Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por "Libro di Ricerca di Ateneo" a L. Baccigalupi, título del proyecto "SP-LAY: esporas bacterianas como la plataforma live para la visualización de las proteínas".

1. reacción de adsorción de
<ol><li>Incubar 2, 5 y 10 μg de mRFP con 2 x 109 esporas purificadas de B. subtilis tipo salvaje en 200 μL de binding buffer, citrato de sodio 50 mM, pH 4.0 (16,7 mM citrato de sodio dihidrato, ácido cítrico de 33,3 mM) por 1 h a 25 ° C en un agitador oscilante (figura 1) .</li>
	<li>Centrifugar la mezcla obligatoria (13.000 x g por 10 min) para fraccionar pellets (P2, P5 y P10) y sobrenadantes (S2, S5 y S10). Guarde el sobren...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Este protocolo de adsorción de esporas es muy sencillo. La reacción es estrictamente dependiente del pH del buffer de reacción y la eficiencia de adsorción es óptima a valores de pH ácido (pH 5.0 o inferior). En condiciones de pH neutro, la eficiencia de adsorción es baja, y en los valores de pH alcalino, no puede ocurrir adsorción. Adsorción óptima se obtiene con un volumen de 200 μL en tubos de 1,5 mL (o manteniendo una relación similar) en un agitador oscilante.
Adsorción es mu...

Sistemas de visualización están dirigidos a presentar moléculas biológicamente activas en la superficie de los microorganismos y encontrando aplicaciones en diversos campos, de industrial a biotecnologías médicas y ambientales. Además de phages1,2 y las células de varios Gram-negativos - positivos y especies3,4,5,6,7, esporas bacterianas han sido propuesto como sistemas de visualización por dos enfoques8,9.
Debido a su peculiar estructura, es decir, un citoplasma deshidratado rodeado por una serie de capas protectoras10, la espora proporciona varias ventajas sobre phage y celular basado en pantalla sistemas8,9. Una primera ventaja viene de la extrema robustez y estabilidad de las esporas en las condiciones que serían perjudiciales para todos otros células10,11. Enzimas y antígenos aparecen esporas son estables después de prolongado almacenamiento a temperatura ambiente12 y protegido de la degradación a pH bajo y altas temperaturas13. Una segunda ventaja de las esporas es la seguridad de muchas especies formadoras de esporas. B. subtilis, B. clausii, B. coagulansy varias otras especies se utilizan como probióticos y han estado en el mercado para uso humano o animal por décadas14,15. Este expediente excepcional de seguridad es un requisito general obvio para un sistema de visualización superficial y es de particular relevancia cuando el sistema está diseñado para uso humano o animal16. Una tercera ventaja importante de un sistema de visualización basado en esporas es que no tiene limitaciones para el tamaño de la molécula que tiene que ser expuesto. En sistemas basados en el fago, una gran proteína heteróloga puede afectar la estructura de la cápside, mientras que en sistemas basados en celular, puede afectar la estructura de la membrana o límite/perjudiquen la membrana desplazamiento paso17. Las capas protectoras alrededor de la espora se componen de más de 70 diferentes proteínas10 y son lo suficientemente flexibles como para aceptar grandes proteínas extrañas sin ningún defecto estructural evidente o debilitación funcional8. Además, con ambos sistemas de visualización basado en esporas, el desplazamiento de la membrana de la proteína heteróloga no es necesario8,9. De hecho, proteínas heterólogas son producidas en el citoplasma de la célula madre y montadas en la espora que se forma en el mismo citoplasma o fijado por adsorción en la espora madura8,9.
Visualización de esporas se obtuvo inicialmente mediante el desarrollo de un sistema genético para diseñar la superficie de la espora18. Este sistema genético se basa en) la construcción de una fusión génica entre el gen que codifica para una proteína de la capa de espora (utilizada como un portador) y el gen que codifica para que la proteína que aparece - la presencia de las señales transcripcionales y traduccional de la endógena gen controla la expresión de la fusión y ii) integración del gen quimérico en el cromosoma B. subtilis a otorgar estabilidad genética. Una variedad de antígenos y las enzimas han exhibido por este enfoque recombinante, utilizando diferentes proteínas de superficie de la espora como portadores y con el objetivo de varias aplicaciones potenciales, desde vacuna mucosa biocatalítica, biosensor, biorremediación, o Bioanalytical herramienta8,13.
Más recientemente, un enfoque diferente de pantalla de spore ha sido desarrollado19. Este segundo sistema es nonrecombinant y se basa en la adsorción de moléculas sobre la superficie de la espora9espontánea y muy apretada. Los antígenos19,20 y enzimas13,21 han exhibido eficientemente y han revelado que este método es significativamente más eficiente que el recombinante. Este enfoque nonrecombinant permite la visualización de proteínas en la forma nativa20 y también puede utilizarse con autoclave, esporas de muerte19. El mecanismo de adsorción molecular ha no totalmente aclarado todavía. La carga negativa y la hidrofobicidad de la espora se han propuesto como propiedades relevantes para la adsorción13,19,22. Recientemente, se ha demostrado que una proteína modelo, la proteína roja autofluorescent (mRFP) de la coral Discosoma, cuando adsorbido a la espora, fue capaz de infiltrarse a través de las capas superficiales que se localiza en la capa interior23. Si cierto para otras proteínas, la localización interna de las proteínas heterólogas podría explicar su mayor estabilidad cuando se adsorbe a las esporas23.
En un estudio reciente, dos enzimas que catalizan dos pasos sucesivos de la vía de degradación de xilano independientemente fueron exhibidas en las esporas de B. subtilis y, cuando se incuban juntos, eran capaces de realizar ambos pasos degradación del21. Las esporas recogieron después de la reacción todavía activos y capaces de continuar la degradación de xilano con la adición de sustrato fresco21. Aunque se observó una pérdida de alrededor del 15% del producto final en la segunda reacción21, la reutilización de las enzimas adsorbidas por reacciones individuales, así como varios pasos, es una ventaja importante adicional del sistema de visualización de esporas.
Pan et al.24 informaron un enfoque adicional para visualizar proteínas heterólogas en la superficie de la espora: proteínas heterólogas (una proteína endoglucanase y una beta-galactosidasa uno) producidas en la célula madre durante la esporulación fueron espontáneamente dentro de la capa de espora formación, sin la necesidad de un operador. Este sistema de visualización de esporas adicional es una combinación de los dos enfoques descritos hasta ahora. De hecho, es recombinante ya que las proteínas heterólogas fueron diseñadas para ser expresados en la célula madre durante la esporulación, aunque su montaje dentro de la capa fue espontánea y, por tanto, nonrecombinant24. Sin embargo, la eficacia de la exhibición de este enfoque adicional queda probado y Comparado con los otros dos enfoques mediante el uso de las mismas proteínas heterólogas.
El presente Protocolo excluye los procesos de producción de esporas y purificación, que han sido descritos ampliamente en otra parte24. Incluye la reacción de adsorción, la evaluación de la eficiencia de adsorción por microscopia dot-blotting y fluorescencia, y el reciclaje de enzimas adsorbidas para reacción adicional rondas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

La espora bacteriana es una célula metabólicamente quiescente, formada por una serie de capas protectoras que rodean un citoplasma deshidratado. Esta peculiar estructura hace la espora extremadamente estable y resistente y ha sugerido el uso de la espora como una plataforma para mostrar las moléculas heterólogas. Hasta ahora, una variedad de antígenos y las enzimas han exhibido en las esporas de Bacillus subtilis y de algunas otras especies, inicialmente por un enfoque recombinante y, luego, por un método sencillo y eficaz nonrecombinant. El sistema de visualización nonrecombinant se basa en la adsorción directa de moléculas heterólogas en la superficie de la espora, evitando la construcción de cepas recombinantes y la liberación de bacterias genéticamente modificadas en el medio ambiente. Las moléculas adsorbidas son estabilizadas y protegidas por la interacción con las esporas, que limita la degradación rápida de antígenos y la pérdida de actividad de la enzima en condiciones desfavorables. Una vez utilizado, enzimas esporas adsorbidos pueden ser recogidas fácilmente con una mínima reducción de la actividad y reutilizadas para rondas de reacción adicional. En este artículo se muestra cómo adsorber moléculas modelo purificada esporas de B. subtilis, cómo evaluar la eficiencia de adsorción y cómo recoger esporas usadas para reciclarlas para nuevas reacciones.

Adsorción de éxito puede ser evaluada por western blot. En la reacción, la mezcla se fracciona mediante centrifugación y lavada, y la fracción de sedimento (figura 1) se utiliza para extraer las proteínas de la superficie. El extracto se fracciona por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (página), electrotransferred a una membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro y reaccionó contra anticuerpos primarios y secundarios. La presencia de prote?...

Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Este protocolo se centra en el uso de esporas bacterianas como una herramienta "viva" nanobiotechnologicos para adsorber moléculas heterólogas con diversas actividades biológicas. También se muestran los métodos para medir la eficiencia de adsorción.

Adsorción de esporas como un sistema de visualización Nonrecombinant para enzimas y antígenos

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Las esporas bacterianas vivas que muestran antígeno o enzimas son nanopartículas funcionalmente activas que se pueden utilizar como vacunas mucosas o biocatalísticas. En principio, cualquier proteína puede ser absorbida eficientemente a las esporas. Esta técnica es simple y no requiere ninguna manipulación genética.Por lo tanto, no hay ninguna liberación de organismos recombinantes en el medio ambiente está involucrado. Además de la vacuna mucosa para humanos y animales, las esporas que muestran enzimas se pueden desarrollar como biocatalizadores reutilizables. Comience por etiquetar dos veces 10 a la novena esporas purificadas de tipo B.subtilis con concentraciones de dos o 10 microgramos del modelo RFP en 200 microlitros de tampón de unión complementados con citrato de sodio de 50 mililitrolares durante una hora a 25 grados Celsius en una coctelera mecedora.Al final de la incubación, pele el pellet de las mezclas de unión por centrifugación, y transferir los sobrenadantes a nuevos tubos cónicos para el análisis posterior de la eficiencia de adsorción. A continuación, lave los pellets de esporas dos veces con 200 microlitros de tampón de unión por lavado, resuspmentando los pellets en 100 microlitros de tampón de unión fresca después del segundo lavado. Para la extracción de proteínas superficiales, agregue 50 microlitros de cada resuspensión de esporas adsorbidas a 50 microlitros de 2X dodecyl sulfato-ditiothreitol sódico para solubilizar las proteínas de esporas superficiales.Después de 45 minutos a 65 grados Celsius, recoger las mezclas por centrifugación, y ejecutar 10 microlitros de cada volumen de proteínas extraídas sobrenadante en una mancha occidental, utilizando un anticuerpo anti-Su monoclonal que reconoce la etiqueta Su presente en el N-terminus de mRFP para identificar las proteínas superficiales etiquetadas. Para localizar y cuantificar las moléculas adsorbidas mediante microscopía de fluorescencia, agregue cinco microlitros de la resuspensión de esporas adsorbidas a 95 microlitros de PBS, y agregue cinco microlitros de cada suspensión resultante en diapositivas de microscopio individuales. Coloque un cubreobjetos tratados con poli-L-lisina en cada diapositiva y coloque una diapositiva en una etapa del microscopio de fluorescencia.A continuación, para cada campo, guarde las imágenes de microscopía de contraste de fase y fluorescencia. Para el análisis de imágenes, abra las imágenes de microscopía de fluorescencia en ImageJ y seleccione Imagen y Tipo para confirmar que todas las imágenes están en formato de ocho bits. En el menú Analizar, seleccione Establecer medidas y confirme que el área, la densidad integrada y el valor gris medio están seleccionados.Utilice una herramienta de dibujo o selección para dibujar una línea alrededor de la espora de interés y seleccione Medir en el menú Analizar. Aparecerá un cuadro emergente con una pila de valores para la espora seleccionada. Después de seleccionar al menos 50 esporas, seleccione varias regiones sin esporas y repita la medición para obtener una lectura para la fluorescencia de fondo.Después de obtener varias mediciones de fondo, copie todos los datos de la ventana Resultados en una hoja de cálculo y calcule la media de la densidad integrada en el área de las esporas seleccionadas y los valores de fluorescencia de fondo para obtener la fluorescencia total por celda corregida. Para la evaluación indirecta de la eficiencia de la adsorción, realice seis diluciones seriales dobles de MRFP purificada a una concentración de 0,5 nanogramos por microlitro a un volumen final de 250 microlitros por dilución en búfer de unión y un número experimental adecuado de diluciones seriales dobles de 100 microlitros de cada muestra de sobrenadante reservada que contenga la fracción mRFP no enlazada de la reacción de adsorción con 100 microlitros de búfer de unión por dilución. A continuación, corte una membrana de nitrocelulosa con un límite de 0,45 micrómetros a un tamaño de nueve por 10 centímetros, para cubrir un área de cinco muestras por seis puntos de dilución sin extenderse más allá del borde de la junta del aparato de punto blot.Coloque la membrana precoja en el aparato de manchas de puntos. Compruebe el tamaño correcto de la membrana y elimine las burbujas de aire atrapadas entre la membrana y la junta. Montar el aparato de manchas de puntos como se describe por el fabricante, y cubrir la porción no utilizada del aparato para evitar que el aire se mueva a través de esos pozos.Cuando el aparato esté listo, cargue el estándar en los dos carriles más externos y las muestras en los carriles centrales con 100 microlitros de cada dilución apropiada por pozo. Cuando se hayan cargado todas las muestras, encienda la bomba de vacío durante dos minutos, antes de detener el vacío y permitir que las muestras se filtren a través de la membrana por gravedad. Después de 10 minutos, lave cada pozo con 100 microlitros de PBS.Ejecute la bomba de vacío durante otros cinco minutos. Cuando el tampón de lavado se haya drenado completamente del aparato, mientras el vacío está encendido, afloje los tornillos y abra cuidadosamente el aparato de manchas de puntos. A continuación, procese la membrana de acuerdo con los protocolos de manchas occidentales estándar.Para el análisis densitométrico del filtro, abra ImageJ y delinee cada punto para medir la densidad integrada utilizando el comando Analizar, Medir como se ha demostrado. Para realizar una corrección de fondo de la imagen, dibuje un círculo en un área vacía y mida su densidad integrada como se ha demostrado. Correlacione la densidad integrada de los puntos estándar con la cantidad de proteína cargada para obtener una línea de calibración, y utilice la curva de calibración para extrapolar la concentración de mRFP de cada punto de muestra.A continuación, se puede calcular la concentración del mRFP restante en las fracciones no enlazadas. La presencia de proteínas del tamaño esperado sólo en los carriles cargados con un extracto de las esporas adsorbidas es indicativa de una reacción de adsorción exitosa. La evaluación directa de la eficiencia de adsorción depende de la proteína heteróloga que se ha utilizado y se puede realizar mediante microscopía de fluorescencia y citofluorimetría de la fracción de pellet después de la fracción de la reacción de adsorción.La cuantificación de las señales fluorescentes presentes en las esporas se puede realizar utilizando ImageJ como se ha demostrado. Un análisis indirecto de la eficiencia de adsorción se puede realizar mediante un análisis de la hinchazón de puntos de la fracción sobrenadante que contiene la proteína no unida, y el posterior análisis densitométrico de la proteína no unida permite el cálculo indirecto de la cantidad de proteína adsorbida en las esporas. Aunque, en principio, cualquier proteína puede ser adsorbida para su uso como vacunas mucosas o biocatalistas, en la práctica la eficiencia de la adsorción depende de los sitios de proteínas y propiedades químicas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Desarrollo de un marcador negativo seleccionable para Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Un método de screening para la evolución dirigida de enzimas termoestables bacteriolítica

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Análisis espectrométrico de masas de Antígenos glicoesfingolípido

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antígenos funcional protegido glóbulos rojos por la membrana injerto de compactos Poligliceroles hiperramificados

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Purificación del compartimento de la membrana de retículo endoplasmático asociado degradación de antígenos exógenos en presentación cruzada

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expresión de antígenos exógenos en la vacuna de BCG de Mycobacterium bovis por genética no decoración de superficie con el sistema avidina-biotina

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...