Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" de L. Baccigalupi, título do projeto "SP-LAY: esporos de bactérias como plataforma ao vivo para exibição de proteínas".

1. reação de adsorção
<ol><li>Incubar a 2, 5 e 10 µ g de mRFP com 2 x 109 de b. subtilis spores purificados do selvagem-tipo em 200 µ l de binding buffer, citrato de sódio 50 mM, pH 4.0 (16,7 mM citrato de sódio di-hidratado, ácido cítrico de 33,3 mM) por 1h a 25 ° C, num balanço agitador (Figura 1) .</li>
	<li>Centrifugar as misturas de vinculação (13.000 x g durante 10 minutos) para fractionate Pelotas (P2, P5 e P10) e sobrenadantes (S2, S5 e S1...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Este protocolo de adsorção de esporos é muito simples e direto. A reação é estritamente dependente do pH do buffer de reação e a eficiência da adsorção é ideal em valores de pH ácido (pH 5.0 ou inferior). Em condições de pH neutro, a eficiência da adsorção é baixa, e em valores de pH alcalino, a adsorção pode não ocorrer. Adsorção ideal é obtida usando um volume de 200 µ l em tubos de 1,5 mL (ou mantendo uma relação semelhante) num agitador de balanço.
Adsorção ?...

Sistemas de visualização visam apresentar moléculas biologicamente ativas na superfície de microorganismos e encontrando aplicações em uma variedade de campos, de industrial de biotecnologia médica e ambiental. Além do fago1,2 e células de vários Gram - positivo e espécie3,4,5,6,7, esporos bacterianos foram também proposto como sistemas de exposição por duas abordagens8,9.
Devido à sua estrutura peculiar, ou seja uma citoplasma desidratada rodeada por uma série de camadas protetoras10, o esporo oferece várias vantagens em fago - e baseada em célula exibir sistemas8,9. Uma primeira vantagem vem da extrema robustez e estabilidade de esporos em condições que seriam deletérios para todas as outras células10,11. Enzimas e antígenos de esporo é exibido são estáveis, após prolongado armazenamento em temperatura ambiente12 e protegida da degradação em pH baixo e altas temperaturas13. Uma segunda vantagem dos esporos é a segurança de muitas espécies formadoras de esporos. B. subtilis, b. clausii, b. coagulanse várias outras espécies são utilizados mundialmente como probióticos e tem sido no mercado para uso humano ou animal por décadas14,15. Este registro de segurança excepcional é um requisito geral óbvio para um sistema de exibição de superfície e é de particular relevância quando o sistema se destina para uso humano ou animal16. Um terceiro, vantagem importante de um sistema de vídeo baseados em esporo é que não tem limitações para o tamanho da molécula que tem que ser exposto. Em sistemas baseados no fago, uma grande proteína heteróloga pode afetar a estrutura do capsídeo, enquanto em sistemas baseados em células, podem afetar a estrutura da membrana ou podem limite/afectar a membrana translocação passo17. As camadas protetoras em torno do germe são compostas de mais de 70 diferentes proteínas10 e são flexíveis o suficiente para aceitar grandes proteínas estrangeiras sem qualquer defeito estrutural evidente ou comprometimento funcional8. Além disso, com ambos os sistemas de vídeo baseados em esporos, a translocação da membrana da proteína heteróloga não é necessário8,9. Na verdade, proteínas heterólogos são produzidas no citoplasma da célula-mãe e montadas o Spore que está se formando no mesmo citoplasma ou adsorvido no esporo maduro8,9.
Exposição de esporos obteve-se, inicialmente, através do desenvolvimento de um sistema genético para a superfície do esporo18de engenheiro. Este sistema genético baseou-se na eu) a construção de uma fusão do gene entre o gene que codifica para uma proteína de casaco de esporos (usada como um porta-aviões) e o gene que codifica para a proteína a ser exibido - a presença dos sinais do endógeno transcriptional e translacionais Gene controlará a expressão da fusão e ii) integração do gene quimérico no cromossomo b. subtilis conceder estabilidade genética. Uma variedade de enzimas e antígenos tem sido exibido por esta abordagem recombinante, usando várias proteínas de superfície de esporos como portadores e visando diversas aplicações potenciais, que variam de vacina da mucosa a biocatalisador, biosensor, biorremediação, ou bioanalíticos ferramenta8,13.
Mais recentemente, uma abordagem diferente da exposição de esporos tem sido desenvolvidos19. Este segundo sistema é nonrecombinant e baseia-se na adsorção de moléculas sobre a superfície do esporo9espontânea e extremamente apertada. Antígenos19,20 e enzimas13,21 tenham sido exibidos de forma eficiente e revelaram que este método é significativamente mais eficiente do que a recombinação. Essa abordagem nonrecombinant permite a exibição das proteínas em forma nativa20 e também pode ser usada com autoclavados, esporos de morte19. O mecanismo molecular de adsorção tem não foi totalmente esclarecido ainda. A carga negativa e a hidrofobicidade dos esporos foram propostas como propriedades relevantes para a adsorção de13,19,22. Recentemente, demonstrou-se que uma proteína de modelo, a proteína de autofluorescent vermelho (mRFP) do coral Discosoma, quando adsorvido para o spore, foi capaz de se infiltrar através das camadas superficiais, localizando-se no revestimento interno23. Se provou verdadeiro para outras proteínas, a localização interna das proteínas heterólogos pode explicar sua estabilidade aumentada quando adsorvido a esporos23.
Em um estudo recente, duas enzimas catalisando duas etapas sucessivas da via de degradação de xilana independentemente foram exibidas em esporos de b. subtilis em, quando incubados juntos, foram capazes de realizar as duas etapas de degradação21. Esporos recolhidos após a reação foram ainda ativo e capaz de continuar a degradação de xilana mediante a adição de substrato fresco21. Mesmo que a segunda reação21, observou-se uma perda de cerca de 15% do produto final, a reusabilidade das enzimas adsorvidas para reações simples, bem como várias etapas, é uma vantagem adicional importante do sistema de exposição de esporos.
Pan et al24 relatou uma abordagem adicional para exibir heterólogos proteínas sobre a superfície do esporo: proteínas heterólogos (uma proteína de palha e uma beta-galactosidase um) produzidas na célula mãe durante esporulação eram espontaneamente envolto no casaco formando esporos, sem a necessidade de uma operadora. Este sistema de exibição adicionais esporo é uma combinação das duas abordagens descritas até agora. De fato, é recombinante desde as proteínas heterólogos foram projetadas para ser expressa em células-mãe durante esporulação, enquanto seu assembly dentro do casaco foi espontânea e, portanto, nonrecombinant24. No entanto, a eficiência da exposição desta abordagem adicional permanece para ser testadas e comparadas com as outras duas abordagens usando as mesmas proteínas heterólogos.
O presente protocolo exclui os processos de produção de esporos e purificação, que tem sido extensivamente em outros lugares descritos24. Inclui a reação de adsorção, a avaliação da eficiência de adsorção por microscopia-mancha do ponto e fluorescência, e a reciclagem de enzimas adsorvidas por reação adicional rodadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

O esporo bacteriano é uma célula metabolicamente quiescente, formada por uma série de camadas protetoras cercando uma citoplasma desidratada. Essa estrutura peculiar faz com que o esporo extremamente estável e resistente e tem sugeriu o uso do esporo como uma plataforma para exibir moléculas heterólogos. Até agora, uma variedade de enzimas e antígenos tenham sido exibidos em esporos de Bacillus subtilis e de algumas outras espécies, inicialmente por uma abordagem recombinante e, em seguida, por um simples e eficiente método de nonrecombinant. O sistema de exibição nonrecombinant baseia-se a adsorção direta de heterólogos moléculas sobre a superfície do esporo, evitando a construção de cepas recombinantes e a liberação de bactérias geneticamente modificadas no ambiente. Adsorvida moléculas são estabilizadas e protegidas pela interação com esporos, que limita a degradação rápida dos antígenos e a perda da atividade da enzima em condições desfavoráveis. Uma vez utilizado, esporo-adsorvido enzimas podem ser facilmente coletadas com uma redução mínima de atividade e reutilizadas para rodadas adicionais de reação. Neste trabalho é mostrado como adsorver moléculas modelo para purificado esporos de b. subtilis, como avaliar a eficiência de adsorção e como coletar esporos usados para reciclá-los para novas reações.

Adsorção de sucesso pode ser avaliada pela mancha ocidental. Após a reação, a mistura é fracionada por centrifugação e lavada, e a fração de pelota (Figura 1) é usada para extrair as proteínas de superfície. O extrato é fracionado por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (página), electrotransferred a uma membrana de polivinilideno (PVDF) de flúor e reagiu contra anticorpos primários e secundários. A presença de proteínas do tamanho e...

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Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Este protocolo incide sobre o uso de esporos bacterianos como uma ferramenta de "ao vivo" nanobiotechnological para adsorver moléculas heterólogos com várias atividades biológicas. Também são mostrados os métodos para medir a eficiência da adsorção.

Adsorção de esporos, como um sistema de exibição Nonrecombinant por enzimas e antígenos

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Esporos bacterianos vivos que exibem antígeno ou enzimas são nanopartículas funcionalmente ativas que podem ser usadas como vacinas mucosas ou biocatalissas. Em princípio, qualquer proteína pode ser eficientemente adsorvida aos esporos. Esta técnica é simples e não requer manipulação genética.Portanto, não há liberação de organismos recombinantes no ambiente. Além da vacinação mucosa para humanos e animais, esporos que exibem enzimas podem ser desenvolvidos como biocatalyzers reutilizáveis. Comece rotulando duas vezes 10 a nona B.subtilis esporos purificados do tipo selvagem com concentrações de dois ou cinco ou 10 microgramas do modelo RFP em 200 microliters de tampão de ligação complementado com 50 milimolares de sódio citrato por uma hora a 25 graus Celsius em um shaker de balanço.No final da incubação, pelota as misturas de ligação por centrifugação, e transfira os supernantes em novos tubos cônicos para análise subsequente de eficiência de adsorção. Em seguida, lave as pelotas de esporo duas vezes com 200 microliters de tampão de ligação por lavagem, reutilizando as pelotas em 100 microliters de tampão de ligação fresco após a segunda lavagem. Para extração de proteína superficial, adicione 50 microliters de cada resuspensão de esporos adsorvida a 50 microlitres de sulfato de sódio 2X de sódio dodecyl-dithiothiothreitol para solubilizar as proteínas de esporos superficiais.Após 45 minutos a 65 graus Celsius, colete as misturas por centrifugação, e execute 10 microliters de cada volume de proteínas extraídas sobrenascer em uma mancha ocidental, usando um anticorpo monoclonal anti-Seu reconhecendo a sua marca presente no N-terminus de mRFP para identificar as proteínas superficiais rotuladas. Para localizar e quantificar as moléculas adsorvidas por microscopia de fluorescência, adicione cinco microlitros da ressuspensão de esporos adsorvida a 95 microlitros de PBS, e adicione cinco microlitros de cada suspensão resultante em slides de microscópio individuais. Coloque uma mancha de cobertura tratada com poli-L-lisina em cada slide e coloque um slide em um estágio de microscópio de fluorescência.Em seguida, para cada campo, salve as imagens de microscopia de contraste de fase e fluorescência. Para análise de imagem, abra as imagens de microscopia de fluorescência no ImageJ e selecione Imagem e Tipo para confirmar se todas as imagens estão em formato de oito bits. No menu Analisar, selecione Definir medidas e confirme se a área, a densidade integrada e o valor cinza médio são selecionados.Use uma ferramenta de desenho ou seleção para desenhar uma linha em torno do esporo de interesse e selecione Medir no menu Analisar. Uma caixa pop-up com uma pilha de valores para o esporo selecionado aparecerá. Após a leção de pelo menos 50 esporos, selecione várias regiões sem esporos e repita a medição para obter uma leitura para a fluorescência de fundo.Após obter várias medições de fundo, copie todos os dados na janela Resultados em uma planilha e calcule a média da densidade integrada na área dos esporos selecionados e os valores de fluorescência de fundo para obter a fluorescência total por célula corrigida. Para avaliação indireta da eficiência da adsorção, execute seis diluições seriais duas vezes de mRFP purificada a uma concentração de 0,5 nanograma por microliter a um volume final de 250 microliters por diluição no buffer de ligação e um número experimental apropriado de diluições seriais duas vezes de 100 microlitres de cada amostra supernante reservada contendo a fração mRFP desvinculada da reação de adsorção com 100 microliters de buffer de ligação por diluição. Em seguida, corte uma membrana de nitrocelulose com um corte de 0,45 micrômetros para um tamanho de nove por 10 centímetros, para cobrir uma área de cinco amostras por seis pontos de diluição sem estender-se além da borda da junta do aparelho de manchas de ponto.Coloque a membrana prewet no aparelho de mancha de ponto. Verifique o tamanho correto da membrana e remova quaisquer bolhas de ar presas entre a membrana e a junta. Monte o aparelho de mancha de ponto, conforme descrito pelo fabricante, e cubra a parte não utilizada do aparelho para evitar que o ar se mova através desses poços.Quando o aparelho estiver pronto, carregue o padrão nas duas faixas mais externas e as amostras nas faixas do meio com 100 microliters de cada diluição apropriada por poço. Quando todas as amostras tiverem sido carregadas, ligue a bomba de vácuo por dois minutos, antes de parar o vácuo e permitir que as amostras se filtrem através da membrana por gravidade. Após 10 minutos, lave cada poço com 100 microliters de PBS.Execute a bomba de vácuo por mais cinco minutos. Quando o tampão de lavagem tiver sido completamente drenado do aparelho, enquanto o vácuo estiver ligado, solte os parafusos e abra cuidadosamente o aparelho de mancha de ponto. Então, processe a membrana de acordo com os protocolos padrão de manchas ocidentais.Para análise densitométrica do filtro, abra ImageJ e delineie cada ponto para medir a densidade integrada usando o comando Analisar, medir conforme demonstrado. Para fazer uma correção de fundo da imagem, desenhe um círculo em uma área vazia e meça sua densidade integrada como demonstrado. Correlacionar a densidade integrada dos pontos padrão com a quantidade de proteína carregada para obter uma linha de calibração, e usar a curva de calibração para extrapolar a concentração de mRFP de cada ponto amostral.A concentração do mRFP remanescente nas frações não ligadas pode então ser calculada. A presença de proteínas do tamanho esperado apenas nas pistas carregadas com um extrato dos esporos adsorvidos é indicativo de uma reação de adsorção bem sucedida. A avaliação direta da eficiência da adsorção depende da proteína heteróloga que tem sido utilizada e pode ser realizada por microscopia de fluorescência e citofluormetria da fração de pelotas após o fracionamento da reação de adsorção.A quantificação dos sinais fluorescentes presentes nos esporos pode então ser realizada usando ImageJ como demonstrado. Uma análise indireta da eficiência de adsorção pode ser realizada por uma análise de manchas de pontos da fração sobrenante contendo a proteína não ligada, e a análise densitométrica subsequente da proteína não ligada permite o cálculo indireto da quantidade de proteína adsorvida nos esporos. Embora, em princípio, qualquer proteína possa ser adsorvida para uso como vacinas mucosas ou biocatalísticos, na prática a eficiência da adsorção depende dos locais proteicos e propriedades químicas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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