Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av «Finanziamento di Ricerca di Ateneo"til L. Baccigalupi, prosjekttittel" SP-LAY: bakteriell sporer live plattform for proteiner visning ".

1. adsorpsjon reaksjon
<ol><li>Inkuber 2, 5 og 10 µg av mRFP med 2 x 109 av B. subtilis vill-type renset sporer i 200 µL av bindende buffer, 50 mM natriumsitrat, pH 4.0 (16,7 mM natriumsitrat dihydrate, 33.3 mM sitronsyre) 1t ved 25 ° C på en rocking shaker (figur 1) .</li>
	<li>Sentrifuge bindende blandinger (13 000 x g i 10 min) å smuldre vekk pellets (P2 P5 og P10) og supernatants (S2, S5 og S10). Lagre supernatants for indirekte vurdering av effektivit...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Denne spore adsorpsjon protokollen er svært enkel og grei. Reaksjonen er strengt avhengig pH i bufferen som reaksjon og effektiviteten av adsorpsjon er optimal på surt pH-verdier (pH 5.0 eller lavere). På nøytral pH forhold, effektiviteten av adsorpsjon er lav, og på alkaliske pH-verdier, adsorpsjon forekomme. Optimal adsorpsjon oppnås med et volum på 200 µL i 1,5 mL rør (eller holde et lignende forhold) på en rocking shaker.
Adsorpsjon er svært stramt, og vasker med en buffer på s...

Displaysystemer er rettet mot presentere biologisk aktive molekyler på overflaten av mikroorganismer og finne programmer i en rekke felt, fra industriell til medisinsk og miljømessige bioteknologi. I tillegg til phages1,2 og cellene i ulike Gram-negative og -positive arter3,4,5,6,7, har bakteriell sporer også vært foreslått som displaysystemer med to tilnærminger8,9.
På grunn av sin særegne struktur, nemlig en dehydrert cytoplasma omgitt av en rekke beskyttende lag10, gir spore flere fordeler sammenlignet med phage - og celle-baserte display systemer8,9. En første fordel kommer fra den ekstreme robusthet og stabilitet av sporer på forhold som ville være skadelig for alle andre celler10,11. Spore vises antigener og enzymer er stabile etter langvarig lagring ved romtemperatur12 og beskyttet mot fornedrelse ved lav pH og høye temperaturer13. En annen fordel med sporene er sikkerheten til mange spore-forming arter. B. subtilis, B. clausii, B. coagulans, og flere andre arter brukes verden over som probiotika og har vært på markedet for mennesker eller dyr bruk for tiår14,15. Dette eksepsjonelle sikkerhet posten er en opplagt generelle forutsetning for et overflaten skjermsystem og er spesielt relevant når systemet er ment for mennesker eller dyr Bruk16. En tredje er viktig fordel av en spore-baserte vise system at den ikke har begrensninger for størrelsen av molekylet som utsettes. I phage-baserte systemer, et stort heterologous protein kan påvirke strukturen av kapsid, mens celle-baserte systemer den kan påvirke strukturen i membranen eller grense/forlengelsesslanger membran translokasjon trinn17. Beskyttende lag rundt spore består av mer enn 70 ulike proteiner10 og er fleksible nok til å akseptere store utenlandske proteiner uten tydelig strukturelle feil eller nedsatt fysisk funksjon8. I tillegg med systemene spore-baserte vise er membran translokasjon av heterologous protein ikke nødvendige8,9. Faktisk er heterologous proteiner enten produsert i mor cellen cytoplasma og montert på spore som danner i samme cytoplasma eller adsorbert på eldre spore8,9.
Spore skjermen ble først innhentet av utvikle en genetisk system til ingeniør spore overflaten18. Denne genetiske systemet var basert på jeg) bygging av en genet fusjon genet koding for en spore pels protein (brukes som en bærer) og gene koding for protein skal vises - tilstedeværelsen av transcriptional og translasjonsforskning signalene fra den endogene Gene vil kontrollere uttrykket av fusion og ii) integrering av chimeric genet på B. subtilis kromosomet gi genetisk stabilitet. En rekke antigener og enzymer har blitt vist av denne rekombinant tilnærming, med ulike spore overflaten proteiner som bærere og sikte på ulike potensielle programmer, alt fra mucosal vaksine biocatalyst, biosensor, bioremediation, eller bioanalytical verktøyet8,13.
En annen tilnærming av spore har nylig vært utviklet19. Dette andre systemet nonrecombinant og avhengig av spontan og stramt opptak av molekyler på spore overflaten9. Antigener19,20 og enzymer13,21 har vist effektivt og har avdekket at denne metoden er betydelig mer effektiv enn den rekombinante. Denne nonrecombinant kan vise proteiner i opprinnelige form20 og kan også brukes med autoklaveres, død sporer19. Molekylær mekanisme adsorpsjon er ikke fullt avklart ennå. Negativ ladning og hydrophobicity av spore har blitt foreslått som egenskaper relevante for adsorpsjon13,19,22. Nylig har det vært vist at en modell protein, røde autofluorescent protein (mRFP) av den coral Discosoma, når adsorbert å spore, klarte å infiltrere gjennom overflaten lag lokalisere i indre lag23. Hvis viste gjelder for andre proteiner, kunne den interne lokaliseringen av heterologous proteiner forklare deres økt stabilitet når adsorbert sporer23.
I en fersk studie, enzymene utløse to påfølgende trinnene i xylan fornedrelse veien var uavhengig vises på sporer av B. subtilis og når ruges sammen, kunne utføre begge fornedrelse trinnene21. Sporer samlet etter reaksjonen var fortsatt aktiv og kan fortsette xylan nedbrytning etter tillegg av fersk substrat21. Selv om et tap på rundt 15% av det endelige produktet ble observert i andre reaksjon21, er gjenbruk av adsorbert enzymer for enkelt, samt flere trinn, reaksjoner en ekstra viktig fordel av spore display system.
Pan et al.24 rapportert flere tilnærming vise heterologous proteiner spore overflaten: heterologous proteiner (en endoglucanase protein og en beta-galactosidase en) produsert i mor cellen under sporulation var spontant innkapslet i forming spore pelsen, uten behovet av en operatør. Denne ekstra spore display system er en kombinasjon av metodene beskrevet så langt. Faktisk er det rekombinant siden heterologous proteiner var konstruert for å bli uttrykt i mor cellen under sporulation, mens deres montering i pelsen var spontan og derfor nonrecombinant24. Effektiviteten av visningen av denne ekstra imidlertid å være testet og sammenliknet med andre metodene ved hjelp av samme heterologous proteiner.
Nåværende protokollen ekskluderer produksjonsprosesser spore og rensing, som har vært beskrevet mye andre steder24. Det inkluderer adsorpsjon reaksjonen, evaluering av effektiviteten av adsorpsjon av dot-blotting og fluorescens mikroskopi, og resirkulering av adsorbert enzymer for ekstra reaksjon runder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

Bakteriell spore er en metabolically quiescent celle, dannet av en rekke beskyttende lag rundt en dehydrert cytoplasma. Denne særegne strukturen gjør spore ekstremt stabil og motstandsdyktig og har foreslått bruk av spore som en plattform for å vise heterologous molekyler. Så langt, en rekke antigener og enzymer har vært vist på sporer av Bacillus subtilis og noen andre arter, først med en rekombinant tilnærming, og deretter, etter en enkel og effektiv nonrecombinant metode. Nonrecombinant skjermsystemet er basert på direkte opptak av heterologous molekyler på spore overflaten, unngå bygging av rekombinant stammer og utgivelsen av genmodifiserte bakterier i miljøet. Adsorbert molekyler er stabilisert og beskyttet av samspillet med sporer, som begrenser rask nedbrytning av antigener og tap av enzym aktivitet i ugunstige forhold. Når utnyttes, kan spore-adsorbert enzymer samlet lett med minimal reduksjon av aktivitet og gjenbrukes for flere reaksjon runder. I dette papiret vises slik adsorberes modell molekyler å renset sporer av B. subtilis, hvordan man skal vurdere effektiviteten av adsorpsjon og hvordan du samler brukt spores for å resirkulere dem for nye reaksjoner.

Vellykket adsorpsjon kan vurderes av vestlige blotting. På reaksjonen, blandingen er fraksjonert med sentrifugering og vasket, og pellets brøken (figur 1) brukes til å hente overflaten proteiner. Ekstraktet er fraksjonert av SDS polyakrylamid gel geleelektroforese (side), electrotransferred til en polyvinylidene fluor (PVDF) membran, og reagerte mot primære og sekundære antistoffer. Tilstedeværelsen av proteiner av forventede størrelsen, bare i kjøref...

Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Denne protokollen fokuserer på bruk av bakteriell spores som et "live" nanobiotechnological-verktøy for å adsorberes heterologous molekyler med ulike biologiske aktiviteter. Metodene for å måle effektiviteten av adsorpsjon vises også.

Spore adsorpsjon som Nonrecombinant Display System for enzymer og antigener

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Levende bakterielle sporer som viser antigen eller enzymer er funksjonelt aktive nanopartikler som kan brukes som slimhinnevaksiner eller biokatlyster. I prinsippet kan ethvert protein effektivt adsorberes til sporer. Denne teknikken er enkel og krever ingen genetisk manipulasjon.Derfor er ingen frigjøring av rekombinante organismer i miljøet involvert. I tillegg til slimhinnevaksiner for mennesker og dyr, kan sporer som viser enzymer utvikles som gjenbrukbare biokatalyzere. Begynn med å merke to ganger 10 til niende B.subtilis wild-type rensede sporer med to-fem-eller 10-mikrogram konsentrasjoner av modell RFP i 200 mikroliter av bindingsbuffer supplert med 50-millimolar natriumsitrat i en time ved 25 grader Celsius på en gyngeshaker.På slutten av inkubasjonen, pellet bindingsblandingene ved sentrifugering, og overfør supernativa til nye koniske rør for etterfølgende adsorpsjonseffektivitetsanalyse. Vask deretter sporepellets to ganger med 200 mikroliter bindingsbuffer per vask, og gjenbruk av pellets i 100 mikroliter med fersk bindingsbuffer etter den andre vasken. For ekstraksjon av overflateproteiner, tilsett 50 mikroliter av hver adsorbert spore resuspensjon til 50 mikroliter av 2X natrium dodecylsulfat-dithiothreitol for å løse overflatesporproteinene.Etter 45 minutter ved 65 grader Celsius, samle blandingene ved sentrifugering, og kjøre 10 mikroliter av hvert volum av ekstrahertproteiner supernatant på en vestlig flekk, ved hjelp av en monoklonal anti-Hans antistoff gjenkjenne hans tag tilstede på N-terminus av mRFP for å identifisere merket overflateproteiner. For å lokalisere og kvantifisere adsorberte molekyler ved fluorescensmikroskopi, tilsett fem mikroliter av adsorbertsporeuspensjon til 95 mikroliter PBS, og legg til fem mikroliter av hver resulterende suspensjon på individuelle mikroskoplyser. Plasser en poly-L-lysinbehandlet dekkslipp på hvert lysbilde, og plasser ett lysbilde på et fluorescensmikroskopstadium.Deretter, for hvert felt, lagre fase-kontrast og fluorescens mikroskopi bilder. For bildeanalyse åpner du fluorescensmikroskopibildene i ImageJ, og velger Bilde og type for å bekrefte at alle bildene er i åtte-biters format. Velg Angi målinger på Analyser-menyen, og bekreft at Område, Integrert tetthet og Gjennomsnittsgrå verdi er valgt.Bruk et tegne- eller markeringsverktøy til å tegne en linje rundt interessesporen, og velg Mål på Analyser-menyen. En popup-boks med en stabel med verdier for den valgte sporen vises. Når minst 50 sporer er valgt, velger du flere regioner uten sporer, og gjentar målingen for å få en avlesning for bakgrunnsfluorescensen.Etter å ha oppnådd flere bakgrunnsmålinger, kopier alle dataene i Resultat-vinduet til et regneark, og beregner gjennomsnittet for den integrerte tettheten i området av de valgte sporene og bakgrunnsfluorescensverdiene for å oppnå korrigert total per celle fluorescens. For indirekte adsorpsjonseffektivitetsevaluering kan du utføre seks togangers seriell fortynning av renset mRFP ved en konsentrasjon på 0,5 nanogram per mikroliter til et endelig volum på 250 mikroliter per fortynning i bindingsbuffer og et passende eksperimentelt antall to ganger seriell fortynninger på 100 mikroliter av hver reserverte supernatant prøve som inneholder den ubundne mRFP-fraksjonen av adsorpsjonsreaksjonen med 100 mikroliter bindingsbuffer per fortynning. Deretter kutter du en nitrocellulosemembran med en 0,45-mikrometer cutoff til en ni-by-10-centimeter størrelse, for å dekke et fem-prøve-av-seks-prikker-av-fortynningsområde uten å strekke seg utover kanten av pakningen av dot blot apparatet.Plasser forgiftemembranen i dot blot apparatet. Kontroller riktig størrelse på membranen, og fjern eventuelle luftbobler fanget mellom membranen og pakningen. Monter dot blot apparatet som beskrevet av produsenten, og dekk den ubrukte delen av apparatet for å hindre luft fra å bevege seg gjennom disse brønnene.Når apparatet er klart, laster du standarden i de to mest eksterne kjørefeltene og prøvene i de midterste banene med 100 mikroliter av hver passende fortynning per brønn. Når alle prøvene er lastet, slå på vakuumpumpen i to minutter, før du stopper vakuumet og lar prøvene filtrere gjennom membranen ved tyngdekraften. Etter 10 minutter vask hver brønn med 100 mikroliter PBS.Kjør vakuumpumpen i ytterligere fem minutter. Når vaskebufferen er helt drenert fra apparatet, mens vakuumet er på, løsner du skruene og åpner forsiktig punktblotapparatet. Deretter behandler membranen i henhold til standard vestlige blot protokoller.For densitometrisk analyse av filteret åpner du ImageJ og skisserer hver prikk for å måle den integrerte tettheten ved hjelp av kommandoen Analyser, Mål som vist. For å gjøre en bakgrunnskorreksjon av bildet, tegn en sirkel i et tomt område, og mål den integrerte tettheten som demonstrert. Korreler den integrerte tettheten av standardprikkene med mengden lastet protein for å oppnå en kalibreringslinje, og bruk kalibreringskurven til å ekstrapolere konsentrasjonen av mRFP for hver prøveprikk.Konsentrasjonen av mRFP gjenværende i de ubundne brøkene kan deretter beregnes. Tilstedeværelsen av proteiner av forventet størrelse bare i banene lastet med et ekstrakt av adsorberte sporer er et tegn på en vellykket adsorpsjonsreaksjon. Direkte evaluering av adsorpsjonseffektiviteten avhenger av det heterologøse proteinet som har blitt brukt og kan utføres ved fluorescensmikroskopi og cytofluorimetry av pelletfraksjonen etter fraksjonen av adsorpsjonsreaksjonen.Kvantifisering av fluorescerende signaler som finnes på sporer kan deretter utføres ved hjelp av ImageJ som demonstrert. En indirekte analyse av adsorpsjonseffektiviteten kan utføres ved en prikkblottinganalyse av den overnaturlige fraksjonen som inneholder det ubundne proteinet, og påfølgende densitometriske analyse av det ubundne proteinet gjør det mulig å indirekte beregningen av mengden protein som adsorberes på sporene. Selv om, i prinsippet, noe protein kan adsorberes for bruk som slimhinnevaksiner eller biocatalysts, i praksis effektiviteten av adsorpsjon avhenger av protein nettsteder og kjemiske egenskaper.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

En ny Screening Method for Regissert Evolution of termostabilt bacteriolytic Enzymer

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Massespektrometrisk Analyse av glykosphingolipid Antigener

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funksjonell røde blodceller av membranen Pode av kompakt hyperforgrenede Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Oppdager Cortex Fragmenter Under Bakteriell Spore Spiring

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Rensing av membran kupé for endoplasmatiske retikulum-assosiert nedbrytning av eksogene antigener i Cross-presentasjon

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Uttrykk for eksogene antigener i Mycobacterium bovis BCG vaksinen via ikke-genetiske overflaten dekorasjon med Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infeksjoner som Screening verktøy for identifikasjon av Viral Immunomodulators og vert Antiviral faktorer

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...