Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
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यह काम "finanziamento डि ricerca di ateneo" के लिए एल baccigalupi, परियोजना शीर्षक "सपा-LAY: बैक्टीरियल बीजाणु के रूप में प्रोटीन प्रदर्शन के लिए जीना मंच" द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. अधिशोषण अभिक्रिया
<ol><li>इनसेबेट 2, 5, और mrfp के 10 μg 2 x 109 बी के साथ सबटिलिस जंगली प्रकार शुद्ध बीजाणु बाध्यकारी बफर के २०० μl में, ५० मिमी सोडियम साइट्रेट, पीएच ४.० (१६.७ मिमी सोडियम साइट्रेट डाइहाइड्रेट; ३?...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

यह बीजाणु अधिशोषण प्रोटोकॉल बहुत सरल और सीधा है । प्रतिक्रिया कड़ाई से प्रतिक्रिया बफर के पीएच पर निर्भर है और अधिशोषण की क्षमता अम्लीय पीएच मूल्यों (पीएच ५.० या कम) पर इष्टतम है । तटस्थ पीएच शर्तों पर, अ...

डिस्प्ले सिस्टम का उद्देश्य सूक्ष्मजीवों की सतह पर जैविक रूप से सक्रिय अणुओं को प्रस्तुत करना और विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोगों को खोजना है, औद्योगिक से चिकित्सा और पर्यावरणीय जैव प्रौद्योगिकियों के लिए । phages के अलावा1,2 और विभिन्न ग्राम की कोशिकाओं-नकारात्मक और सकारात्मक प्रजातियों3,4,5,6,7, बैक्टीरियल बीजाणु भी किया गया है दो दृष्टिकोण8,9द्वारा प्रदर्शन प्रणाली के रूप में प्रस्तावित ।
अपनी विशिष्ट संरचना की वजह से, अर्थात् एक निर्जला कोशिका द्रव्य सुरक्षात्मक परतों की एक श्रृंखला से घिरा हुआ10, बीजाणु फैगे पर कई फायदे प्रदान करता है-और सेल आधारित प्रदर्शन प्रणालियों8,9। एक पहला लाभ है कि शर्तों पर बीजाणु की चरम मजबूती और स्थिरता से आता है कि अंय सभी10,11कोशिकाओं को हानिकारक होगा । बीजाणु प्रदर्शित एंटीजन और एंजाइम कमरे के तापमान12 पर लंबे समय तक भंडारण और कम पीएच और उच्च तापमान13पर गिरावट से संरक्षित करने के बाद स्थिर हैं । बीजाणु का दूसरा लाभ कई बीजाणु बनाने वाली प्रजातियों की सुरक्षा है । बी, बी clausii, बी coagulans, और कई अंय प्रजातियों प्रोबायोटिक्स के रूप में दुनिया भर में इस्तेमाल कर रहे है और मानव या पशु उपयोग के लिए बाजार पर दशकों के लिए किया गया है14,15। इस असाधारण सुरक्षा रिकॉर्ड एक सतह प्रदर्शन प्रणाली के लिए एक स्पष्ट सामांय आवश्यकता है और विशेष रूप से प्रासंगिकता की है जब प्रणाली मानव या पशु उपयोग16के लिए करना है । एक बीजाणु आधारित प्रदर्शन प्रणाली का एक तीसरा, महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह अणु है कि उजागर किया जाना है के आकार के लिए सीमाएं नहीं है । फैगे-आधारित सिस्टम में, एक बड़े विषम प्रोटीन कैप्सिड की संरचना को प्रभावित कर सकता है, जबकि सेल आधारित प्रणालियों में, यह झिल्ली की संरचना को प्रभावित कर सकता है या झिल्ली स्थानांतरण चरण17को ख़राब कर सकता है । बीजाणु आसपास सुरक्षात्मक परतों से अधिक ७० विभिन्न प्रोटीन से बना रहे हैं10 और काफी लचीला किसी भी स्पष्ट संरचनात्मक दोष या कार्यात्मक हानि के बिना बड़े विदेशी प्रोटीन स्वीकार करने के लिए कर रहे हैं8. इसके अलावा, दोनों बीजाणु आधारित प्रदर्शन प्रणालियों के साथ, विषमजातीय प्रोटीन की झिल्ली स्थानांतरण8,9की आवश्यकता नहीं है । दरअसल, विषमजातीय प्रोटीन या तो मदर सेल कोशिका द्रव्य में उत्पादित कर रहे हैं और बीजाणु कि एक ही कोशिका द्रव्य में बनाने या परिपक्व बीजाणु8,9पर अधिशोषित पर इकट्ठे हुए ।
बीजाणु प्रदर्शन शुरू में एक आनुवंशिक प्रणाली विकसित करने के लिए बीजाणु सतह18इंजीनियर द्वारा प्राप्त किया गया था । इस आनुवंशिक प्रणाली मैं पर आधारित था) जीन कोडन के बीच एक बीजाणु कोट प्रोटीन के लिए एक जीन संलयन के निर्माण (एक वाहक के रूप में इस्तेमाल किया) और प्रोटीन के लिए जीन कोडिंग प्रदर्शित किया जा करने के लिए-अंतर्जात के transcriptional और transcriptional संकेतों की उपस्थिति जीन फ्यूजन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करेगा, और ii) आनुवंशिक स्थिरता प्रदान करने के लिए बी. सबटिल्ज क्रोमोजोम पर चिमेरिक जीन का एकीकरण । एंटीजन और एंजाइमों की एक किस्म इस पुनः संयोजक दृष्टिकोण द्वारा प्रदर्शित किया गया है, वाहक के रूप में विभिंन बीजाणु सतह प्रोटीन का उपयोग कर और विभिंन संभावित अनुप्रयोगों पर लक्ष्य, म्यूकोसा वैक्सीन से biocatalyst के लिए लेकर, बायोसेंसर, biocatalyst, या bioanalytical उपकरण8,13।
हाल ही में, बीजाणु प्रदर्शन का एक अलग दृष्टिकोण विकसित किया गया है19। यह दूसरी प्रणाली nonrecombinant है और बीजाणु सतह9पर अणुओं की सहज और अत्यंत तंग सोखना पर निर्भर करता है । 19 एंटीजन,20 और एंजाइमों13,21 है कुशलता से प्रदर्शित किया गया है और पता चला है कि इस पद्धति को पुनः संयोजक एक से काफी अधिक कुशल है । यह nonrecombinant दृष्टिकोण20 देशी फार्म में प्रोटीन के प्रदर्शन की अनुमति देता है और भी autoclaved के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, मौत बीजाणु19. अधिशोषण का आण्विक तंत्र अभी तक पूर्ण रूप से स्पष्ट नहीं किया गया है । 13,19,22अधिशोषण के लिए प्रासंगिक गुणों के रूप में बीजाणु की ऋणात्मक आवेश और जलविरायता का प्रस्ताव किया गया है । हाल ही में, यह दिखाया गया है कि एक मॉडल प्रोटीन, लाल autoफ्लोरोसेंट प्रोटीन कोरल डिस्कोमा के (mrfp), जब बीजाणु को अधिशोषित, सतह भीतरी कोट में स्थानीयकृत परतों के माध्यम से घुसपैठ करने में सक्षम था23। यदि अंय प्रोटीन के लिए सच साबित कर दिया, विषमजातीय प्रोटीन के आंतरिक स्थानीयकरण उनकी वृद्धि की स्थिरता की व्याख्या जब23बीजाणु को अधिशोषित सकता है ।
हाल ही के एक अध्ययन में, दो एंजाइम xylan क्षरण मार्ग के दो क्रमिक कदम उत्प्रेरक स्वतंत्र रूप से बी सबटिलिस के बीजाणु पर प्रदर्शित किए गए थे और, जब एक साथ, दोनों क्षरण कदम21प्रदर्शन करने में सक्षम थे । प्रतिक्रिया के बाद एकत्र Spores अभी भी सक्रिय थे और ताजा सब्सट्रेट21के अलावा पर xylan गिरावट जारी रखने में सक्षम. यहां तक कि अगर अंतिम उत्पाद के बारे में 15% की हानि दूसरी प्रतिक्रिया21में मनाया गया था, एकल, साथ ही बहु कदम के लिए अधिशोषित एंजाइम के reusability, प्रतिक्रियाओं बीजाणु प्रदर्शन प्रणाली का एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण लाभ है ।
पैन एट अल.24 बीजाणु की सतह पर विषम प्रोटीन प्रदर्शित करने के लिए एक अतिरिक्त दृष्टिकोण की सूचना: विषमकोण प्रोटीन (एक endoglucanase प्रोटीन और एक बीटा-गैलक्टोसिडेस एक) बीजाणु के दौरान मदर सेल में उत्पादित सहज थे वाहक की आवश्यकता के बिना, बनाने बीजाणु कोट में फेब्रिक । इस अतिरिक्त बीजाणु प्रदर्शन प्रणाली दो अब तक वर्णित दृष्टिकोण का एक संयोजन है । वास्तव में, यह पुनः संयोजक के बाद से विषमजातीय प्रोटीन को स्पोर्युलेशन के दौरान मदर सेल में व्यक्त किया जा इंजीनियर थे, जबकि कोट के भीतर उनकी विधानसभा सहज था और इसलिए, nonrecombinant24। हालांकि, इस अतिरिक्त दृष्टिकोण के प्रदर्शन की दक्षता का परीक्षण किया है और एक ही विषम प्रोटीन का उपयोग करके अंय दो दृष्टिकोण के साथ तुलना में रहता है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल में बीजाणु उत्पादन और शुद्धिकरण की प्रक्रियाएं शामिल नहीं हैं, जिन्हें24स्थानों पर व्यापक रूप से वर्णित किया गया है । यह अधिशोषण प्रतिक्रिया, डॉट द्वारा अधिशोषण की दक्षता का मूल्यांकन-सोख्ता और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और अतिरिक्त प्रतिक्रिया दौर के लिए अधिशोषित एंजाइम की रीसाइक्लिंग शामिल हैं ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

बैक्टीरियल बीजाणु एक metabolically शांत सेल, सुरक्षात्मक एक निर्जला कोशिका द्रव्य आसपास के परतों की एक श्रृंखला के द्वारा गठित है । इस अजीब संरचना बीजाणु अत्यंत स्थिर और प्रतिरोधी बनाता है और एक मंच के रूप में बीजाणु का उपयोग करने के लिए विषम अणुओं को प्रदर्शित करने का सुझाव दिया है । अब तक, एंटीजन और एंजाइमों की एक किस्म बेसिलस सबटिलिस और कुछ अंय प्रजातियों के बीजाणुओं पर प्रदर्शित किया गया है, शुरू में एक पुनः संयोजक दृष्टिकोण द्वारा और फिर, एक सरल और कुशल nonrecombinant विधि द्वारा । nonrecombinant प्रदर्शन प्रणाली बीजाणु सतह पर विषमजातीय अणुओं के प्रत्यक्ष सोखना पर आधारित है, पुनः संयोजक उपभेदों के निर्माण से परहेज और पर्यावरण में आनुवंशिक रूप से संशोधित बैक्टीरिया की रिहाई. अधिशोषित अणुओं को बीजाणुओं के साथ अंतःक्रिया द्वारा स्थिर और संरक्षित किया जाता है, जो प्रतिजनों के तेजी से क्षरण और प्रतिकूल परिस्थितियों में एंजाइम गतिविधि की हानि को सीमित करता है । एक बार उपयोग किया, बीजाणु-अधिशोषित एंजाइमों गतिविधि की एक ंयूनतम कमी के साथ आसानी से एकत्र की जा सकती है और अतिरिक्त प्रतिक्रिया दौर के लिए पुन: उपयोग । इस पत्र में दर्शाया गया है कि किस प्रकार मॉडल अणुओं को बी-सबटिल्सके शुद्ध बीजाणु के रूप में देखा जाता है, सोखना की दक्षता का मूल्यांकन कैसे किया जाता है, और उपयोग किए गए बीजाणु को नई प्रतिक्रियाओं के लिए रीसायकल करने के लिए कैसे एकत्र करना चाहिए ।

सफल अधिशोषण पश्चिमी blotting द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । प्रतिक्रिया पर, मिश्रण केंद्रापसारक और धोया द्वारा fractionated है, और गोली अंश (चित्रा 1) के लिए सतह प्रोटीन निकालने के लिए प्र?...

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Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

इस प्रोटोकॉल को विभिन्न जैविक गतिविधियों के साथ विषमजीवी अणुओं adsorb करने के लिए एक "लाइव" nanobiotechnological उपकरण के रूप में बैक्टीरियल बीजाणु के उपयोग पर केंद्रित है । अधिशोषण की कुशलता को मापने की विधियाँ भी दिखाई जाती हैं.

बीजाणु अधिशोषण एंजाइम और एंटीजन के लिए एक Nonrecombinant प्रदर्शन प्रणाली के रूप में

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

एंटीजन या एंजाइमों को प्रदर्शित करने वाले लाइव बैक्टीरियल बीजाणु कार्यात्मक रूप से सक्रिय नैनोकण होते हैं जिनका उपयोग म्यूकोसल टीके या बायोकैटालिस्ट के रूप में किया जा सकता है। सिद्धांत रूप में, किसी भी प्रोटीन को कुशलतापूर्वक बीजाणुओं के लिए सोख सकता है। यह तकनीक सरल है और इसके लिए किसी आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता नहीं है।इसलिए, पर्यावरण में पुनर्संयोजन जीवों की कोई रिहाई शामिल नहीं है। मनुष्यों और जानवरों के लिए म्यूकोसल वैकेशनोलॉजी के अलावा, एंजाइमों को प्रदर्शित करने वाले बीजाणुओं को पुन: प्रयोज्य बायोकैटेलिजर के रूप में विकसित किया जा सकता है। एक रॉकिंग शेकर पर 25 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए ५०-मिलीमोलर सोडियम साइट्रेट के साथ पूरक बाध्यकारी बफर के २०० माइक्रोलीटर में मॉडल आरएफपी के दो-पांच या 10 माइक्रोग्राम सांद्रता के साथ नौवें बी सबटिलिस जंगली प्रकार शुद्ध बीजाणुओं के लिए दो बार 10 लेबलिंग द्वारा शुरू करते हैं ।इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्री द्वारा बाध्यकारी मिश्रण को गोली दें, और बाद में सोखने दक्षता विश्लेषण के लिए सुपरनेटेंट को नई शंकु नलियों में स्थानांतरित करें। फिर, बीजाणु छर्रों को प्रति धोने के 200 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं, दूसरे धोने के बाद ताजा बाध्यकारी बफर के 100 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करें। सतह प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, सतह बीजाणु प्रोटीन को घुलनशील करने के लिए 2X सोडियम डोडेसिल सल्फेट-डियोथरेटोल के 50 माइक्रोलीटर में प्रत्येक सोज़ोबेड बीजाणु पुनर्सपियन के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें।65 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के बाद, अपकेंद्रित्र द्वारा मिश्रण इकट्ठा करें, और एक पश्चिमी दाग पर निकाले गए प्रोटीन सुपरनेट की प्रत्येक मात्रा के 10 माइक्रोलीटर चलाएं, एक मोनोक्लोनल एंटी-उसकी एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबल वाली सतह प्रोटीन की पहचान करने के लिए एमआरएफपी के एन-टर्मिनस में मौजूद उनके टैग को पहचानने के लिए। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा सोज़ोबेड अणुओं को स्थानीयकृत और मात्रा निर्धारित करने के लिए, पीबीएस के 95 माइक्रोलीटर में सोख बीजाणु पुनर्पियन के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्रत्येक परिणामी निलंबन के पांच माइक्रोलीटर को व्यक्तिगत माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जोड़ें। प्रत्येक स्लाइड पर एक पॉली-एल-लिसिन-इलाज कवरलिप रखें, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप चरण पर एक स्लाइड रखें।फिर, प्रत्येक क्षेत्र के लिए, चरण-विपरीत और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों को बचाएं। छवि विश्लेषण के लिए, इमेजजे में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों को खोलें, और यह पुष्टि करने के लिए छवि और प्रकार का चयन करें कि सभी छवियां आठ-बिट प्रारूप में हैं। विश्लेषण मेनू से, सेट माप का चयन करें, और पुष्टि करें कि क्षेत्र, एकीकृत घनत्व और मतलब ग्रे मूल्य का चयन किया जाता है।ब्याज के बीजाणु के आसपास एक लाइन आकर्षित करने के लिए एक ड्राइंग या चयन उपकरण का उपयोग करें, और विश्लेषण मेनू से उपाय का चयन करें। चयनित बीजाणु के लिए मूल्यों के ढेर के साथ एक पॉपअप बॉक्स दिखाई देगा। कम से कम 50 बीजाणुओं का चयन किए जाने के बाद, बिना किसी बीजाणुओं के कई क्षेत्रों का चयन करें, और पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के लिए पढ़ने के लिए माप दोहराएं।कई पृष्ठभूमि माप प्राप्त करने के बाद, परिणाम खिड़की में सभी डेटा को स्प्रेडशीट में कॉपी करें, और सही कुल-प्रति-सेल फ्लोरेसेंस प्राप्त करने के लिए चयनित बीजाणुओं और पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस मूल्यों के क्षेत्र में एकीकृत घनत्व के मतलब की गणना करें। अप्रत्यक्ष सोखने दक्षता मूल्यांकन के लिए, बाध्यकारी बफर में 250 माइक्रोलीटर प्रति कमजोर पड़ने की अंतिम मात्रा में 0.5-नैनोग्राम-प्रति-माइक्रोलीटर एकाग्रता पर शुद्ध एमआरएफपी के छह दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ते हैं। और प्रत्येक आरक्षित सुपरनेट नमूने के 100 माइक्रोलीटर के दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने की एक उपयुक्त प्रायोगिक संख्या जिसमें अवशोषण प्रतिक्रिया के अनबाउंड एमआरएफपी अंश शामिल हैं, जिसमें 100 माइक्रोलीटर बाध्यकारी बफर प्रति कमजोर पड़ने के साथ होता है। इसके बाद, डॉट ब्लॉट उपकरण के गैसकेट के किनारे से परे विस्तार किए बिना पांच-नमूना-छह-डॉट्स-ऑफ-कमजोर पड़ने वाले क्षेत्र को कवर करने के लिए, नौ-बाय-10-सेंटीमीटर आकार के लिए 0.45-माइक्रोमीटर कटऑफ के साथ एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को काटें।प्रीवेट झिल्ली को डॉट ब्लॉट उपकरण में रखें। झिल्ली के सही आकार की जांच करें, और झिल्ली और गैसकेट के बीच फंसे किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें। निर्माता द्वारा वर्णित डॉट दाग उपकरण को इकट्ठा करें, और उन कुओं के माध्यम से हवा को जाने से रोकने के लिए उपकरण के अप्रयुक्त हिस्से को कवर करें।जब उपकरण तैयार हो जाता है, तो दो सबसे बाहरी गलियों में मानक लोड करें और प्रत्येक उपयुक्त कमजोर पड़ने के 100 माइक्रोलीटर के साथ बीच की गलियों में नमूने अच्छी तरह से लोड करें। जब सभी नमूनों को लोड किया गया है, वैक्यूम पंप को दो मिनट के लिए चालू करें, वैक्यूम को रोकने से पहले और नमूनों को गुरुत्वाकर्षण द्वारा झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करने की अनुमति दें। 10 मिनट के बाद, पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें।वैक्यूम पंप को एक और पांच मिनट के लिए चलाएं। जब वाशिंग बफर पूरी तरह से उपकरण से सूखा है, जबकि वैक्यूम चालू है, शिकंजा ढीला और ध्यान से डॉट दाग उपकरण खुला। फिर, मानक पश्चिमी दाग प्रोटोकॉल के अनुसार झिल्ली को संसाधित करें।फ़िल्टर के घनत्व विश्लेषण के लिए, इमेजजे खोलें और प्रत्येक डॉट को विश्लेषण, मापक आदेश का उपयोग करके एकीकृत घनत्व को मापने के लिए रेखांकित करें जैसा कि प्रदर्शन किया गया है। छवि का पृष्ठभूमि सुधार करने के लिए, एक खाली क्षेत्र में एक चक्र बनाएं, और प्रदर्शन के अनुसार इसके एकीकृत घनत्व को मापें। एक अंशांकन लाइन प्राप्त करने के लिए लोडेड प्रोटीन की मात्रा के साथ मानक बिंदुओं के एकीकृत घनत्व को सहसंबंधित करें, और प्रत्येक नमूना बिंदु के एमआरएफपी की एकाग्रता को एक्सट्रपलेशन करने के लिए अंशांकन वक्र का उपयोग करें।इसके बाद अनबाउंड अंशों में शेष एमआरएफपी की एकाग्रता की गणना की जा सकती है । सोख बीजाणुओं के अर्क से भरी गलियों में ही अपेक्षित आकार के प्रोटीन की उपस्थिति एक सफल सोखने की प्रतिक्रिया का संकेत है। सोखने की दक्षता का प्रत्यक्ष मूल्यांकन विषमता प्रोटीन पर निर्भर करता है जिसका उपयोग किया गया है और सोखने की प्रतिक्रिया के अंश के बाद पैलेटेंस माइक्रोस्कोपी और पैलेटोफ्लोरिमेट्री द्वारा किया जा सकता है।बीजाणुओं पर मौजूद फ्लोरोसेंट संकेतों का मात्राकरण तब प्रदर्शित छविजे का उपयोग करके किया जा सकता है। अबाधित प्रोटीन युक्त सुपरनेट अंश के डॉट ब्लॉटिंग विश्लेषण द्वारा सोखने दक्षता का अप्रत्यक्ष विश्लेषण किया जा सकता है, और बाद में अनबाउंड प्रोटीन का घनत्व विश्लेषण बीजाणुओं पर सोखने वाले प्रोटीन की मात्रा की अप्रत्यक्ष गणना की अनुमति देता है। हालांकि, सिद्धांत रूप में, किसी भी प्रोटीन को म्यूकोसल टीके या बायोकैटालिस्ट के रूप में उपयोग के लिए सोख सकता है, व्यवहार में सोखने की दक्षता प्रोटीन साइटों और रासायनिक गुणों पर निर्भर करती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

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एक नकारात्मक के लिए चयन मार्कर का विकास एटामोइबा हिस्टोलिटिका</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

बैक्टीरियल आसंजन के अध्ययन में कतरें तनाव का परिचय

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A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

निर्देशित थर्मास्टाइबल जीवाणुलयनी एंजाइमों के विकास के लिए एक नई स्क्रीनिंग पद्धति

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipid प्रतिजनों के बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण

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Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

कॉर्टेक्स टुकड़े का पता लगाने के बैक्टीरियल बीजाणु अंकुरण के दौरान

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Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Endoplasmic जालिका के लिए झिल्ली के डिब्बे की शुद्धि-परस्पर प्रस्तुति में Exogenous एंटीजन के जुड़े क्षरण

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Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

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Avidin-बायोटिन प्रणाली के साथ गैर आनुवंशिक सतह सजावट के माध्यम से माइकोबैक्टीरियम bovis बीसीजी वैक्सीन में Exogenous एंटीजन की अभिव्यक्ति

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

वायरल Immunomodulators और मेजबान एंटीवायरल कारकों की पहचान के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में Arbovirus संक्रमण

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...