Name: spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Bu eser "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" L. Baccigalupi, proje başlığı için tarafından desteklenen "SP-LAY: bakteriyel sporlar proteinler görüntü için canlı platform olarak".

1. adsorpsiyon tepki
<ol><li>2, 5 ve mRFP 10 µg 2 x 109 / B. subtilis vahşi tipi arıtılmış sporlar tampon, 50 mM sodyum sitrat, pH 4.0 (16,7 mM sodyum sitrat dihydrate; 33,3 mM sitrik asit) 1 h için 25 ° c üzerinde sallanan bir shaker (şekil 1) bağlama 200 µL ile kuluçkaya .</li>
	<li>Bağlama karışımları (13.000 x g 10 dk) santrifüj kapasitesi granül (P2, P5 ve P10) ve supernatants (S2, S5 ve S10) fractionate. 3.2. adımda anlatılan adsorps...

<ol>
	<li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage.">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li><li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage.">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li><li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides.">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li><li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase.">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li><li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella.">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li><li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin.">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li><li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery.">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li><li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+surface+display.">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li><li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).</li><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat.">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li><li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications.">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li><li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+molecules+on+the+spore+surface.">Display of molecules on the spore surface.</a> Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).</li><li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+&#946;-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Adsorption of &#946;-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).</li><li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+probiotics.">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li><li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-LAB+Probiotics:+Spore+Formers.">Non-LAB Probiotics: Spore Formers.</a> Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).</li><li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics.">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell-surface+display.">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li><li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores.">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li><li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).</li><li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes.">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).</li><li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers.">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li><li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis.">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).</li><li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores.">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li><li>Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis.">Genetic analysis.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium.">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38 (2018).</li></ol>

Bu spor adsorpsiyon çok basit ve kolay iletişim kuralıdır. Reaksiyon kesinlikle tepki tamponunun pH bağımlıdır ve adsorpsiyon verimini asidik pH değerlerinde (pH 5.0 veya daha düşük) en iyi yöntemdir. Nötr pH koşulları, adsorpsiyon verimliliği düşüktür ve alkali pH değerlerinde adsorpsiyon değil oluşabilir. En iyi adsorpsiyon 1,5 mL tüpler (veya benzer bir oranı tutmak) 200 µL hacmi üzerinde sallanan bir shaker kullanarak elde edilir.
Adsorpsiyon çok sıkı ve yık...

Görüntü sistemleri biyolojik olarak aktif molekülleri mikroorganizmaların yüzeyinde sunulması ve alanları, sanayi sağlık ve Çevre Biyoteknoloji için çeşitli uygulamalar bulma hedefleniyor. Phages1,2 ve çeşitli Ayagin Gram-negatif - pozitif türler ve3,4,5,6,7, hücrelerin yanı sıra bakteriyel sporlar de olmuştur görüntü sistemleri iki yaklaşım8,9tarafından önerilen.
Kendine özgü yapısını, yani koruyucu Katmanlar10, bir dizi tarafından çevrili bir susuz sitoplazma nedeniyle spor fajının ve hücre tabanlı görüntü sistemleri8,9çeşitli avantajlar sağlar. İlk bir avantaj aşırı sağlamlık ve tüm diğer hücreleri10,11için zararlı olacağını koşulları, sporlar kararlılığını gelir. Spore görüntülenen antijenleri ve enzimler sonra depolama oda sıcaklığında12 uzun süreli ve düşük pH ve yüksek sıcaklıklara13düşüş korunuyorsunuz stabildir. İkinci avantajı sporlar spor oluşturan birçok türün güvenliğidir. B. subtilis, d. clausii, d. coagulansve birkaç diğer türler probiyotikler olarak dünya çapında kullanılan ve onlarca yıl14,15insan ya da hayvan kullanılmak için piyasada olmuştur. Bu olağanüstü güvenlik sicili bir yüzey görüntüleme sistemi için açık bir genel gereksinimi ve sistem insan ya da hayvan kullanım16için amaçlanan belirli alaka. Bir üçüncü önemli bir spor tabanlı görüntü sistemi maruz vardır molekülün boyutu sınırlamaları yok avantajdır. Feyc tabanlı sistemlerde, bir büyük Contegra protein yapısı etkileyebilir kapsid, hücre tabanlı sistemlerde ise, bu membran yapısı etkileyebilir veya limit/membran translocation adım17bozabilen. Spore çevreleyen koruyucu Katmanlar 70'den fazla farklı proteinler10 / oluşmaktadır ve herhangi bir belirgin yapısal kusur veya fonksiyonel bozukluğu8olmadan büyük yabancı proteinler kabul verecek kadar esnektir. Buna ek olarak, her iki spor tabanlı görüntü sistemleri, membran translocation kapaklı protein değil gerekli8,9' dur. Nitekim, kapaklı proteinler ya anne hücre sitoplazma içinde üretilen ve aynı sitoplazma oluşuyor veya olgun spor8,9tarihinde adsorbe spore monte.
Spore görüntü başlangıçta spore yüzey18mühendisi genetik bir sistem geliştirerek elde edildi. Bu genetik sistem üzerinde dayalı) bir gen füzyon gen (bir taşıyıcı olarak kullanılan) bir spor ceket protein desteği ve gen olmak için protein arasındaki inşaat görüntülenen - transkripsiyon ve çevirim sinyalleri endojen varlığı Gen füzyon ve II ifadesi kontrol) genetik istikrar vermek için B. subtilis kromozom üzerinde chimeric gen entegrasyonu. Çeşitli spor yüzey proteinleri kullanarak taşıyıcıları ve çeşitli olası uygulamaları hedefleyen, Mukozal aşı değişen biocatalyst, Biyoalgılayıcı, Biyoremidasyon, rekombinant bu yaklaşım tarafından görüntülenen çeşitli antijenleri ve enzimler veya bioanalytical aracı8,13.
Daha yakın zamanlarda, farklı bir yaklaşım spor ekranının gelişmiş19olmuştur. Bu ikinci sistem nonrecombinant ve spontan ve son derece sıkı adsorpsiyon spore yüzey9moleküllerin dayanmaktadır. Antijenleri19,20 ve enzimler13,21 verimli bir şekilde görüntülenen ve bu yöntem rekombinant bir daha önemli ölçüde daha etkili olduğunu ortaya koymuştur. Nonrecombinant bu yaklaşım içinde yerel form20 protein görüntülenmesine izin verir ve ayrıca autoclaved ile kullanılabilir, ölüm19sporlar. Adsorpsiyon moleküler mekanizması tam olarak henüz açıklık olmuştur değil. Negatif yük ve spor hydrophobicity ilgili özellikler olarak adsorpsiyon13,19,22için önerilmiştir. Son zamanlarda, bir modeli protein, spore için adsorbe zaman mercan Discosoma, kırmızı autofluorescent protein (mRFP) iç kat23' yerelleştirme yüzey katmanı üzerinden sızmayı başardı gösterilmiştir. Diğer proteinler için gerçek olduğunu kanıtladı, kapaklı proteinlerin iç yerelleştirme sporlar23adsorbe zaman onların artan istikrar açıklar.
Son bir çalışmada, iki enzim xylan bozulması yolun iki ardışık adımlar katalizlerler B. subtilis sporlar üzerinde bağımsız olarak sergilendi ve birlikte, inkübe zaman her iki bozulması adımları21gerçekleştirmek başardık. Reaksiyon sonra hala aktif ve güçlü-e doğru taze substrat21eklenmesi üzerine xylan bozulma devam sporlar toplanan. Nihai ürünün yaklaşık % 15 kaybı ikinci reaksiyon21' gözlendi, adsorbe enzimler tek yanı sıra çok adımlı, tepkiler kullanılırlığı spore görüntüleme sistemi önemli bir avantajı olsa bile.
Pan ve ark.24 bildirdi Contegra proteinler spore yüzeyinde görüntülemek için ek bir yaklaşım: Anne hücrede sporulation sırasında üretilen Contegra proteinler (bir endoglucanase protein ve bir beta-galaktozidaz biri) idi kendiliğinden şekillendirme spor ceket, bir taşıyıcı, gerek kalmadan kaplı. Bu ek spore görüntüleme sistemi defa açıklanan iki yaklaşım bir kombinasyonudur. Nitekim, rekombinant Contegra proteinler onların derleme ceket içinde spontan iken anne hücrede sporulation sırasında ifade için tasarlanmış bu yana ve bu nedenle, nonrecombinant24. Ancak, bu ek yaklaşım görüntüsünü verimliliğini test ve aynı Contegra proteinler kullanarak diğer iki yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında kalır.
Spore üretim süreçlerinin mevcut Protokolü dışlar ve olmuştur arıtma kapsamlı bir şekilde başka bir24bölümünde. Adsorpsiyon tepki, adsorpsiyon dot Blot ve floresan mikroskopisi tarafından verimliliğini değerlendirme içerir ve adsorbe enzimler ek tepki için geri dönüşüm yuvarlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:908px;" width="906">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.1% Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">0.45 &#181;m Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td style="width:173px;">M_Blotting_Membranes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">100&#215; objective UPlanF1&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Bacillus subtilis&#160;strain NCIB3610</td>
			<td style="width:151px;">Bacillus Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:173px;">3A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BD ACCURI C6 PLUS</td>
			<td style="width:151px;">BD</td>
			<td style="width:173px;">flow cytometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">BX51</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">Fluorescent microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">Clarity</td>
			<td style="width:151px;">Biorad</td>
			<td style="width:173px;">1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:247px;">DP70 digital camera a</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC</td>
			<td style="width:151px;">Thermo fisher</td>
			<td style="width:173px;">F-2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:173px;">ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Monoclonal Anti-polyHistidine&#8722;Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">A7058-1VL</td>
			<td style="width:337px;">used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">SecureSlip&#160;glass coverslip</td>
			<td style="width:151px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">S1815-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Superwhite Uncharged Microscope Slides</td>
			<td style="width:151px;">VWR</td>
			<td>75836-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">U-CA Magnification Changer&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Olympus</td>
			<td style="width:173px;">microscope equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens

Bakteri spor koruyucu Katmanlar susuz bir sitoplazma çevreleyen bir dizi tarafından kurulan metabolik olarak sakin bir hücredir. Bu kendine özgü yapısı son derece sağlam ve dayanıklı spor yapar ve spor kullanım Contegra molekülleri görüntülemek için bir platform olarak önerdi. Şimdiye kadar çeşitli antijenleri ve enzimler görüntülenen sporlar Bacillus subtilis ve birkaç diğer türler üzerinde başlangıçta rekombinant bir yaklaşım tarafından ve daha sonra basit ve etkili bir nonrecombinant yöntemi tarafından. Nonrecombinant görüntüleme sistemi doğrudan adsorpsiyon rekombinant suşları inşaat ve çevre genetiği değiştirilmiş bakteri sürümü kaçınarak spore yüzeyi Contegra moleküllerin temel alır. Adsorbe molekülleri stabilize ve sınırlarını antijenleri hızlı yıkımı ve olumsuz koşullar, enzim aktivitesinin kaybı sporlar, etkileşim tarafından korunmaktadır. Bir kez kullanılan, spor adsorbe enzimler kolayca etkinliği en az bir azalma ile toplanan ve ek tepki tur için yeniden kullanılabilir. Bu yazıda modeli molekülleri saf sporlar B. subtilisiçin absorbe, adsorpsiyon verimliliğini değerlendirmek ve onları yeni reaksiyonlar için geri dönüşüm için kullanılan sporlar toplamak gösterilir.

Başarılı adsorpsiyon western Blot tarafından tespit edilebilir. Tepki üzerine karışımı Santrifüjü tarafından şeker ve yıkanmış ve Pelet kesir (şekil 1) yüzey proteinleri ayıklamak için kullanılır. Özü şeker SDS polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa), polivinilidin florid (PVDF) membran için electrotransferred tarafından ve birincil ve ikincil antikorlar karşı tepki gösterdi. Sadece adsorbed sporlar, özü ile yüklenen şeritte ...

Watch this Scientific Journal Video about Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens at JoVE.com

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Bu iletişim kuralı Contegra molekülleri çeşitli biyolojik etkinlikler ile absorbe için bir "canlı" nanobiotechnological araç olarak bakteriyel sporlar kullanımı üzerinde duruluyor. Adsorpsiyon verimini ölçmek için yöntemleri de gösterilir.

Spore adsorpsiyon enzimler ve antijenleri için Nonrecombinant görüntü sistemi olarak

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Antijen veya enzimler gösteren canlı bakteriyel sporlar mukozal aşılar veya biyokatalizörler olarak kullanılabilir fonksiyonel olarak aktif nano tanecikleri vardır. Prensip olarak, herhangi bir protein verimli sporlara adsorbe edilebilir. Bu teknik basittir ve herhangi bir genetik manipülasyon gerektirmez.Bu nedenle, rekombinant organizmaların çevreye salınması söz konusu değildir. İnsanlar ve hayvanlar için mukozal vaccinology ek olarak, enzimler gösteren sporlar yeniden kullanılabilir biyokatalizerler olarak geliştirilebilir. İki kez etiketleme ile başlayın 10 dokuzuncu B.subtilis wild-tipi saflaştırılmış sporlar model RFP iki-beş veya 10 mikrogram konsantrasyonları ile 200 mikrolitre bağlayıcı tampon 50-milimolar sodyum sitrat ile bir saat için bir saat için takviye 25 santigrat santigrat bir sallanan shaker.Kuluçka sonunda, santrifüj ile bağlayıcı karışımları pelet ve sonraki adsorpsiyon verimlilik analizi için yeni konik tüpler içine supernatants transfer. Daha sonra, spor peletlerini yıkama başına 200 mikrolitre bağlayıcı tampon la iki kez yıkayın ve ikinci yıkamadan sonra 100 mikrolitre taze bağlayıcı tampon da peletleri yeniden sulandırın. Yüzey proteini ekstraksiyonu için, yüzey sporları proteinlerini zayıflatmak için 50 mikrolitre 2X sodyum dodecyl sülfat-dithiothreitol mikrolitresine 50 mikrolitre ekin.65 santigrat derece 45 dakika sonra, santrifüj ile karışımları toplamak ve etiketli yüzey proteinleri tanımlamak için mRFP N-terminus onun etiketi mevcut tanıyan bir monoklonal anti-His antikor kullanarak, bir batı leke üzerinde supernatant ayıklanmış proteinlerin her hacmi10 mikrolitre çalıştırın. Floresan mikroskop ile adsorbe molekülleri lokalize etmek ve ölçmek için, 95 mikrolitre PBS'ye adsordi spor resuspension beş mikrolitre ekleyin ve her elde edilen süspansiyon beş mikrolitre tek tek mikroskop slaytlar üzerine ekleyin. Her slaytın üzerine bir poli-L-l-lizin işlem görmüş kapak fişi yerleştirin ve bir slaytı floresan mikroskop aşamasına yerleştirin.Daha sonra, her alan için faz kontrastı ve floresan mikroskopi görüntülerini kaydedin. Görüntü analizi için ImageJ'deki floresan mikroskopi görüntülerini açın ve tüm görüntülerin sekiz bit formatta olduğunu doğrulamak için Resim ve Yazı'yı seçin. Analiz menüsünden Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan, Tümleşik yoğunluk ve Ortalama gri değerinin seçildiğini onaylayın.İlgi alanının etrafına bir çizgi çizmek için bir çizim veya seçim aracı kullanın ve Analyze menüsünden Ölçü'yü seçin. Seçili spor için bir değer yığını içeren bir açılır pencere kutusu görüntülenir. En az 50 spor seçildikten sonra, herhangi bir spor olmadan çeşitli bölgeleri seçin ve arka plan floresan için bir okuma elde etmek için ölçümü tekrarlayın.Birkaç arka plan ölçümü aldıktan sonra, Sonuçlar penceresindeki tüm verileri bir elektronik tabloya kopyalayın ve düzeltilmiş hücre başına toplam floresan elde etmek için seçili sporların alanındaki tümleşik yoğunluğun ortalamasını ve arka plan floresan değerlerinin ortalamasını hesaplayın. Dolaylı adsorpsiyon verimliliği değerlendirmesi için, 0,5 nanogram/mikrolitre başına son hacimde saflaştırılmış mRFP'nin altı iki kat seri seyreltmesini, bağlama tamponunda seyreltme başına 250 mikrolitrelik son bir hacim ve 100 mikrolitrelik adsorpsiyon reaksiyonunun 100 mikrolitrelik bağlayıcı araleyici seyreltme reaksiyonu içeren ayrılmış süpernatant numunenin 100 mikrolitrelik iki kat seri seyreltmelerinin uygun bir deney sayısını gerçekleştirin. Daha sonra, 0,45 mikrometrelik bir kesitle 9'a 10 santimetre lik bir boyuta doğru bir nitroselüloz membranı kesip, nokta leke cihazının contasının kenarına kadar uzanmadan seyreltme alanını beş örnekle altı noktalı bir alanı kaplayın.Önceden ıslak membranı nokta leke aparatına yerleştirin. Membranın doğru boyutunu kontrol edin ve membran ve conta arasında sıkışmış hava kabarcıkları kaldırın. Üretici tarafından açıklandığı gibi nokta leke aparatı monte edin ve havanın bu kuyulardan hareket etmesini önlemek için cihazın kullanılmayan kısmını kapatın.Cihaz hazır olduğunda, standardı en dış şeritlerdeki iki dış şeritte ve numuneleri orta şeritlerde kuyu başına her uygun seyreltme için 100 mikrolitre yükleyin. Tüm numuneler yüklendiğinde, vakumu durdurmadan ve numunelerin yerçekimine göre membrandan filtre lemesine izin vermeden önce vakum pompasını iki dakika açın. 10 dakika sonra, pbs 100 mikrolitre ile her iyi yıkayın.Vakum pompasını beş dakika daha çalıştırın. Yıkama tamponu cihazdan tamamen boşaltıldığında, vakum açıkken, vidaları gevşetin ve nokta leke aparatını dikkatlice açın. Daha sonra membranı standart batı leke protokollerine göre işleyin.Filtrenin densitometrik analizi için ImageJ'i açın ve analiz, ölçü komutunu kullanarak tümleşik yoğunluğu ölçmek için her noktanın anahatlarını belirtin. Görüntünün arka plan düzeltmesini yapmak için boş bir alana bir daire çizin ve tümleşik yoğunluğunu gösterildiği gibi ölçün. Bir kalibrasyon hattı elde etmek için standart noktaların entegre yoğunluğunu yüklenen protein miktarıyla ilişkilendirin ve her numune noktanın mRFP konsantrasyonunu tahmin etmek için kalibrasyon eğrisini kullanın.Bağlı olmayan kesirlerde kalan mRFP konsantrasyonu daha sonra hesaplanabilir. Sadece adsorbed sporları bir özü ile yüklü şeritlerde beklenen boyutta proteinlerin varlığı başarılı bir adsorpsiyon reaksiyonu göstergesidir. Adsorpsiyon etkinliğinin doğrudan değerlendirilmesi, adsorpsiyon reaksiyonunun fraksiyonu sonrasında pelet fraksiyonunun floresan mikroskobu ve sitoflorimetrisi ile kullanılan heterolog proteine bağlıdır.Sporlarda bulunan floresan sinyallerin sayısallaştırılması daha sonra gösterildiği gibi ImageJ kullanılarak gerçekleştirilebilir. Adsorpsiyon etkinliğinin dolaylı analizi, bağlanmamış proteini içeren süpernatant fraksiyonun nokta lekeleme analizi ile yapılabilir ve bağlı olmayan proteinin sonraki densitometrik analizi sporlara adsore protein miktarının dolaylı olarak hesaplanmasına olanak sağlar. Prensip olarak herhangi bir protein mukozal aşı veya biyokatalizör olarak kullanılmak üzere adsorbe edilse de, uygulamada adsorpsiyon verimliliği protein bölgelerine ve kimyasal özelliklerine bağlıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Negatif Seçilebilir Marker Geliştirme Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Termostabil Bacteriolytic Enzimlerin yönlendirilmiş evrimi için Yeni Tarama Yöntemi

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antijenler Kompakt Hyperbranched Polyglycerols Of Aşılama Membran By Fonksiyonel Kırmızı Kan Hücreleri Korumalı

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Membran yuvası arıtma için çapraz-sunudaki eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulma

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...