Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Detta arbete stöds av ”Finanziamento di Ricerca di Ateneo” till L. Baccigalupi, Projekttitel ”SP-LAY: bakteriell sporer som levande plattform för proteiner display”.

1. adsorption reaktion
<ol><li>Inkubera 2, 5 och 10 µg av mRFP med 2 x 109 i B. subtilis vildtyp renat sporer i 200 µL bindande buffert, 50 mM natriumcitrat, pH 4.0 (16,7 mM natriumcitratdihydrat, 33,3 mM citronsyra) för 1 h vid 25 ° C på en gungande skakapparat (figur 1) .</li>
	<li>Centrifugera bindande blandningar (13 000 x g under 10 minuter) för att fractionate pellets (P2, P5 och P10) och supernatanterna (S2, S5 och S10). Lagra supernatanterna för ...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Detta spore adsorption protokoll är mycket enkel och okomplicerad. Reaktionen är strängt beroende av pH-värdet i reaktion bufferten och effektiviteten av adsorption är optimal vid surt pH värden (pH 5.0 eller lägre). Vid neutralt pH förhållanden, effektiviteten av adsorption är låg och vid alkaliskt pH-värden, adsorption kan inte uppstå. Optimal adsorption erhålls med en volym på 200 µL i 1,5 mL rör (eller att hålla ett liknande förhållande) på en gungande shaker.
Adsorpti...

Displaysystem syftar till att presentera biologiskt aktiva molekyler på ytan av mikroorganismer och hitta program i en mängd olika områden, från industri till medicinska och miljörelaterade bioteknik. Utöver fagocyt1,2 och celler av olika gramnegativa och -positiv arter3,4,5,6,7, har bakteriesporer också föreslås som displaysystem av två tillvägagångssätt8,9.
På grund av dess säregna struktur, nämligen en uttorkad cytoplasman omges av en rad skyddande lager10, ger spor flera fördelar jämfört med phage - och cellbaserade display system8,9. Först kommer från extrema robusthet och stabilitet av sporer på villkor som skulle vara skadliga till alla andra celler10,11. Spore-visas antigener och enzymer är stabil efter långvarig lagring vid rumstemperatur12 och skyddas från nedbrytning vid lågt pH och höga temperaturer13. En andra fördel med sporer är säkerheten för många sporbildande arter. B. subtilis, B. clausii, B. coagulansoch flera andra arter används över hela världen som probiotika och har varit på marknaden för människors eller djurs användning för årtionden14,15. Denna enastående säkerhetsrekord är ett uppenbart allmänna krav för ett surface-skärmen system och är särskilt relevant när systemet är avsett för människors eller djurs användning16. En tredje är viktig fördel med en spore-baserade displaysystem att den inte har begränsningar för storleken av den molekyl som har att exponeras. I phage-baserade system, en stor heterologa proteiner kan påverka strukturen av kapsid, medan i cell-baserat system, det kan påverka strukturen på membranet eller gräns/försämra den membran translokation steg17. De skyddande lager som omger spor består av mer än 70 olika proteiner10 och är tillräckligt flexibla för att acceptera stora främmande proteiner utan uppenbart konstruktionsfel eller funktionsnedsättning8. Med båda spore-baserade displaysystem är på membran flyttning av proteinet heterologa dessutom inte krävs8,9. Faktiskt är heterologa proteiner antingen produceras i mor cellens cytoplasma och monterat på spor som bildas i samma cytoplasman eller adsorberat på mogen spore8,9.
Spore display erhölls från början genom att utveckla ett genetiska system för ingenjör spore yta18. Denna genetiska systemet byggde på jag) byggandet av en gen fusion mellan den gen som kodar för ett spore coat protein (används som bärare) och den gen som kodar för proteinet ska visas - förekomsten av transkriptionell och translationell signalerar av den endogena gen kommer att kontrollera uttrycket av fusion, och ii) integrationen av den chimära gen på B. subtilis kromosomen att bevilja genetisk stabilitet. En mängd antigener och enzymer har visats av detta rekombinant tillvägagångssätt, med olika spore ytproteiner som bärare och som syftar till olika potentiella tillämpningar, alltifrån slemhinnor vaccin till biocatalyst, biosensor, bioremediering, eller bioanalytiska verktyg8,13.
Mer nyligen, en annan metod av spore display varit utvecklade19. Detta andra system är nonrecombinant och bygger på spontana och extremt tight adsorption av molekyler på spore yta9. Antigener19,20 och enzymer13,21 har visats effektivt och har visat att denna metod är betydligt effektivare än den rekombinanta. Detta nonrecombinant tillvägagångssätt möjliggör visning av proteiner i ursprunglig form20 och kan också användas med autoklaveras, död sporer19. Den molekylära mekanismen av adsorption har inte helt klarlagts ännu. Den negativ laddningen och den vattenavvisande egenskaper av spor har föreslagits som egenskaper som är relevanta för adsorption13,19,22. Det har nyligen visat att en modell protein, det röda autofluorescent proteinet (mRFP) av den coral Discosoma, när adsorberas till spor, kunde infiltrera genom ytskikten lokalisering i den inre coat23. Om visade sig vara sant för andra proteiner, kunde inre lokaliseringen av heterologa proteiner förklara deras ökad stabilitet när adsorberat till sporer23.
I en färsk studie, två enzym katalysera två successiva steg av xylan Nedbrytningsvägen var självständigt visas på sporer av B. subtilis och, när inkuberas tillsammans kunde utföra båda nedbrytning steg21. Sporer som samlats in efter reaktionen var fortfarande aktiva och kunna fortsätta xylan nedbrytning vid tillägg av färskt substrat21. Även om en förlust av ca 15% av den slutliga produkten observerades i andra reaktion21, är reusabilityen av adsorberat enzymer för enstaka, liksom flerstegs, reaktioner ytterligare en viktig fördel med spore displayen systemet.
Pan et al.24 rapporterade en ytterligare metod att Visa heterologa proteiner på ytan spore: heterologa proteiner (ett endoglucanase protein och en beta-galaktosidas en) produceras i modercellen under sporulering var spontant inkapslad i bilda spore pälsen, utan behov av en bärare. Detta ytterligare spore displaysystem är en kombination av de två metoderna som beskrivits hittills. Det är faktiskt rekombinant eftersom de heterologa proteinerna var konstruerad för att uttryckas i modercellen under sporulering, medan deras församling inom rocken var spontan och därmed nonrecombinant24. Effektivitet visning av denna ytterligare metod återstår emellertid vara testat och jämfört med de andra två metoderna genom att använda samma heterologa proteiner.
Protokolls utesluter produktionsprocesser spore och rening, som har varit beskrivs utförligt på annan plats24. Den innehåller adsorption reaktionen, utvärdering av effektiviteten av adsorption av dot-blotting och fluorescence mikroskopi, och återvinning av adsorberat enzymer för ytterligare reaktion rundor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

Den bakteriella spore är ett metaboliskt quiescent cell, bildas av en rad skyddande lager kring en uttorkad cytoplasman. Denna säregna struktur gör spor extremt stabil och motståndskraftig och har föreslagit användning av spor som en plattform för att Visa heterologa molekyler. En mängd antigener och enzymer har hittills visats på sporer av Bacillus subtilis och några andra arter, ursprungligen av ett rekombinant tillvägagångssätt och, sedan, genom en enkel och effektiv nonrecombinant metod. Nonrecombinant displayen systemet bygger på direkta adsorption av heterologa molekyler på spore ytan, undvika byggandet av rekombinant stammar och utsläpp av genetiskt modifierade bakterier i miljön. Adsorberade molekyler är stabiliserad och skyddas genom interaktion med sporer, som begränsar den snabba nedbrytningen av antigener och förlusten av enzymaktivitet vid unfavorable villkorar. När utnyttjas, kan spore-adsorberat enzymer samlas enkelt med en minimal driftsinskränkning och återanvändas för ytterligare reaktion rundor. I detta papper visas hur att adsorbera modell molekyler till renat sporer av B. subtilis, hur man kan utvärdera effektiviteten av adsorption och hur man samlar in begagnade sporer för att återanvända dem för nya reaktioner.

Framgångsrika adsorption kan bedömas av western blotting. Vid reaktionen, blandningen fractionated genom centrifugering och tvättas, och andelen pellets (figur 1) används för att extrahera ytproteiner. Extraktet är fractionated med SDS polyakrylamid gelelektrofores (sida), electrotransferred till en polyvinylidene fluor (PVDF) membran, och reagerat mot primära och sekundära antikroppar. Förekomsten av proteiner av den förväntade storleken, endast i...

Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Detta protokoll fokuserar på användning av bakteriesporer som ett ”levande” nanobiotechnological verktyg att adsorbera heterologa molekyler med olika biologiska aktiviteter. Metoderna för att mäta effektiviteten av adsorption visas också.

Spore Adsorption som en Nonrecombinant displaysystem för enzymer och antigener

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Levande bakteriesporer som uppvisar antigen eller enzymer är funktionellt aktiva nanopartiklar som kan användas som slemhäcksvaccin eller biokatalyser. I princip kan alla proteiner effektivt adsorberas till sporer. Denna teknik är enkel och kräver inte någon genetisk manipulation.Därför är ingen frisättning av rekombinanta organismer i miljön inblandade. Förutom slemhinnans vaccinologi för människor och djur kan sporer som uppvisar enzymer utvecklas som återanvändbara biokatalyser. Börja med att märka två gånger 10 till den nionde B.subtilis vild-typ renas sporer med två-fem-eller 10-mikrogram koncentrationer av modell RFP i 200 mikroliter av bindande buffert kompletteras med 50-millimolar natriumcitrat för en timme vid 25 grader Celsius på en gungande shaker.I slutet av inkubationen pelleterar du bindningsblandningarna genom centrifugering, och överför supernatanterna till nya koniska rör för efterföljande adsorptionseffektivitetsanalys. Sedan tvätta sporpellets två gånger med 200 mikroliter av bindande buffert per tvätt, resuspending pellets i 100 mikroliter av färsk bindning buffert efter den andra tvätten. För ytproteinutdragning, tillsätt 50 mikroliter av varje adsorberad sporrexpension till 50 mikroliter av 2X natriumdylsulfat-dithiothreitol för att solubilisera ytsporproteinerna.Efter 45 minuter vid 65 grader Celsius, samla blandningar genom centrifugeringen, och kör 10 mikroliter av varje volym av extraherade proteiner supernatant på en västerländsk blot, med hjälp av en monoklonal anti-Hans antikropp erkänner Hans tagg närvarande vid N-ändstationen av mRFP att identifiera den märkta ytan proteiner. För att lokalisera och kvantifiera de adsorberade molekylerna genom fluorescensmikroskopi, tillsätt fem mikroliter av den adsorberade sporrepensionen till 95 mikroliter PBS, och tillsätt fem mikroliter av varje resulterande suspension på individuella mikroskopbilder. Placera en poly-L-lysin-behandlade coverslip på varje bild, och placera en bild på en fluorescens mikroskop skede.Sedan, för varje fält, spara fas-kontrast och fluorescens mikroskopi bilder. För bildanalys öppnar du fluorescensmikroskopibilderna i ImageJ och väljer Bild och Typ för att bekräfta att alla bilderna är i åttabitars format. På menyn Analysera väljer du Ange mått och bekräftar att Område, Integrerad densitet och Medelvärdet av grått värde är markerade.Använd ett rit- eller markeringsverktyg för att rita en linje runt räntesporn och välj Mått på menyn Analysera. En popup-ruta med en stack med värden för den valda sporen kommer att visas. Efter att minst 50 sporer har valts väljer du flera regioner utan några sporer, och upprepar mätningen för att få en avläsning för bakgrundsfluorescensen.Efter att ha fått flera bakgrundsmätningar kopierar du alla data i fönstret Resultat till ett kalkylblad och beräknar medelvärdet av den integrerade densiteten i området för de valda sporerna och bakgrundsfluorescensvärdena för att få den korrigerade total-per-cellfluorescensen. För indirekt utvärdering av adsorptionseffektivitet, utföra sex tvåfaldiga serieutspädningar av renad mRFP vid en 0,5-nanogram-per-mikroliterkoncentration till en slutlig volym på 250 mikroliter per spädning i bindningsbuffert och ett lämpligt experimentellt antal tvåfaldiga serieutspädningar på 100 mikroliter av varje reserverat supernatant prov som innehåller den obundna mRFP-fraktionen av adsorptionsreaktionen med 100 mikroliters bindningsbuffert per utspädning. Därefter skär en nitrocellulosa membran med en 0,45-mikrometer cutoff till en nio-av-10-centimeters storlek, för att täcka en fem-prov-av-sex-punkter-av-utspädning område utan att sträcka sig bortom kanten av packningen av dot blot apparaten.Placera förwet-membranet i punktfläcksapparaten. Kontrollera membranets rätta storlek, och ta bort eventuella luftbubblor som fastnat mellan membranet och packningen. Montera punktfläcksapparaten enligt tillverkarens beskrivning, och täck över den oanvända delen av apparaten för att förhindra att luften rör sig genom dessa brunnar.När apparaten är klar, lasta standarden i de två mest externa körfält och proverna i de mellersta körfält med 100 mikroliter av varje lämplig utspädning per brunn. När alla proverna har laddats, sätt på vakuumpumpen i två minuter, innan du stoppar vakuumet och låter proverna filtrera genom membranet genom gravitationen. Efter 10 minuter, tvätta varje brunn med 100 mikroliter PBS.Kör vakuumpumpen i ytterligare fem minuter. När tvättbufferten helt har rundrat ur apparaten, medan vakuumet är på, lossar skruvarna och öppnar försiktigt punktfläcksapparaten. Sedan bearbeta membranet enligt standard western blot protokoll.För densitometric analys av filtret, öppna ImageJ och disposition varje punkt för att mäta den integrerade densiteten med hjälp av kommandot Analysera, Mäta som visat. Om du vill göra en bakgrundskorrigering av bilden ritar du en cirkel i ett tomt område, och mäter dess integrerade densitet som den visas. Korrelera den integrerade densiteten hos standardprickarna med mängden laddat protein för att erhålla en kalibreringslinje, och använd kalibreringskurvan för att extrapolera koncentrationen av mRFP av varje provpunkt.Den koncentration av mRFP som finns kvar i de obundna bråktalen kan sedan beräknas. Förekomsten av proteiner av den förväntade storleken endast i körfält lastade med ett extrakt av de adsorberade sporerna är ett tecken på en framgångsrik adsorptionsreaktion. Direkt utvärdering av adsorptionseffektiviteten beror på det heterologa protein som har använts och kan utföras genom fluorescensmikroskopi och cytofluorimetry av pelletsfraktionen efter fraktioneringen av adsorptionsreaktionen.Kvantifiering av de fluorescerande signaler som finns på sporer kan sedan utföras med hjälp av ImageJ som visats. En indirekt analys av adsorptionseffektiviteten kan utföras genom en dot blotting-analys av den supernatantfraktion som innehåller det obundna proteinet, och efterföljande densitometrisk analys av det obundna proteinet möjliggör den indirekta beräkningen av mängden protein som adsorberas på sporerna. Även om alla proteiner i princip kan adsorberas för användning som slemhinnavacciner eller biokatalysatorer, beror adsorptionseffektiviteten i praktiken på proteinställena och kemiska egenskaper.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Utveckling av en negativ markör för Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

En ny screeningmetod för riktad evolution av Termostabila bakteriolytiskt enzymer

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Masspektrometrisk analys av glykosfingolipid antigener

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener skyddade funktionella röda blodkroppar av membranet Ympning av kompakt Hyperförgrenade Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Upptäcka Cortex Fragment Under Bacterial sporgroning

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Rening av membran facket för endoplasmatiska nätverket-associerade nedbrytningen av exogena antigen i Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Uttryck av exogena antigen i Mycobacterium bovis BCG vaccinet via icke-genetiska yta dekoration med metoden-biotin systemet

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infektioner som Screening verktyg för identifiering av Viral immunmodulerande och värd antivirala faktorer

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...