Name: characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Wij danken Royena Tanaz Huda Yousuf en Sadiqa Taasen voor technische hulp. We zijn zeer dankbaar aan Prof. James Shorter royale voordelevering van reagentia en intellectuele bijstand bij het ontwerpen van sacharose tuning experimenten. Gist plasmiden waren een gulle gift van Prof. Aaron Gitler (met inbegrip van 303Gal-FUS; Addgene plasmide # 29614). Brooklyn College en de Advanced Science Research Center (CUNY) evenals een NIH NINDS geavanceerde postdoctorale overgang Award (K22NS09131401) ondersteund M.P.T.

1. het transformeren van S. cerevisiae met neurodegeneratieve proteinopathy-geassocieerde proteïne constructies
<ol><li>Groeien wild type (WT) 303 gist in gist extract pepton dextrose (YPD) Bouillon overnachting met schudden (200 rpm) bij 30 ° C.</li>
	<li>Na 12−16 h van groei, Verdun gist om een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,25 met YPD. Zoals 10 mL vloeibare gist-cultuur nodig zal zijn voor elke transformatie, 50 mL vloeibare gist-cultuur voorbereiden op vijf transformaties overee...

<ol>
	<li>Landgrave-G&#243;mez, J., Mercado-G&#243;mez, O., Guevara-Guzm&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases.">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).</li><li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis:+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era.">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li><li>Beitz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease:+a+Review.">Parkinson's Disease: a Review.</a> Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS.">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes.">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li><li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS/TLS+in+ALS+and+beyond.">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li><li>King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tip+of+the+iceberg:+RNA-binding+proteins+with+prion-like+domains+in+neurodegenerative+disease.">The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease.</a> Brain Research. 1462, 61-80 (2012).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations.">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson's+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies.">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).</li><li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+parkinson's+disease:+dopamine,+vesicles+and+&#945;-synuclein.">Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and &#945;-synuclein.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).</li><li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle.">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 &#197; resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+concepts+of+epigenetics.">Basic concepts of epigenetics.</a> Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory.">Histone acetylation and transcriptional regulatory.</a> Genes &amp; Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Sanchez, Y., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP104+required+for+induced+thermotolerance.">HSP104 required for induced thermotolerance.</a> Science. 248 (4959), 1112 (1990).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772 (2003).</li><li>Johnson, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+Is+Intrinsically+Aggregation-prone,+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis-linked+Mutations+Accelerate+Aggregation+and+Increase+Toxicity.">TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+&#945;-synuclein.">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human &#945;-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reveal+a+&#8220;Druggable&#8221;+Rsp5/Nedd4+Network+that+Ameliorates+&#945;-Synuclein+Toxicity+in+Neurons.">Yeast Reveal a &#8220;Druggable&#8221; Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates &#945;-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979 (2013).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li><li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).</li><li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models.">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).</li><li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models.">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li><li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+sequestration+of+FUS/TLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1.">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li><li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+(ALS)+Causing+Genes.">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li><li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson&#8217;s+disease:+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions.">Epigenetic approach to early-onset Parkinson&#8217;s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li><li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Modifications+of+the+&#945;-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects.">Epigenetic Modifications of the &#945;-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).</li></ol>

Het protocol hier beschreven biedt een eenvoudige, doelmatige en kosteneffectieve manier van het categoriseren van genoom-brede Histon PTM wijzigingen gecorreleerd met neurodegeneratieve proteinopathies. Hoewel er andere modellen van ALS en PD, zoals in vitro modellen menselijke cellijnen en RattenUitrustingen32, S. cerevisiae blijft aantrekkelijk vanwege haar gebruiksgemak. Bijvoorbeeld, gist modellen vereisen geen gebruik van een steriele kap, noch hoeven zij de intensieve ople...

Neurodegeneratieve ziekten zijn verwoestende ziekten met weinig tot geen behandelingsopties beschikbaar. Onder deze zijn Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van Parkinson (PD) bijzonder verschrikkelijk. Ongeveer 90% van de gevallen van ALS en PD worden beschouwd als sporadisch, die zich zonder familiegeschiedenis van de ziekte, terwijl de resterende gevallen uitgevoerd in gezinnen en in het algemeen zijn gekoppeld aan een specifiek gen mutatie1,2. Interessant, zijn beide van deze ziekten geassocieerd met de eiwitten mislocalization en aggregatie3,4,5,6. Bijvoorbeeld, gesmolten in Sarcoom (FUS) en TAR DNA-bindende eiwit 43 (TDP-43) zijn RNA-bindende proteÃ¯nen die mislocalize naar het cytoplasma en samen te voegen in ALS7,8,9,10, 11,12, terwijl α-synuclein het principe onderdeel van eiwithoudende aggregaten Lewy organen genoemd in PD5,13,14,15 is.
Ondanks de inspanningen van de uitgebreide genoom-brede vereniging in grote populaties van de patiënt blijven de overgrote meerderheid van ALS en PD gevallen onverklaarbare genetisch. Epigenetica een rol kan spelen in neurodegeneratieve ziekte? Epigenetica omvat wijzigingen in genexpressie voorkomen zonder veranderingen aan onderliggende DNA-sequentie16. Een belangrijkste epigenetische mechanisme omvat de post-vertalende wijzigingen (PTMs) van Histon eiwitten16. In eukaryote cellen, is genetisch materiaal strak verpakt in chromatine. De basiseenheid van de chromatine is de nucleosoom, bestaande uit 146 basenparen van DNA gewikkeld rond een Histon octamer, bestaande uit vier paar histonen (in tweevoud elke histonen H2A, H2B, H3 en H4)17. Elke Histon heeft een N-terminal staart dat steekt uit de nucleosoom en kan worden gewijzigd door de toevoeging van verschillende chemische wordt, meestal op lysine en arginine residuen18. Deze PTMs zijn dynamisch, wat betekent dat zij gemakkelijk kunnen worden toegevoegd en verwijderd en groepen zoals acetylation, methylering en fosforylering. PTMs controle van de toegankelijkheid van DNA voor de transcriptionele machines, en aldus bijdragen tot het besturingselement gen expressie18. Bijvoorbeeld, histone acetylation vermindert de sterkte van de elektrostatische interactie tussen het eiwit zeer fundamentele histone en de negatief geladen DNA ruggengraat, waardoor de genen ingepakt door geacetyleerd histonen meer toegankelijk te maken en dus zeer 19uitgedrukt. Meer recentelijk, de opmerkelijke biologische specificiteit van bepaalde Histon PTMs en combinaties daarvan heeft geleid tot de Histon code hypothese20,21 in welke eiwitten die schrijven, wissen en lezen Histon PTMs alle in concert handelen moduleren genexpressie.
Gist is een handig model te bestuderen neurodegeneratie. Nog belangrijker is, zijn veel neuronale cellulaire routes bewaard uit gist tot mens22,23,24. Gist recapituleren cytotoxiciteit fenotypes en eiwit insluitsels op overexpressie van FUS, TDP-43 of α-synuclein22,23,24,25,26. In feite, hebben Saccharomyces cerevisiae modellen van ALS zijn gebruikt ter identificatie van de genetische risicofactoren in mens27. Bovendien, gist menselijke α-synuclein toegestaan voor de karakterisatie van het Rsp5-netwerk als een druggable doel om te verzachten van α-synuclein toxiciteit in neuronen28,29overexpressing.
Hier beschrijven we een protocol exploitatie van Saccharomyces cerevisiae voor het detecteren van genoom-brede Histon PTM wijzigingen neurodegeneratieve proteinopathies (Figuur 1) is gekoppeld. Het gebruik van S. cerevisiae is zeer aantrekkelijk vanwege zijn gebruiksgemak, lage kosten, en snelheid in vergelijking met andere modellen van het in vitro en dierlijk van neurodegeneratie. Gebruik te maken van eerder ontwikkeld ALS en PD modellen22,23,25,26, we hebben overexpressie menselijke FUS TDP-43 en α-synuclein in gist en ongedekte verschillende Histon PTM veranderingen in verbinding met elke proteinopathy30. Het protocol dat wij hier beschrijven kan worden afgerond in minder dan twee weken van transformatie tot data-analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>-His DO Supplement</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Polyacrylamide Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>07-353 (Lot No. 2762291)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109463 (Lot No. GR187780)</td>
			<td>Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab46983 (Lot No. GR71882)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td>
			<td>Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate, 96 well</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td>
			<td>Dilution: 1/2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blot paper (filter paper)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare 50 % w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL Transfer Membranes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td>Prepare a 1 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>102855-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe I Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>101228-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-ccdB</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303Gal-FUS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>29614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-TDP-43</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td>Prepare a 50% w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504</td>
			<td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Prepare 10% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>201190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGal-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Prepare 0.2 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 303 S. cerevisiae yeast</td>
			<td>Gift from J. Shorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models

Neurodegeneratieve ziekten, zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en de ziekte van Parkinson (PD), leiden tot het verlies van honderden duizenden levens per jaar. Effectieve behandelingsopties kunnen stoppen progressie van de ziekte ontbreken. Ondanks de inspanningen van de uitgebreide rangschikken in grote populaties van de patiënt blijven de meeste ALS en PD gevallen onverklaarbare door genetische mutaties alleen. Epigenetica mechanismen, zoals de posttranslationele wijziging van Histon eiwitten, kunnen worden betrokken in de etiologie van neurodegeneratieve ziekte en de progressie en leiden tot nieuwe streefcijfers voor farmaceutische interventie. Zoogdieren in vivo en in vitro modellen van ALS en PD zijn duur en vereisen vaak langdurige en moeizame experimentele protocollen. We schetsen hier, een praktische, snelle en kosteneffectieve aanpak bij de vaststelling van genoom-brede wijzigingen in Histon wijziging niveaus met behulp van Saccharomyces cerevisiae als een modelsysteem. Dit protocol voorziet in uitgebreide onderzoeken naar de epigenetische veranderingen verbonden met neurodegeneratieve proteinopathies die eerdere bevindingen in verschillende modelsystemen bevestigen terwijl aanzienlijk uitbreiden van onze kennis van de neurodegeneratieve ziekte epigenome.

Ter illustratie van deze methode, zullen we gebruik maken van de onlangs gepubliceerde resultaten30. WT menselijke FUS en TDP-43 waren overexpressie voor 5 h, terwijl WT α-synuclein was overexpressie gedurende 8 uur. Een ccdB constructie werd gebruikt als een vector negatieve controle. Figuur 2 toont groei onderdrukking in vaste en vloeibare culturen. Gist is gekapt zoals beschreven en westelijke bevlekken met wijziging-specifieke ant...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Dit protocol beschrijft experimentele procedures karakteriseren van genoom-brede veranderingen in de niveaus van Histon posttranslationele modificaties (PTM) die zich voordoen in verband met de overexpressie van eiwitten ALS en Parkinson in zijn gekoppeld Saccharomyces cerevisiae modellen. Na SDS-pagina de scheiding, worden individuele Histon PTM niveaus gedetecteerd met wijziging-specifieke antilichamen via het westelijke bevlekken.

Karakterisering van Histone posttranslationele wijziging wijzigingen in gist neurodegeneratieve Proteinopathy modellen

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Dit protocol stelt ons in staat om gemakkelijk te verkennen van de epigenetische kenmerken van neurodegeneratieve ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gist als modelsysteem exploiteert, in vergelijking met andere cellulaire en dierlijke modellen van neurodegeneratieve ziekte, gist is opportuun en kostenefficiënt. Deze techniek stelt ons in staat om de epigenetische veranderingen die zich voordoen in neurodegeneratieve ziekte, die kunnen leiden tot nieuwe markers voor de diagnose, evenals nieuwe doelen voor therapie in kaart te brengen.Deze methode maakt verder onderzoek van de rol van epigenetische merken bij neurodegeneratieve ziekte mogelijk en kan worden aangepast voor de beoordeling van menselijke fibroblasten en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze specifieke methode bevat een aantal details die visueel moeten worden aangetoond, zoals het goed laden van het westerse vlekapparaat. Het aantonen van de procedure zal Michel Fallah en Navin Rana, beide undergraduate onderzoekers in het Torrente laboratorium.Begin met het restreaking gist uit bevroren glycerol voorraden op histidine 2%glucose agar selectieve medium platen, voor een twee tot drie dagen incubatie bij 30 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, inenting restreaked gist voor elk over expressie model en controle in vijf milliliter van histidine selectieve vloeibare medium. Aangevuld met 2%raffinose bij 30 graden Celsius en 200 rotaties per minuut, 's nachts.De volgende ochtend, groeien 100 milliliter vloeibare cultuur voor elk van de overexpressie modellen en controles in selectieve mediums aangevuld met 2% galactose 's nachts. En meet de optische dichtheid op 600 nanometer of OD600 om het volume van de nachtelijke cultuur te bepalen die nodig is om expressieculturen te maken bij een beginnende OD600 van 0,3. Om eiwitoverexpressie te induceren, kweekt u de gist op galactosemedium met schudden op 30 graden Celsius voor de juiste experimentele periode.Meet vervolgens de OD600 van elke cultuur aan het einde van de inductieperiode. En standaardiseer alle celtellingen tot de laagste OD600-waarde. Oogst de culturen in 50 milliliter centrifugebuizen door centrifugatie en resuspend de pellets in een milliliter steriel stilstaand water voor elke 10 milliliter kweek geteeld.Aliquot een milliliter cel resuspensie in individuele microcentrifuge buizen voor een extra centrifugatie en het aanzuigen van de supernatants. Vervolgens snap bevriezen van de cel pellets in vloeibare stikstof voor opslag op min 80 graden Celsius. Om de cellen te lyse voor westerse vlekanalyse, ontdooi de gistcelpellets op ijs voordat ze opnieuw worden geschorst in 100 microliters gedestilleerd water.Voeg 300 microliter natriumhydroxide van 0,2 molar en 20 microliter 2-Mercaptoethanol toe aan elk celmonster. En resuspend de pellets door pipetting. Na een incubatie van 10 minuten op ijs, pellet de cellen door centrifugatie en resuspend de monsters in 100 microliters van lading kleurstof.Kook vervolgens de monsters gedurende 10 minuten op een verwarmingsblok. Terwijl de monsters worden lysed, plaats twee gels in een gel houder en vul de binnenste kamer naar de top met lopende buffer en de buitenkamer aan de twee-gel lijn merk. Wanneer de monsters klaar zijn, laad 15 microliters per stuk, cel lyse oplossing, in elke put van de 10 goed, 12% polyacrylamide gel en voeg vijf microliter eiwit ladder aan de eiwit ladder lane goed.Voer de gel ongeveer 45 minuten op 150 volt of totdat het laden kleurstof voorzijde bereikt de bodem van de gel. Terwijl de gel draait, weken twee vezel pads per gel in overdracht buffer en een polyvinylidene fluoride, of PVDF, membraan per gel in methanol. Wanneer de gel klaar is, spoel membraan in overdracht buffer en plaats een voorgesnapte vezel pad op de bodem van een semi-droge overdracht apparaat cel.Gevolgd door de PVDF membraan, de gel en de tweede presoaked fiber pad. Stel vervolgens de stroom in op 150 milliampère voor een uur. Verwijder aan het einde van de eiwitoverdracht het membraan uit het transferapparaat voor een korte spoeling met gedestilleerd water.Plaats het gespoelde membraan, eiwit kant omhoog in een kleine kleuring doos en bedek het membraan met tris-gebufferde zoutoplossing of TBS, het blokkeren van buffer voor een uur incubatie bij kamertemperatuur met zachte schommelen. Aan het einde van de blokkerende incubatie, incuberen het membraan 's nachts met een anti-gist histone en modificatie-specifieke antilichaam in TBS op vier graden Celsius. En een goede nucleaire lading controle antilichaam.De volgende ochtend, was het membraan vier keer in TBS, aangevuld met 0,1% polysorbaat 20 gedurende vijf minuten met schommelen op kamertemperatuur per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, incubeer de vlek met de juiste secundaire antilichamen gedurende een uur bij kamertemperatuur. Gevolgd door vier, vijf minuten wasbeurten in tbst en een vijf minuten wassen in tbs alleen met schommelen.Dan beeld de vlek op een fluorescerende Westerse vlek verbeelden systeem voor twee minuten. Hier wordt groeionderdrukking in vaste en vloeibare culturen aangetoond met significante effecten op de gistgroei waargenomen in de aanwezigheid van galactose-geïnfundeerd in sarcoomoverexpressiemodellen. Een significante daling van de histonniveaus zijn zichtbaar in het gefuseerde sarcoomoverexpressiemodel en aanzienlijke stijgingen van de histonacetylatie in het TAR-bindende eiwit 43 overexpressiemodel, worden waargenomen die niet worden waargenomen in het gefuseerde sarcoom- of alfasynuclein overexpressiemodel.Er zijn ook aanzienlijke dalingen in de histonniveaus in het alfasynuclein overexpressiemodel. In dit sacharose-tuning experiment, hoe lager de hoeveelheid galactose gebruikt om te induceren gesmolten in sarcoom overexpressie, de lagere toxiciteit die wordt waargenomen in zowel vaste als vloeibare cultuur. Belangrijk is, hoe lager het niveau van gesmolten in sarcoom overexpressie, hoe kleiner de omvang van de vermindering van de histonniveaus.Tijdens het uitvoeren van dit protocol, is het noodzakelijk om de hoeveelheid gist in elk monster te standaardiseren om een goede vergelijking in de niveaus van histone post-translationele wijziging mogelijk te maken. 2-Mercaptoethanol moet onder een kap worden gebruikt om inademing te voorkomen. Als Ponceau vlek wordt gebruikt, moet het goed worden weggegooid.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutieve en afleidbare systemen voor genetische In Vivo wijziging van muis hepatocyten gebruik hydrodynamische staart veneuze injectie

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Een snelle en kwantitatieve methode voor de posttranslationele wijziging en Variant ingeschakeld toewijzing van peptiden aan Genomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...