte auf i) den Bau einer gen-Fusion zwischen der gen-Codierung für eine Spore-Hüllprotein (verwendet als Träger) und für das Protein zu kodierenden gen angezeigt - die transkriptionelle und translationale Signale von der endogenen gen steuert den Ausdruck der Verschmelzung und Ii) Integration von Chimären gen auf dem Chromosom B. Subtilis , genetische Stabilität zu gewähren. Eine Vielzahl von Antigenen und Enzyme dieser rekombinanten Ansatz, mit verschiedenen Spore Oberflächenproteine als Träger und mit dem Ziel verschiedene Anwendungsmöglichkeiten, von Schleimhaut Impfstoff bis hin zu Biokatalysator, Biosensor, Bioremediation, angezeigt worden oder bioanalytische Tool8,13.
Vor kurzem wurde ein anderer Ansatz von Spore Display entwickelten19. Diese zweite System ist nonrecombinant und stützt sich auf die spontane und extrem engen Adsorption der Moleküle auf der Oberfläche Spore-9. Antigene19,20 und Enzyme13,21 effizient angezeigt worden und haben gezeigt, dass diese Methode ist wesentlich effizienter als die rekombinante. Dieser nonrecombinant Ansatz ermöglicht die Darstellung von Proteinen in gediegener Form20 und kann auch verwendet werden, mit autoklaviert, Tod Sporen19. Der molekulare Mechanismus der Adsorption ist noch nicht vollständig geklärt. Die negative Ladung und der Hydrophobie der Spore wurden als relevanten Eigenschaften für die Adsorption13,19,22vorgeschlagen. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass ein Modell-Protein, das rote Autofluorescent Protein (mRFP) von den Korallen Discosoma, wenn um die Spore, adsorbiert durch die Lokalisierung in der inneren Schicht23Oberflächenschichten zu infiltrieren konnte. Wenn auch für andere Proteine nachgewiesen, erklären die internen Lokalisierung der heterologen Proteine ihre erhöhte Stabilität wenn Sporen23adsorbiert.
In einer aktuellen Studie zwei Enzyme katalysieren zwei aufeinander folgenden Schritten des Xylan-Abbau-Signalwegs waren unabhängig voneinander auf Sporen von B. Subtilis angezeigt und wenn gemeinsam inkubiert wurden beide Abbau Schritte21durchführen. Sporen gesammelt, nachdem die Reaktion waren noch aktiv und können weiterhin die Xylan-Abbau auf die Zugabe von frischem Substrat21. Selbst wenn ein Verlust von etwa 15 % des Endprodukts in der zweiten Reaktion21beobachtet wurde, ist die Wiederverwendbarkeit von adsorbierten Enzyme für einzelne, als auch Multi-Step Reaktionen ein weiterer wichtiger Vorteil der Spore-Display-System.
Pan Et Al.24 berichtete eine weitere Annäherung an heterologen Proteine auf der Oberfläche der Spore anzeigen: heterologe Proteine (ein Endoglucanase Protein und ein Beta-Galaktosidase man) in die Mutterzelle in Sporenbildung erzeugt wurden spontan eingehüllt in den bildenden Spore-Mantel, ohne die Notwendigkeit eines Trägers. Diese zusätzliche Spore-Display-System ist eine Kombination der beiden Ansätze bisher beschriebenen. Tatsächlich ist es rekombinante, da die heterologe Proteine entwickelt wurden, um in der Mutterzelle während der Sporenbildung, ausgedrückt werden, während deren Montage innerhalb der Mantel spontan war und daher nonrecombinant24. Jedoch bleibt die Effizienz der Anzeige dieses zusätzliche Ansatzes getestet und verglichen mit den anderen beiden Ansätzen mithilfe der gleichen heterologen Proteinen.
Dieses Protokoll schließt die Prozesse der Spore Produktion und Reinigung, die wurden ausführlich an anderer Stelle beschrieben24. Freuen Sie sich auf die Adsorption Reaktion, die Bewertung der Effizienz der Adsorption von Dot-Blot und Fluoreszenz-Mikroskopie und rundet das recycling von adsorbierten Enzyme für zusätzliche Reaktion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

Die bakterielle Spore ist ein metabolisch ruhenden Zelle, durch eine Reihe von Schutzschichten, die rund um eine dehydrierte Zytoplasma gebildet. Diese eigenartige Struktur macht die Spore, extrem stabil und widerstandsfähig und hat vorgeschlagen, die Verwendung von der Spore als Plattform zur heterologen Moleküle anzuzeigen. So weit, eine Vielzahl von Antigenen und Enzyme angezeigt worden auf Sporen von Bacillus Subtilis und ein paar andere Arten zunächst durch einen rekombinanten Ansatz und dann durch eine einfache und effiziente Methode, nonrecombinant. Nonrecombinant Display-System basiert auf der direkten Adsorption von heterologen Moleküle auf der Oberfläche von Spore, den Bau von rekombinanten Stämme und die Freisetzung von gentechnisch veränderten Bakterien in der Umwelt zu vermeiden. Adsorbierten Moleküle sind stabilisiert und geschützt durch die Interaktion mit Sporen, die den raschen Abbau von Antigenen und den Verlust der Enzymaktivität bei ungünstigen Bedingungen begrenzt. Wenn, können für zusätzliche Reaktion runden Spore adsorbiert Enzyme leicht mit einer minimalen Reduktion der Aktivität gesammelt und wiederverwendet werden. In diesem Papier wird gezeigt, wie zu adsorbieren, Modell Moleküle an gereinigten Sporen von B. Subtilis, wie die Effizienz der Adsorption bewerten und sammeln von gebrauchten Sporen um sie für neue Reaktionen zu recyceln.

Erfolgreiche Adsorption kann durch westliche Beflecken beurteilt werden. Auf die Reaktion die Mischung wird durch Zentrifugation fraktioniert und gewaschen, und der Pellet-Bruch (Abbildung 1) wird verwendet, um die Oberflächenproteine zu extrahieren. Der Extrakt ist von SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE), Electrotransferred ein Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran, fraktioniert und gegen primäre und sekundäre Antikörper reagiert. Das Vorhandensei...

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Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Bakteriensporen als "live" nanobiotechnologische Werkzeug zu adsorbieren, heterologe Moleküle mit verschiedenen biologischen Aktivitäten. Die Methoden zur Messung der Effizienz der Adsorption werden ebenfalls angezeigt.

Spore-Adsorption als ein Nonrecombinant Display-System für Enzyme und Antigene

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Lebende bakterielle Sporen mit Antigen oder Enzymen sind funktionell aktive Nanopartikel, die als Schleimhautimpfstoffe oder Biokatalysatoren verwendet werden können. Grundsätzlich kann jedes Protein effizient auf Sporen adsorbiert werden. Diese Technik ist einfach und erfordert keine genetische Manipulation.Daher ist keine Freisetzung rekombinanter Organismen in die Umwelt beteiligt. Neben der Schleimhautimpfung für Mensch und Tier können Sporen mit Enzymen als wiederverwendbare Biokatalysatoren entwickelt werden. Beginnen Sie mit der Kennzeichnung von zwei mal 10 bis zum neunten B.subtilis Wildtyp gereinigten Sporen mit zwei-fünf- oder 10-Mikrogramm-Konzentrationen des Modells RFP in 200 Mikroliter Bindungspuffer, ergänzt mit 50-Millimolar-Natriumcitrat für eine Stunde bei 25 Grad Celsius auf einem Schaukelschüttler.Am Ende der Inkubation die Bindungsmischungen durch Zentrifugation pellet und die Überräube in neue konische Rohre für die anschließende Adsorptionseffizienzanalyse übertragen. Dann die Sporenpellets zweimal mit 200 Mikroliter Bindungspuffer pro Wäsche waschen und die Pellets nach der zweiten Wäsche in 100 Mikroliter frischer Bindungspuffer wieder aufhängen. Für die Oberflächenproteinextraktion 50 Mikroliter jeder adsorbierten Sporenresuspension zu 50 Mikrolitern 2X Natriumdodecylsulfat-Dithiothreitol hinzufügen, um die Oberflächensporenproteine zu saugen.Nach 45 Minuten bei 65 Grad Celsius, sammeln Sie die Mischungen durch Zentrifugation, und laufen 10 Mikroliter jedes Volumens von extrahierten Proteinen übereinem westlichen Fleck, wobei ein monoklonaler Anti-His-Antikörper den His-Tag erkennt, der am N-Terminus von mRFP vorhanden ist, um die markierten Oberflächenproteine zu identifizieren. Um die adsorbierten Moleküle durch Fluoreszenzmikroskopie zu lokalisieren und zu quantifizieren, fügen Sie fünf Mikroliter der adsorbierten Sporenresuspension zu 95 Mikroliter PBS hinzu und fügen Sie fünf Mikroliter jeder resultierenden Suspension auf einzelne Mikroskopschlitten hinzu. Legen Sie einen mit Poly-L-Lysin behandelten Deckelauf auf jedes Dia und legen Sie ein Dia auf eine Fluoreszenzmikroskopstufe.Speichern Sie dann für jedes Feld die Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopiebilder. Öffnen Sie für die Bildanalyse die Fluoreszenzmikroskopiebilder in ImageJ, und wählen Sie Bild und Typ aus, um zu bestätigen, dass alle Bilder im Acht-Bit-Format vorliegen. Wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen aus, und bestätigen Sie, dass Fläche, integrierte Dichte und mittlerer Grauwert ausgewählt sind.Verwenden Sie ein Zeichnungs- oder Auswahlwerkzeug, um eine Linie um den Interessenssporen zu zeichnen, und wählen Sie Im Menü Analysieren die Option Messen aus. Es wird ein Popupfeld mit einem Stapel von Werten für die ausgewählte Sporen angezeigt. Nachdem mindestens 50 Sporen ausgewählt wurden, wählen Sie mehrere Regionen ohne Sporen aus, und wiederholen Sie die Messung, um einen Messwert für die Hintergrundfluoreszenz zu erhalten.Nachdem Sie mehrere Hintergrundmessungen erhalten haben, kopieren Sie alle Daten im Ergebnisfenster in eine Kalkulationstabelle, und berechnen Sie den Mittelwert der integrierten Dichte im Bereich der ausgewählten Sporen und die Hintergrundfluoreszenzwerte, um die korrigierte Gesamtfluoreszenz pro Zelle zu erhalten. Für die indirekte Adsorptionseffizienzbewertung Sechs zweifache serielle Verdünnungen von gereinigtem mRFP bei einer Konzentration von 0,5 Nanogramm pro Mikroliter auf ein Endvolumen von 250 Mikrolitern pro Verdünnung im Bindungspuffer und eine entsprechende experimentelle Anzahl von zweifachen seriellen Verdünnungen von 100 Mikrolitern jeder reservierten Überstandprobe, die den ungebundenen mRFP-Anteil der Adsorptionsreaktion mit 100 Mikrolitern bindungspuffern. Als nächstes schneiden Sie eine Nitrocellulosemembran mit einem 0,45-Mikrometer-Cutoff auf eine Größe von neun mal zehn Zentimetern, um einen Fünf-Mal-mit-sechs-Punkte-der-Verdünnungsbereich abzudecken, ohne sich über den Rand der Dichtung des Punktfleckapparats hinaus auszudehnen.Legen Sie die vornasse Membran in das Punktblot-Gerät. Überprüfen Sie die richtige Größe der Membran, und entfernen Sie alle Luftblasen, die zwischen der Membran und der Dichtung eingeschlossen sind. Montieren Sie das Vom Hersteller beschriebene Punktblot-Gerät und decken Sie den unbenutzten Teil des Geräts ab, um zu verhindern, dass sich Luft durch diese Brunnen bewegt.Wenn das Gerät fertig ist, laden Sie die Norm in den beiden äußeren Bahnen und die Proben in den mittleren Bahnen mit 100 Mikroliter jeder geeigneten Verdünnung pro Brunnen. Wenn alle Proben geladen sind, schalten Sie die Vakuumpumpe für zwei Minuten ein, bevor Sie das Vakuum anhalten und die Proben durch die Membran durch die Schwerkraft filtern können. Nach 10 Minuten jeden Brunnen mit 100 Mikroliter PBS waschen.Führen Sie die Vakuumpumpe weitere fünf Minuten aus. Wenn der Waschpuffer vollständig aus dem Gerät abgelassen ist, während das Vakuum eingeschaltet ist, lösen Sie die Schrauben und öffnen Sie vorsichtig das Punktblot-Gerät. Verarbeiten Sie dann die Membran nach den üblichen Western Blot-Protokollen.Öffnen Sie für die densitometrische Analyse des Filters ImageJ, und skizzieren Sie jeden Punkt, um die integrierte Dichte mithilfe des Befehls Analysieren, Messen zu messen, wie gezeigt. Um eine Hintergrundkorrektur des Bildes vorzunehmen, zeichnen Sie einen Kreis in einem leeren Bereich, und messen Sie seine integrierte Dichte, wie gezeigt. Korrelieren Sie die integrierte Dichte der Standardpunkte mit der Menge des geladenen Proteins, um eine Kalibrierlinie zu erhalten, und verwenden Sie die Kalibrierkurve, um die Konzentration von mRFP jedes Probenpunkts zu extrapolieren.Die Konzentration des in den ungebundenen Fraktionen verbleibenden mRFP kann dann berechnet werden. Das Vorhandensein von Proteinen der erwarteten Größe nur in den Bahnen, die mit einem Extrakt der adsorbierten Sporen beladen sind, ist ein Indiz für eine erfolgreiche Adsorptionsreaktion. Die direkte Bewertung der Adsorptionseffizienz hängt vom verwendeten heterologen Protein ab und kann durch Fluoreszenzmikroskopie und Zytofluorimemetrie der Pelletfraktion nach der Fraktionierung der Adsorptionsreaktion durchgeführt werden.Die Quantifizierung der auf Sporen vorhandenen Fluoreszenzsignale kann dann mit ImageJ durchgeführt werden, wie gezeigt. Eine indirekte Analyse der Adsorptionseffizienz kann durch eine Punktblotting-Analyse der Überstandfraktion durchgeführt werden, die das ungebundene Protein enthält, und eine nachfolgende densitometrische Analyse des ungebundenen Proteins ermöglicht die indirekte Berechnung der Menge des auf die Sporen adsorbierten Proteins. Obwohl grundsätzlich jedes Protein für die Verwendung als Schleimhautimpfstoffe oder Biokatalysatoren adsorbiert werden kann, hängt die Wirksamkeit der Adsorption in der Praxis von den Proteinstandorten und den chemischen Eigenschaften ab.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Forschung

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