Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
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Questo lavoro è stato supportato da "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" di L. Baccigalupi, titolo del progetto "SP-LAY: spore batteriche come piattaforma live per la visualizzazione di proteine".

1. reazione adsorbimento
<ol><li>Incubare 2, 5 e 10 µ g di mRFP con 2 x 109 di b. subtilis spore purificate di selvaggio-tipo a 200 µ l di binding buffer, citrato di sodio di 50 mM, pH 4,0 (16,7 mM sodio citrato diidrato; acido citrico 33,3 mM) per 1 h a 25 ° C in un agitatore oscillante (Figura 1) .</li>
	<li>Centrifugare le miscele di associazione (13.000 x g per 10 min) per frazionare pellet (P2, P5 e P10) e surnatanti (S2, S5 e S10). Memorizzare i surnat...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Questo protocollo di adsorbimento di spora è molto semplice e diretto. La reazione è strettamente legata al pH del tampone di reazione e l'efficienza di adsorbimento è ottima a valori di pH acido (pH 5.0 o inferiore). Alle condizioni di pH neutro, l'efficienza di adsorbimento è bassa, e a valori di pH alcalini, adsorbimento non può verificarsi. Adsorbimento ottima si ottiene utilizzando un volume di 200 µ l in tubi da 1,5 mL (o mantenere un rapporto simile) su un agitatore a dondolo.
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Sistemi di visualizzazione sono finalizzati a presentare molecole biologicamente attive sulla superficie dei microrganismi e trovare applicazioni in vari campi, da industriale a biotecnologie mediche e ambientali. Oltre alle cellule di varie gram-negativo e - positivo specie3,4,5,6,7, fagi1,2 e sono state anche le spore batteriche proposto come sistemi di visualizzazione da due approcci8,9.
Per la sua peculiare struttura, vale a dire un citoplasma disidratato, circondato da una serie di strati protettivi10, la spora offre diversi vantaggi rispetto dei fagi e basate sulle cellule display sistemi8,9. Un primo vantaggio deriva dalla estrema robustezza e stabilità delle spore alle condizioni che sarebbero deleterie per tutte le altre cellule10,11. Spora-visualizzati gli antigeni e gli enzimi sono stabili dopo prolungato stoccaggio a temperatura ambiente12 e protetto dal degrado a basso pH e alte temperature13. Un secondo vantaggio delle spore è la sicurezza di molte specie di spore. B. subtilis, b. clausii, b. coagulanse numerose altre specie sono utilizzati in tutto il mondo come i probiotici e sono stati sul mercato per uso umano o animale per decenni14,15. Questo record di sicurezza eccezionale è un requisito generale ovvio per un sistema di visualizzazione della superficie ed è di particolare rilevanza quando il sistema è inteso per uso umano o animale16. Un terzo, importante vantaggio di un sistema di visualizzazione basati su spore è che non ha limitazioni per la dimensione della molecola che deve essere esposto. Nei sistemi basati su fagi, una grossa proteina eterologa può influenzare la struttura del capside, mentre nei sistemi basati su cellulare, possono influenzare la struttura della membrana o limite/possono compromettere la traslocazione di membrana passo17. Gli strati protettivi che circonda la spora sono composti da più di 70 diverse proteine10 e sono abbastanza flessibili da accettare grandi proteine straniere senza evidenti difetti strutturali o compromissione funzionale8. Inoltre, con due sistemi di visualizzazione basati su spore, la traslocazione di membrana della proteina eterologa non è richiesto8,9. Infatti, le proteine eterologhe sono sia prodotta nel citoplasma della cellula madre e assemblate su spore che si sta formando nel citoplasma stesso o adsorbito la spora matura8,9.
Visualizzazione di spora inizialmente è stata ottenuta attraverso lo sviluppo di un sistema genetico per la superficie di spora18l'ingegnere. Questo sistema genetico è stato basato su i) la costruzione di una fusione genica tra il gene che codifica per una proteina del cappotto di spora (usata come vettore) e del gene che codifica per la proteina essere visualizzati - la presenza dei segnali trascrizionali e traslazionali dell'endogena gene controllerà l'espressione della fusione e ii) integrazione del gene chimerico sul cromosoma di b. subtilis per garantire stabilità genetica. Una varietà di antigeni ed enzimi sono stati esposti da questo approccio ricombinante, utilizzando varie proteine di superficie spore come vettori e che mira a vari potenziali applicazioni, che vanno dal vaccino mucoso biocatalizzatore, biosensori, bioremediation, o Bioanalytical strumento8,13.
Più recentemente, un approccio diverso del display spora è stato sviluppato19. Questo secondo sistema è nonrecombinant e si basa sull'adsorbimento di molecole sulla superficie spora9spontanea ed estremamente stretto. Antigeni19,20 ed enzimi13,21 sono state visualizzate in modo efficiente e hanno rivelato che questo metodo è molto più efficiente rispetto a quello ricombinante. Questo approccio nonrecombinant permette la visualizzazione di proteine in forma nativa20 e può essere utilizzato anche con autoclavato, spore morte19. Il meccanismo molecolare di adsorbimento non è stato completamente chiarito ancora. La carica negativa e l'idrofobicità della spora sono stati proposti come proprietà rilevanti per l'adsorbimento13,19,22. Recentemente, è stato indicato che una modello proteina, la proteina autofluorescent rosso (mRFP) del corallo Discosoma, quando adsorbiti alla spora, era in grado di infiltrarsi attraverso gli strati superficiali di localizzazione nel cappotto interno23. Se si è rivelato vero per altre proteine, la localizzazione interna delle proteine eterologhe potrebbe spiegare loro maggiore stabilità quando adsorbito a spore23.
In uno studio recente, due enzimi che catalizza due passaggi successivi del pathway di degradazione xilano in modo indipendente sono stati visualizzati su spore di Bacillus subtilis e, quando incubati insieme, erano in grado di eseguire entrambi degradazione passi21. Spore raccolti dopo la reazione erano ancora attive e in grado di continuare la degradazione di xilano sull'aggiunta di substrato fresco21. Anche se la seconda reazione21è stata osservata una perdita di circa il 15% del prodotto finale, la riutilizzabilità degli enzimi adsorbiti per reazioni singole, così come multi-step, è un ulteriore vantaggio importante del sistema di visualizzazione di spora.
Pan et al.24 segnalato un approccio aggiuntivo per visualizzare le proteine eterologhe sulla superficie spora: proteine eterologhe (una proteina endoglucanase e una beta-galattosidasi uno) prodotte nella cellula madre durante la sporulazione erano spontaneamente racchiuso nel cappotto spora che forma, senza la necessità di un vettore. Questo sistema di visualizzazione aggiuntive spora è una combinazione dei due approcci descritti finora. Infatti, è ricombinante poiché le proteine eterologhe sono state progettate per essere espressa nella cellula madre durante la sporulazione, mentre loro assemblaggio all'interno il cappotto è stato spontaneo e, quindi, nonrecombinant24. Tuttavia, l'efficienza del display di questo approccio supplementare rimane per essere testato e confrontato con gli altri due approcci utilizzando le stesse proteine eterologhe.
Il presente protocollo esclude i processi di produzione di spore e purificazione, che sono stati descritti ampiamente altrove24. Esso comprende la reazione di adsorbimento, la valutazione dell'efficienza di adsorbimento da microscopia di fluorescenza e macchiare del puntino, e il riciclaggio degli enzimi adsorbiti per reazione ulteriori giri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

La spora batterica è una cellula metabolicamente quiescente, costituita da una serie di strati protettivi che circondano un citoplasma disidratato. Questa struttura molto particolare rende la spora estremamente stabili e resistenti e ha suggerito l'uso della spora come una piattaforma per mostrare le molecole eterologhe. Finora, una varietà di antigeni ed enzimi sono state visualizzate su spore di Bacillus subtilis e di poche altre specie, inizialmente da un approccio ricombinante e, quindi, da un semplice ed efficace metodo di nonrecombinant. Il sistema di visualizzazione nonrecombinant è basato sull'adsorbimento di molecole eterologhe sulla superficie spora, evitando la costruzione di ceppi ricombinanti e il rilascio di batteri geneticamente modificati nell'ambiente diretto. Molecole adsorbite sono stabilizzati e protetti dall'interazione con le spore, che limita la rapida degradazione degli antigeni e la perdita di attività enzimatica in condizioni sfavorevoli. Una volta utilizzato, spora-adsorbito enzimi possono essere raccolti facilmente con una minima riduzione di attività e riutilizzati per reazione ulteriori giri. In questa carta è indicato come di adsorbire molecole modello a purificata spore di Bacillus subtilis, come valutare l'efficienza di adsorbimento e come raccogliere le spore usate per riciclarle per nuove reazioni.

Adsorbimento di successo può essere valutata mediante western blotting. Al momento la reazione, la miscela è frazionata mediante centrifugazione e lavata, e la frazione di pellet (Figura 1) viene utilizzata per estrarre le proteine di superficie. L'estratto è frazionato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in SDS (pagina), elettrotrasferiti ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) e ha reagito contro gli anticorpi primari e secondari. ...

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Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Questo protocollo è centrato sull'uso delle spore batteriche come strumento nanobiotecnologica "dal vivo" di adsorbire molecole eterologhe con varie attività biologiche. I metodi per misurare l'efficienza di adsorbimento sono anche mostrati.

Adsorbimento di spora come un sistema di visualizzazione Nonrecombinant per gli enzimi e gli antigeni

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Le spore batteriche vive che mostrano antigene o enzimi sono nanoparticelle funzionalmente attive che possono essere utilizzate come vaccini mucosi o biocatalizzatori. In linea di principio, qualsiasi proteina può essere assorbita in modo efficiente alle spore. Questa tecnica è semplice e non richiede alcuna manipolazione genetica.Pertanto, non è coinvolto alcun rilascio di organismi ricombinanti nell'ambiente. Oltre alla vaccinologia della mucosa per l'uomo e gli animali, le spore che mostrano enzimi possono essere sviluppate come biocatalizzatori riutilizzabili. Inizia etichettando due volte 10 alla nona B.subtilis spore purificate di tipo selvatico con concentrazioni di due-cinque o 10 microgrammi del modello RFP in 200 microlitri di tampone legante integrati con citrato di sodio 50 millimolare per un'ora a 25 gradi Celsius su uno shaker a dondolo.Al termine dell'incubazione, pellettare le miscele di legame per centrifugazione e trasferire i supernaganti in nuovi tubi conici per la successiva analisi dell'efficienza di adsorbimento. Quindi, lavare i pellet di spore due volte con 200 microlitri di tampone legante per lavaggio, rimescolando i pellet in 100 microlitri di tampone di legame fresco dopo il secondo lavaggio. Per l'estrazione di proteine superficiali, aggiungere 50 microlitri di ogni ressorbimento delle spore adsorbite a 50 microlitri di dodecil solfato di sodio-ditiothiothreitol per solubilizzare le proteine delle spore superficiali.Dopo 45 minuti a 65 gradi Celsius, raccogliere le miscele per centrifugazione ed eseguire 10 microlitri di ogni volume di proteine estratte supernatanti su una macchia occidentale, usando un anticorpo monoclonale anti-His riconoscendo il Suo tag presente all'N-terminale di mRFP per identificare le proteine superficiali etichettate. Per localizzare e quantificare le molecole adsorbite mediante microscopia a fluorescenza, aggiungere cinque microlitri della ressorbimento della spora adsorbita a 95 microlitri di PBS e aggiungere cinque microlitri di ogni sospensione risultante su singoli vetrini del microscopio. Posizionare una coverslip trattata con poli-L-lisina su ogni diapositiva e posizionare uno scivolo su uno stadio di microscopio a fluorescenza.Quindi, per ogni campo, salvare le immagini di microscopia a contrasto di fase e fluorescenza. Per l'analisi delle immagini, aprite le immagini della microscopia a fluorescenza in ImageJ e selezionate Immagine e Tipo (Image) e Tipo (Type) per confermare che tutte le immagini sono in formato a otto bit. Scegliere Imposta misure dal menu Analizza e verificare che siano selezionati Area, Densità integrata e Valore grigio medio.Utilizzate uno strumento di disegno o selezione per tracciare una linea attorno alla spora di interesse e selezionate Misura (Measure) dal menu Analizza (Analyze). Verrà visualizzata una casella popup con una pila di valori per la spora selezionata. Dopo aver selezionato almeno 50 spore, selezionare diverse regioni senza spore e ripetere la misurazione per ottenere una lettura per la fluorescenza di fondo.Dopo aver ottenuto diverse misurazioni in background, copiare tutti i dati nella finestra Risultati in un foglio di calcolo e calcolare la media della densità integrata nell'area delle spore selezionate e i valori di fluorescenza di fondo per ottenere la fluorescenza totale per cella corretta. Per la valutazione indiretta dell'efficienza di adsorbimento, eseguire sei diluizioni seriali due volte di mRFP purificato a una concentrazione di 0,5 nanogrammi per microlitri a un volume finale di 250 microlitri per diluizione nel buffer di legame e un numero sperimentale appropriato di diluizioni seriali due volte di 100 microlitri di ciascun campione supernatante riservato contenente la frazione mRFP non vincolata della reazione di adsorbimento con 100 microlitri di tampone di legame per diluizione. Successivamente, tagliare una membrana di nitrocellulosa con un taglio di 0,45 micrometri a una dimensione di nove per 10 centimetri, per coprire un'area di diluizione di cinque campioni per sei punti senza estendersi oltre il bordo della guarnizione dell'apparato a macchie di punti.Posizionare la membrana del prewet nell'apparato a macchie a punti. Controllare le dimensioni corrette della membrana e rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra la membrana e la guarnizione. Assemblare l'apparato a macchie di punti come descritto dal produttore e coprire la parte inutilizzata dell'apparecchio per evitare che l'aria si muova attraverso quei pozzi.Quando l'apparecchio è pronto, caricare lo standard nelle due corsie più esterne e i campioni nelle corsie centrali con 100 microlitri di ogni diluizione appropriata per pozzo. Una volta caricati tutti i campioni, accendere la pompa del vuoto per due minuti, prima di arrestare il vuoto e consentire ai campioni di filtrare attraverso la membrana per gravità. Dopo 10 minuti, lavare ogni bene con 100 microlitri di PBS.Eseguire la pompa per vuoto per altri cinque minuti. Quando il tampone di lavaggio si è completamente scaricato dall'apparecchio, mentre il vuoto è aperto, allentare le viti e aprire con cura l'apparato a macchie di punti. Quindi, elaborare la membrana secondo i protocolli western blot standard.Per l'analisi densitometrica del filtro, aprire ImageJ e delineare ogni punto per misurare la densità integrata utilizzando il comando Analizza, misura come illustrato. Per apportare una correzione di sfondo all'immagine, disegnare un cerchio in un'area vuota e misurarne la densità integrata come dimostrato. Correlare la densità integrata dei punti standard con la quantità di proteine caricate per ottenere una linea di calibrazione e utilizzare la curva di calibrazione per estrapolare la concentrazione di mRFP di ogni punto campione.È quindi possibile calcolare la concentrazione dell'mRFP rimanente nelle frazioni non vincolate. La presenza di proteine della dimensione prevista solo nelle corsie caricate con un estratto delle spore adsorbite è indicativa di una reazione di adsorbimento riuscita. La valutazione diretta dell'efficienza di adsorbimento dipende dalla proteina eterologa che è stata utilizzata e può essere eseguita mediante microscopia a fluorescenza e citofluorimetria della frazione pellet dopo il frazionamento della reazione di adsorbimento.La quantificazione dei segnali fluorescenti presenti sulle spore può quindi essere eseguita utilizzando ImageJ come dimostrato. Un'analisi indiretta dell'efficienza di adsorbimento può essere eseguita da un'analisi dot blotting della frazione supernatante contenente la proteina non vincolata, e la successiva analisi densitometrica della proteina non vincolata consente il calcolo indiretto della quantità di proteina adsorbita sulle spore. Sebbene, in linea di principio, qualsiasi proteina possa essere adsorbita per l'uso come vaccini mucosi o biocatalografi, in pratica l'efficienza dell'adsorbimento dipende dai siti proteici e dalle proprietà chimiche.

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