Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
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이 작품 "Finanziamento 디 검색 디 Ateneo" L. Baccigalupi, 프로젝트 제목에 의해 지원 되었다 "SP-레이: 세균성 포자 단백질 디스플레이 대 한 라이브 플랫폼으로".

1. 흡착 반응
<ol><li>2, 5, 및 10 µ g mRFP의 바인딩 버퍼, 50 m m 나트륨 구 연산 염, pH 4.0 (16.7 m m 구 연산 나트륨이 수화물; 33.3 m m 구 연산 산) 1 h 락 통 (그림 1)에 25 ° C에서의 200 µ L에 B. subtilis 야생-타입 순화 된 포자의 2 x 109 품 어 .</li>
	<li>펠 릿 (P2, P5, P10)과 (S2와 S5, S10) supernatants 충분치에 바인딩 혼합물 (13000 x g 10 분)을 원심. 3.2 단계에서 설명 하는 흡착?...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

이 포자 흡착 프로토콜은 매우 단순 하 고 간단. 반응이 반응 버퍼의 pH에 엄격 하 게 의존 하 고 흡착 효율은 산 성 pH 값 (pH 5.0 또는 더 낮은)에서 최적의. 중립 pH 조건에서 흡착 효율은 낮은, 그리고 알칼리 성 pH 값에서 흡착 하지 발생할 수 있습니다. 최적의 흡착 락 통에 1.5 mL 튜브 (또는 비슷한 비율을 유지)에 200 µ L의 볼륨을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
흡착이 매우 빡 빡 ...

디스플레이 시스템 미생물의 표면에 생물 학적 활성 분자를 제시 하 고 다양 한 분야, 의료 및 환경 바이오를 산업에서 응용 프로그램을 찾는 겨냥 된다. 페이지1의,2 와 셀의 다양 한 그람 음성 및 긍정적인 종3,,45,,67, 세균성 포자도 있다 두 가지 방법8,9에의해 디스플레이 시스템으로 제안 했다.
독특한 구조, 즉 탈수 세포질 둘러싸여 보호 레이어10의 시리즈 때문에 포자는 몇 가지 이점을 살 균 소 및 셀 기반 디스플레이 시스템8,9를 제공 한다. 첫 번째 장점은 모든 다른 셀10,11해로운 것 조건에서 포자의 안정성과 극단적인 견고성에서 비롯 됩니다. 포자 표시 된 항 원 및 효소는 안정 후 실 온12 에서 스토리지를 연장 및 낮은 pH와 높은 온도13저하에서 보호. 포자의 두 번째 장점은 많은 포자 형성 종의 안전입니다. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, 그리고 다른 여러 종의 probiotics로 사용 되 고 수십 년간14,15인간 또는 동물 사용에 대 한 시장에 왔다. 이 뛰어난 안전 기록 표면 디스플레이 시스템에 대 한 분명 일반적인 요구 사항 이며 때 시스템은 인간 또는 동물 사용16를 위한 특정 한 관련성의 이다. 세 번째, 중요 한 포자 기반 디스플레이 시스템의 장점은 노출 되는 분자의 크기에 대 한 한계는 없습니다. 페이지 기반 시스템에서 분리 단백질이 큰 영향을 미칠 수 구조는 capsid의 셀 기반 시스템에 (서) 동안 그것은 막의 구조에 영향을 미칠 수 있습니다 또는 저하 될 수 있습니다 제한/막 전 단계17. 포자를 둘러싼 보호 계층 이상의 70 다른 단백질10 으로 구성 되며 분명 구조적 결함 또는 기능 장애8없이 큰 외국 단백질을 받아들일 수 있도록 유연. 또한, 두 포자 기반 디스플레이 시스템과 분리 단백질의 막 전은 하지 필요한8,9. 실제로, 분리 단백질 중 어머니 세포 세포질에서 생산 되며 동일한 세포질에 형성 또는 성숙한 포자8,9에 흡착 하는 포자에 조립.
포자 디스플레이 처음 포자 표면18를 유전자 시스템을 개발 하 여 얻은 했다. 이 유전자 시스템에 근거 했다) (캐리어로 사용) 포자 외 투 단백질을 위한 유전자 코딩 하 고 되도록 단백질을 위한 유전자 코딩 사이의 유전자 융합 건설 표시-는 내 생의 transcriptional 변환 신호 존재 유전자 융해, 및 ii의 식을 제어) 유전적 안정성을 부여 하는 B. subtilis 염색체에 공상 유전자의 통합. 항 원 및 효소의 다양 한 항공사와 다양 한 잠재적인 응용 프로그램을 겨냥, biocatalyst, 바이오 센서, bioremediation, 점 막 백신에서까지 다양 한 포자 표면 단백질을 사용 하 여이 재조합 형 접근 방식에 의해 표시 되었습니다 또는 생물 도구8,13.
더 최근에, 포자 디스플레이의 다른 접근 방식이 개발된19되었습니다. 이 두 번째 시스템은 nonrecombinant 고9포자 표면 분자의 자연과 매우 엄격한 흡착 한다. 항 원19,20 및 효소13,21 효율적으로 표시 되었습니다 그리고이 방법은 재조합 형 보다 훨씬 더 효율적 이다 하는 것을 계시 했다. Nonrecombinant 이렇게 네이티브 양식20 에서 단백질의 디스플레이 허용 하 고 사용할 수 있습니다 또한 압력가, 죽음 포자19. 흡착의 분자 메커니즘은 하지 되었습니다 완전히 명백 하 게 아직. 네거티브 차지 하 고 있는 포자의 hydrophobicity 흡착13,,1922에 대 한 관련 속성으로 제안 되었습니다. 최근에, 그것은 모델 단백질, 빨간 autofluorescent 단백질 (mRFP)는 산호 Discosoma, 포자에 흡착 할 때의 내부 코트23에 지역화 표면 레이어를 통해 침투 수 있었습니다 표시 되었습니다. 다른 단백질에 대 한 사실 증명, 분리 단백질의 내부 지역화 포자23에 흡착 될 때 그들의 증가 한 안정성을 설명할 수 있었다.
최근 연구에서 두 효소 catalyzing xylan 저하 통로의 2 개의 연속적인 단계 B. subtilis 의 포자에 독립적으로 표시 했다 고, 함께 알을 품을 때 모두 저하 단계21를 수행 수 있었다. 포자 수집 후 반응 했다 여전히 적극적이 고 신선한 기판21의 추가 따라 xylan 저하를 계속할 수 있습니다. 경우에 최종 제품의 약 15%의 손실 두 번째 반응21에서 관찰 되었다, 다단계, 뿐만 아니라, 단일 반응에 대 한 흡착된 효소의 재사용은 포자 디스플레이 시스템의 추가 중요 한 이점이 다.
팬 외.24 보고 포자 표면에 분리 단백질을 표시 하는 추가 접근: 포자 형성 동안 어머니 셀에서 생산 분리 단백질 (endoglucanase 단백질 및 베타-galactosidase 하나) 자발적으로 했다 운반대의 필요 없이 형성 포자 외 투에 쌌 다. 이 추가 포자 디스플레이 시스템은 지금까지 설명 된 두 가지 방법의 조합. 사실, 그것은 재조합 이후 분리 단백질 코트 내 자신의 어셈블리 자발적인 동안 포자 형성, 동안 어머니 세포에 표현 될 설계 했다 및, 따라서, nonrecombinant24. 그러나,이 추가적인 접근의 표시의 효율성을 테스트 하 고 동일한 분리 단백질을 사용 하 여 다른 두 방법에 비해 남아 있다.
현재 프로토콜 포자 생산의 프로세스를 제외 하 고 정화 되었습니다 설명 되어 광범위 하 게24. 흡착 반응, 도트 blotting과 형광 현미경에 의해 흡착 효율 평가 및 라운드 추가 반응에 대 한 흡착된 효소의 재활용.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

세균성 포자 탈수 세포질을 둘러싼 보호 계층의 시리즈에 의해 형성 된 metabolically 무부하 셀입니다. 이 독특한 구조는 매우 안정적이 고 저항 하는 포자를 만드는 하 고 분리 분자를 표시 하는 플랫폼으로는 포자를 사용 하 여 제안 했다. 처음에 의해 재조합 접근 그리고, 간단 하 고 효율적인 nonrecombinant 방법에 의해 지금까지, 다양 한 항 원 및 효소 새 균의 subtilis 와 다른 몇 가지 종류의 포자에 표시가 되었습니다. Nonrecombinant 디스플레이 시스템 재조합 종자의 구조와 유전자 변형된 박테리아는 환경에의 릴리스를 피하고 포자 표면에 분자를 분리의 직접 흡착을 기반으로 합니다. 흡착된 분자는 안정 하 고 항 원의 급속 한 저하와 불리 한 조건에서 효소 활동의 손실을 제한 하 포자와 상호 작용에 의해 보호. 활용 하 고, 일단 포자 흡착 효소 활동의 최소한의 감소와 함께 쉽게 수집 고 추가 반응 라운드에 대 한 다시 사용할 수 있습니다. 이 종이에 B. subtilis의 순화 된 포자를 모델 분자를 흡착 하는 방법, 흡착의 효율성을 평가 하는 방법 및 새로운 반응에 대 한 재활용 사용된 포자를 수집 하는 방법 표시 됩니다.

성공적인 흡착 부 blotting에 의해 평가 될 수 있다. 반응, 시 혼합물은 원심 분리에 의해 분류 한, 그리고 펠 릿 분수 (그림 1)은 표면 단백질을 추출 하는 데 사용 됩니다. 추출은 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지), polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 electrotransferred에 의해 분류 한 고 1 차 및 이차 항 체에 대 한 반응. 흡착된 포자를 추출 하 여 로드 레인에?...

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Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

이 프로토콜은 다양 한 생물 학적 활동 분리 분자를 흡착 하는 "라이브" nanobiotechnological 도구로 세균성 포자의 사용에 초점을 맞추고. 흡착의 효율성을 측정 하는 방법도 표시 됩니다.

효소와 항 원에 대 한 Nonrecombinant 디스플레이 시스템으로 포자 흡착

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

항원 또는 효소를 표시하는 살아있는 세균성 포자는 점막 백신 또는 생물 촉매로 사용될 수 있는 기능적으로 활성 나노입자입니다. 원칙적으로 모든 단백질은 포자에 효율적으로 흡착될 수 있습니다. 이 기술은 간단하고 어떤 유전 조작을 필요로하지 않습니다.따라서 재조합 유기체가 환경에 방출되지 않는다. 인간과 동물을 위한 점막 백신학 이외에, 효소를 표시하는 포자는 재사용 가능한 biocatalyzers로 개발될 수 있습니다. 먼저 10~9회 B.subtilis 야생식 정제 포자를 2-5 또는 10마이크로그램의 모델 RFP 농도로 200마이크로리터의 결합 완충제20마이크로리터에 흔들 셰이커에서 섭씨 25도에서 1시간 동안 보충합니다.인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의한 결합 혼합물을 펠렛하고, 후속 흡착 효율 분석을 위해 새로운 원판 튜브로 슈퍼네이션을 전송한다. 이어서, 포자 펠릿을 세척당 200 마이크로리터의 결합 버퍼로 두 번 세척하고, 두 번째 세척 후 신선한 결합 버퍼100 마이크로리터로 펠릿을 재연한다. 표면 단백질 추출의 경우, 각 흡착 포자 리서스펜션 50마이크로리터를 2X 나트륨 도데실 황산염-디티오트리톨 50마이크로리터에 추가하여 표면 포자 단백질을 용해시합니다.섭씨 65도에서 45분 후, 원심분리에 의한 혼합물을 수집하고, 서쪽 블롯에 추출된 단백질의 각 부피의 10마이크로리터를 실행하여, 단클론 항-그의 항체를 사용하여 mRFP의 N 단부에서 존재하는 그의 태그를 인식하여 표지된 표면 단백질을 식별한다. 형광 현미경 검사법에 의해 흡착 된 분자를 국소화하고 정량화하려면 흡착 된 포자 재서스펜션 5 개를 PBS의 95 마이크로 리터에 추가하고 각 결과 현탁액5 마이크로 리터를 개별 현미경 슬라이드에 추가합니다. 폴리 L-리신 처리 커버슬립을 각 슬라이드에 놓고 한 슬라이드를 형광 현미경 단계에 놓습니다.그런 다음 각 필드에 대해 위상 대비 및 형광 현미경 이미지를 저장합니다. 이미지 분석을 위해 ImageJ에서 형광 현미경 이미지를 열고 이미지 및 유형을 선택하여 모든 이미지가 8비트 형식으로 되어 있는지 확인합니다. 분석 메뉴에서 측정 설정을 선택하고 영역, 통합 밀도 및 평균 회색 값이 선택되어 있는지 확인합니다.도면 또는 선택 도구를 사용하여 관심 있는 포자 주위에 선을 그리고 분석 메뉴에서 측정을 선택합니다. 선택한 포자에 대한 값 스택이 있는 팝업 상자가 나타납니다. 적어도 50개의 포자가 선택된 후, 포자 없이 여러 영역을 선택하고, 측정을 반복하여 배경 형광에 대한 판독값을 얻습니다.여러 배경 측정을 얻은 후 결과 창내의 모든 데이터를 스프레드시트에 복사하고 선택한 포자 및 배경 형광 값영역에서 통합 밀도의 평균을 계산하여 수정된 셀당 형광을 얻습니다. 간접 흡착 효율 평가를 위해, 결합 버퍼에서 희석당 250 마이크로리터의 최종 부피와 각 예약 된 미신탄 시료 100 마이크로리터의 적절한 실험 수에 대한 0.5 나노그램 당 마이크로리터 농도에서 정제 된 mRFP의 6 배 연속 희석을 수행 하여 10 개의 미바운드 mRFP 분획을 포함하는 각 예약 된 미신 탄성 샘플의 100 마이크로 리터의 적절한 실험 적 수10 마이크로리터. 다음으로, 0.45 마이크로미터 컷오프로 니트로셀룰로오스 멤브레인을 9-10센티미터 크기로 자르고, 도트 블롯 장치의 개스킷 가장자리를 넘어 연장하지 않고 5개의 시료-6점 희석 영역을 덮는다.도트 블롯 장치에 전습 멤브레인을 배치합니다. 멤브레인의 정확한 크기를 확인하고 멤브레인과 개스킷 사이에 갇힌 기포를 제거하십시오. 제조업체에 의해 설명된 바와 같이 도트 블롯 장치를 조립하고, 공기가 그 우물을 통해 이동하는 것을 방지하기 위해 장치의 미사용 부분을 커버한다.장치가 준비되면, 두 개의 가장 외부 차선과 중간 차선의 샘플을 잘 당 각각의 100 마이크로리터로 적재한다. 모든 시료가 적재되면 진공 펌프를 2분 동안 켜고 진공을 멈추고 시료가 중력에 의해 멤브레인을 통과할 수 있도록 합니다. 10분 후, PBS 100마이크로리터로 각 웰을 씻으시면 됩니다.진공 펌프를 5분간 더 실행합니다. 세척 버퍼가 장치에서 완전히 배수되면 진공이 켜져있는 동안 나사를 느슨하게하고 조심스럽게 도트 블롯 장치를 엽니 다. 그런 다음 표준 서부 블롯 프로토콜에 따라 멤브레인을 처리합니다.필터의 밀도 측정 해석의 경우 ImageJ를 열고 각 점을 윤곽을 잡아 분석, 측정 명령을 사용하여 통합 밀도를 측정합니다. 이미지를 배경 보정하려면 빈 영역에 원을 그리고 설명한 대로 통합 밀도를 측정합니다. 표준 도트의 통합 밀도를 적재된 단백질의 양과 상관관계를 맺고 교정 곡선을 사용하여 각 샘플 점의 mRFP 농도를 추정한다.그런 다음 언바운드 분획에 남아있는 mRFP의 농도를 계산할 수 있습니다. 흡착 포자의 추출물이 적재된 차선에서만 예상되는 크기의 단백질의 존재는 성공적인 흡착 반응을 나타낸다. 흡착 효율의 직접적인 평가는 사용되어 온 이종 단백질에 따라 달라지며 흡착 반응의 분획 후 펠릿 분획의 형광 현미경 검사법과 세포성불피계에 의해 수행될 수 있다.포자에 존재하는 형광 신호의 정량화는 시연된 대로 ImageJ를 사용하여 수행될 수 있다. 흡착 효율의 간접분석은 언바운드 단백질을 함유하는 미상부 분획의 도트 블로팅 분석에 의해 수행될 수 있으며, 결합되지 않은 단백질의 후속 밀도 측정 분석을 통해 포자에 흡착된 단백질의 양을 간접적으로 계산할 수 있다. 비록, 원칙적으로, 어떤 단백질은 점막 백신 또는 생물 촉매로 사용하기 위해 흡착 될 수 있지만, 실제로 흡착의 효율성은 단백질 사이트 및 화학 적 특성에 따라 달라집니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

에 대한 부정적인 선택 마커의 개발 Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

내열 Bacteriolytic 효소의 감독 진화에 대한 새로운 검사 방법

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipid 항원의 대량 Spectrometric 분석

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

항원은 컴팩트 Hyperbranched Polyglycerols 중 이식 막으로 기능 적혈구를 보호

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...