Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Эта работа была поддержана «Finanziamento di Ricerca ди Ateneo» к L. Baccigalupi, название проекта «SP-LAY: бактериальные споры как живой платформы для отображения белков».

1. адсорбция реакция
<ol><li>Проинкубируйте 2, 5 и 10 мкг mRFP с 2 х 109 B. subtilis одичал тип очищенный спор в 200 мкл привязки буфера, цитрат натрия 50 мм, pH 4.0 (16,7 мм натрия цитрат дигидрат; лимонная кислота 33,3 мм) за 1 ч при 25 ° C на качалки шейкер (рис. 1) .</li>
	<li>Центрифуга привязки ...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Этот спор адсорбции протокол является очень простым и понятным. Реакция является строго зависит от pH буфера реакции и эффективность адсорбции является оптимальным в кислой рН (рН 5,0 или ниже). На нейтральном pH эффективность адсорбции низка, и в щелочной рН, адсорбция может не произойти. ?...

Системы отображения направлены на представление биологически активных молекул на поверхности микроорганизмов и поиск приложений в различных областях, от промышленных до медицинских и экологических биотехнологий. В дополнение к бактериофаги1,2 и клетки различных грамотрицательных и - положительных видов3,4,5,6,7, также были бактериальных спор предложенный как систем отображения двух подходов8,9.
Из-за его своеобразная структура, а именно обезвоженной цитоплазмы, в окружении ряда защитных слоев10, споро обеспечивает несколько преимуществ перед8,на основе ФАГ - и клетки систем отображения9. Первое преимущество приходит от экстремальных надежности и стабильности спор на условиях, которые бы пагубным для всех других клеток10,11. Spore отображается антигены и ферментов являются стабильными, после длительного хранения при комнатной температуре12 и защищены от деградации при низких значениях рН и температура13. Второе преимущество спор является безопасность многих видов спорообразующих. B. subtilis, б. clausii, б. coagulansи несколько других видов используются во всем мире как пробиотики и были на рынке для человека или животных использования для десятилетий14,15. Эта запись исключительных безопасности является очевидное общее требование для поверхности дисплея системы и имеет особое значение, когда система предназначена для использования человеческого или животного16. Третий важным преимуществом системы на основе spore отображения является, что она не имеет ограничений на размер молекулы, которая подвергается. В системах на базе фага, большой гетерологичных белка может повлиять на структуру капсида, в то время как в системах на базе ячейки, это может повлиять на структуру мембраны или может лимит/повредить мембраны транслокации шаг17. Защитные слои, окружающих споро состоят из более чем 70 различных белков10 и являются достаточно гибкими для того, чтобы принять большие инородные белки без каких-либо очевидной структурных дефектов или функциональными нарушениями8. Кроме того с обеих систем отображения на основе spore, мембраны транслокации белка гетерологичных не требуется8,9. Действительно гетерологичных белки либо производятся в цитоплазме клеток матери и собрал на спор, который формируется в том же цитоплазме или адсорбируется на зрелых споро8,9.
Споро отображения изначально был получен путем генетической системы инженера споро поверхности18. Эта генетическая система была основана на я) строительство гена слияние между кодирование гена для ползучих пальто белок (используется в качестве носителя) и кодирование гена белка будет отображаться - наличие сигналов транскрипционный анализ и трансляционная эндогенных Джин будет контролировать выражение fusion и ii) интеграция химерных гена в хромосоме B. subtilis предоставлять генетической стабильности. Этот рекомбинантных подход, с помощью различных белков споро поверхности как перевозчиков и направленный на различных потенциальных приложений, начиная от слизистой вакцины глюкозоизомеразы, биосенсор, биовосстановления, были отображены различные антигены и ферментов или Биоаналитические инструмент8,13.
Совсем недавно другой подход споро дисплей был развитых19. Эта вторая система nonrecombinant и опирается на спонтанное и крайне жесткой адсорбции молекул на поверхности споро9. Антигены19,20 и ферменты13,21 эффективной отображаться и показали, что этот метод является значительно более эффективным, чем рекомбинантных. Такой nonrecombinant подход позволяет отображать белков в родной форме20 и может также использоваться с газобетона, смерть споры19. Молекулярный механизм адсорбции полностью еще не выяснены. Отрицательный заряд и гидрофобность спора были предложены как соответствующие свойства для адсорбции13,19,22. Недавно было показано, что модель белка, белка красный autofluorescent (mRFP) коралловых Discosoma, когда адсорбированные споро, смог проникнуть через поверхностные слои локализации в внутренний слой23. Если доказана верно для других белков, внутренней локализации гетерологичных белков может объяснить их повышение стабильности при адсорбированные споры23.
В недавнем исследовании двух ферментов, катализирующих два последовательных шагов по пути деградации xylan независимо были выставлены на спор B. subtilis и, когда инкубировали вместе, были в состоянии выполнять шаги как деградация21. Споры, собранные после реакции были все еще активен и способен продолжать xylan деградации при добавлении свежий субстрат21. Даже если потеря около 15% конечного продукта наблюдался в второй реакции21, многократного использования адсорбированных ферментов для одного, а нескольких шаг, реакций является дополнительное важное преимущество системы отображения споро.
24 Пан et al. сообщили дополнительные подход для отображения гетерологичных белков на поверхности споро: гетерологичных белков (эндоглюканаза белок и бета галактозидазы, один) производится в ячейке мать во время заспорение были спонтанно заключенная в формирование пальто споро, без необходимости перевозчика. Эта система отображения дополнительных spore является сочетание двух подходов, изложенных до настоящего времени. Действительно, это рекомбинантных, поскольку гетерологичных белки были инженерии выражаться в ячейке мать во время заспорение, в то время как их сборку в пальто было спонтанным и, следовательно, nonrecombinant24. Однако эффективность отображения этого дополнительного подхода остается быть проверены и по сравнению с другими двумя подходами, используя же гетерологичных белков.
Настоящий Протокол исключает споро производственные процессы и очистки, которые были описаны подробно в другом месте24. Она включает в себя адсорбции реакции, оценки эффективности адсорбции точка промокательной и Люминесцентная микроскопия, и рециркуляции адсорбированных ферментов для дополнительных реакции раундов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

Бактериальная спора является ячейкой метаболически покоя, сформирован целый ряд защитных слоев, окружающих обезвоженной цитоплазмы. Это своеобразная структура делает споро чрезвычайно стабильные и устойчивые и предложил использование спор в качестве платформы для отображения гетерологичных молекул. До настоящего времени различные антигены и ферментов выставлялись на спор Bacillus subtilis и несколько других видов, первоначально рекомбинантных подход и, затем, простой и эффективный метод nonrecombinant. Nonrecombinant отображения система основана на прямой адсорбции гетерологичных молекул на поверхности споро, избегая строительство рекомбинантных штаммов и выпуска генетически модифицированных бактерий в окружающей среде. Адсорбированных молекул стабилизировалась и охраняются взаимодействия с спор, который ограничивает быстрой деградации антигены и потеря активности ферментов в неблагоприятных условиях. После использования, споро адсорбированные ферменты можно легко собраны с минимальным снижением активности и повторно использовать для дополнительных реакции раундов. В этом документе показано, как адсорбировать молекулы модель для очищенного спор B. subtilis, как оценивать эффективность адсорбции и как собрать используемые споры утилизировать их для новых реакций.

Успешное адсорбции может оцениваться Западный blotting. После реакции смесь фракционированный центрифугированием и промывают, и фракция гранул (рис. 1) используется для извлечения белков поверхности. Экстракт фракционированный электрофореза геля полиак?...

Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Этот протокол ориентирована на использование бактериальных спор как «живой» nanobiotechnological инструмент адсорбировать гетерологичных молекулы с различными биологической деятельности. Также приведены методы для измерения эффективности адсорбции.

Споро адсорбция как Nonrecombinant отображения системы для ферментов и антигены

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Живые бактериальные споры, отображающие антиген или ферменты, являются функционально активными наночастицами, которые могут быть использованы в качестве слизистых вакцин или биокаталинов. В принципе, любой белок может быть эффективно адсорбирован до спор. Этот метод прост и не требует каких-либо генетических манипуляций.Таким образом, никакого высвобождения рекомбинантных организмов в окружающую среду не участвует. В дополнение к мукозальной вакцинологии для людей и животных, споры, отображающие ферменты могут быть разработаны в качестве многоразовых биокатализеров. Начните с маркировки два раза от 10 до девятого B.subtilis дикого типа очищенных спор с двумя-пять-или 10-микрограмм концентрации модели RFP в 200 микролитров связывающего буфера дополнен 50-миллимолярный цитрат натрия в течение одного часа при 25 градусов по Цельсию на качалке.В конце инкубации гранулы связывающих смесей путем центрифугации, и передачи supernatants в новые конические трубки для последующего анализа эффективности adorption. Затем, мыть споры гранулы два раза с 200 микролитров связывания буфера на стирку, повторно гранулы в 100 микролитров свежего буфера связывания после второй стирки. Для экстракции поверхностного белка добавьте 50 микролитров каждого адсорбированного реуспензии спор до 50 микролитров 2X додекилового сульфата-дитиотреятола для растворения поверхностных спор белков.После 45 минут при 65 градусах по Цельсию, собирать смеси центрифугации, и запустить 10 микролитров каждого объема извлеченных белков supernatant на западной пятно, используя моноклональные анти-Его антитела признавая Его тег присутствует на N-термин mRFP для выявления помечены поверхностных белков. Для локализации и количественной оценки адсорбированных молекул с помощью флуоресцентной микроскопии добавьте пять микролитров резуспензии адсорбированных спор до 95 микролитров PBS и добавьте пять микролитров каждого полученного суспензии на отдельные микроскопьные слайды. Поместите поли-L-лизин-обработанные крышки на каждом слайде, и поместите один слайд на стадии флуоресценции микроскопа.Затем для каждого поля сохраните фазо-контрастные и флуоресцентные изображения микроскопии. Для анализа изображений откройте флуоресценцию микроскопии изображений в ImageJ, а также выберите изображение и тип, чтобы подтвердить, что все изображения находятся в восьми-битном формате. Из меню Анализа выберите измерения набора и подтвердите, что выбраны область, интегрированная плотность и среднее серое значение.Используйте инструмент рисования или выбора, чтобы нарисовать линию вокруг спор, представляющих интерес, и выбрать меру из меню анализа. Появится всплывающее окно со стопкой значений для выбранной споры. После того, как по крайней мере 50 спор были выбраны, выберите несколько регионов без каких-либо спор, и повторить измерение, чтобы получить показания для фоновой флуоресценции.После получения нескольких фоновых измерений скопируйте все данные в окне результатов в электронную таблицу и вычисляйте среднее среднее значения интегрированной плотности в области выбранных спор и фоновые значения флуоресценции для получения исправленной общей флуоресценции на клетку. Для косвенной оценки эффективности рекламы выполнить шесть двукратных серийных разбавления очищенных mRFP при концентрации 0,5 нанограмма на микролитр до конечного объема 250 микролитров на разбавление в связывающем буфере и соответствующее экспериментальное количество двукратных серийных разбавлений 100 микролитров каждого зарезервированного супернатантного образца, содержащего несвязанные mRFP фракции реакции adorption с 100 микролитров Затем вырежьте мембрану нитроцеллюлозы с вырезом 0,45 микрометра до размера размером 9 на 10 сантиметров, чтобы покрыть область разбавления размером пять образцов на шесть точек, не вытянувсь за пределы края прокладки точечного аппарата.Поместите мембрану prewet в аппарат пятно точки. Проверьте правильный размер мембраны, и удалить любые пузырьки воздуха, оказавшихся между мембраной и прокладкой. Соберите точечный аппарат, описанный производителем, и покройте неиспользованную часть аппарата, чтобы предотвратить перемещение воздуха через эти скважины.Когда аппарат будет готов, загрузите стандарт в двух самых внешних полосах движения и образцы в средних полосах со 100 микролитров каждого соответствующего разбавления на колодец. Когда все образцы были загружены, включите вакуумный насос в течение двух минут, прежде чем остановить вакуум и позволяет образцам фильтровать через мембрану под действием силы тяжести. Через 10 минут, мыть каждый хорошо с 100 микролитров PBS.Запустите вакуумный насос еще на пять минут. Когда стиральный буфер полностью осушенных из аппарата, в то время как вакуум на, ослабить винты и тщательно открыть точку пятно аппарата. Затем обработать мембрану в соответствии со стандартными западными протоколами пятно.Для денситометрического анализа фильтра откройте ImageJ и наметьте каждую точку для измерения интегрированной плотности с помощью команды Analyze, Measure, как попродемонстрировано. Чтобы сделать фоновую коррекцию изображения, нарисуйте круг в пустой области и измерьте его интегрированную плотность, как это было продемонстрировано. Соотносите интегрированную плотность стандартных точек с количеством загруженного белка для получения калибровочной линии и используйте кривую калибровки для экстраполяции концентрации mRFP каждой точки образца.Затем можно рассчитать концентрацию mRFP, остающейся в несырьях фракциях. Наличие белков ожидаемого размера только в полосах, загруженных экстрактом адсорбных спор, свидетельствует об успешной реакции адсорбции. Прямая оценка эффективности асорпции зависит от гетерологозного белка, который был использован и может быть выполнен с помощью микроскопии флуоресценции и цитофториметрии фракции гранул после фракционирования реакции adorption.Количественная оценка флуоресцентных сигналов, присутствующих на спорах, может быть выполнена с помощью ImageJ, как попродемонстрировано. Косвенный анализ эффективности адсорбции может быть выполнен путем точечного анализа супернатантной фракции, содержащей несъегодный белок, а последующий денситометрический анализ несъегодного белка позволяет косвенно вычислить количество белка, адсорбированного на споры. Хотя, в принципе, любой белок может быть адсорбирован для использования в качестве слизистых вакцин или биокаталистов, на практике эффективность адсорбции зависит от белковых участков и химических свойств.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Развитие Отрицательные Маркер для выбора Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Новый метод скрининга для направленной эволюции термостабильных ферментов Бактериолитические

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Масс-спектрометрического анализа гликосфинголипид Антигены

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Антигены охраняемых Функциональные эритроциты Мембрана прививки Компактный сверхразветвленных полиглицерины

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Обнаружение Cortex Фрагменты Во время бактериальный прорастание спор

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Очистка отсеке мембраны эндоплазматического ретикулума связаны деградации Экзогенные антигены в кросс презентация

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Выражение Экзогенные антигены в вакцины БЦЖ Mycobacterium bovis через Non генетические поверхности украшения с системой авидин биотин

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...