Name: characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Nous remercions Royena Tanaz, Huda Yousuf et Sadiqa Taasen pour l’aide technique. Nous sommes très reconnaissants à Prof. James Shorter pour la prestation généreuse de réactifs et d’assistance intellectuelle dans la conception d’expériences tuning de saccharose. Plasmides de levure ont été un don généreux de Prof. Aaron Gitler (y compris 303Gal-FUS ; Addgene plasmidique 29614 #). Brooklyn College et de l’Advanced Science Research Center (CUNY), mais aussi un NIH NINDS Advanced Transition bourse postdoctorale (K22NS09131401) prise en charge M.P.T.

1. transformation de S. cerevisiae avec neurodégénératives protéine associée à la proteinopathy des constructions
<ol><li>Croître de type sauvage (WT) 303 levure dans bouillon de dextrose (DPJ) peptonée levure extrait du jour au lendemain avec agitation (200 tr/min) à 30 ° C.</li>
	<li>Après 12−16 h de croissance, diluer la levure à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,25 avec la DPJ. Que 10 mL de culture liquide de levures seront nécessaires pour chaque transformation, 50 mL d...

<ol>
	<li>Landgrave-G&#243;mez, J., Mercado-G&#243;mez, O., Guevara-Guzm&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases.">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).</li><li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis:+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era.">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li><li>Beitz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease:+a+Review.">Parkinson's Disease: a Review.</a> Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS.">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes.">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li><li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS/TLS+in+ALS+and+beyond.">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li><li>King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tip+of+the+iceberg:+RNA-binding+proteins+with+prion-like+domains+in+neurodegenerative+disease.">The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease.</a> Brain Research. 1462, 61-80 (2012).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations.">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson's+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies.">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).</li><li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+parkinson's+disease:+dopamine,+vesicles+and+&#945;-synuclein.">Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and &#945;-synuclein.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).</li><li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle.">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 &#197; resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+concepts+of+epigenetics.">Basic concepts of epigenetics.</a> Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory.">Histone acetylation and transcriptional regulatory.</a> Genes &amp; Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Sanchez, Y., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP104+required+for+induced+thermotolerance.">HSP104 required for induced thermotolerance.</a> Science. 248 (4959), 1112 (1990).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772 (2003).</li><li>Johnson, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+Is+Intrinsically+Aggregation-prone,+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis-linked+Mutations+Accelerate+Aggregation+and+Increase+Toxicity.">TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+&#945;-synuclein.">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human &#945;-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reveal+a+&#8220;Druggable&#8221;+Rsp5/Nedd4+Network+that+Ameliorates+&#945;-Synuclein+Toxicity+in+Neurons.">Yeast Reveal a &#8220;Druggable&#8221; Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates &#945;-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979 (2013).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li><li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).</li><li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models.">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).</li><li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models.">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li><li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+sequestration+of+FUS/TLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1.">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li><li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+(ALS)+Causing+Genes.">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li><li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson&#8217;s+disease:+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions.">Epigenetic approach to early-onset Parkinson&#8217;s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li><li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Modifications+of+the+&#945;-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects.">Epigenetic Modifications of the &#945;-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).</li></ol>

Le protocole décrit ici offre un moyen simple, rapide et rentable de catégoriser les changements PTM pangénomique histone corrélées avec neurodégénératives proteinopathies. Bien qu’il existe d’autres modèles de la SLA et la MP, tel que in vitro murin et des lignées cellulaires humaines modèles32, S. cerevisiae reste attractif en raison de sa facilité d’utilisation. Par exemple, les modèles de levure ne nécessitent pas l’utilisation d’une hotte stérile, ni...

Les maladies neurodégénératives sont des maladies dévastatrices avec peu ou aucune option de traitement disponible. Parmi ceux-ci, la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie de Parkinson (MP) sont particulièrement horribles. Environ 90 % des cas de SLA et PD sont considérés comme sporadique, qui se produisent sans antécédents familiaux de la maladie, tandis que le reste des cas dans les familles et sont généralement liées à un gène spécifique mutation1,2. Fait intéressant, les deux de ces maladies sont associés à la protéine localisée et agrégation3,4,5,6. Par exemple, fondus dans le sarcome (FUS) et de protéines de liaison à l’ADN de goudron 43 (TDP-43) sont des protéines de liaison ARN qui mislocalize vers le cytoplasme et agrègent l’ALS7,8,9,10, 11,12, tandis que la synucléine α est le composant de principe des agrégats protéiques appelées corps de Lewy dans PD5,13,14,15.
Malgré les efforts d’une vaste association pangénomique dans grandes populations de patients, l’écrasante majorité des cas de SLA et la MP demeure inexpliquée génétiquement. Pouvez épigénétique jouent un rôle dans les maladies neurodégénératives ? Épigénétique compose de changements dans l’expression des gènes qui se produisent sans modifications sous-jacentes de séquence ADN16. Un mécanisme épigénétique principal implique des modifications post traductionnelle (PTMs) d’histone protéines16. Dans les cellules eucaryotes, le matériel génétique est emballer soigneusement dans la chromatine. L’unité de base de la chromatine est le nucléosome, composé de 146 paires de bases d’ADN enroulé autour d’un octamère d’histones, composé de quatre paires d’histones (deux copies chacun des histones H2A, H2B, H3 et H4)17. Chaque histone possède une queue de N-terminal qui fait saillie hors du nucléosome et peut être modifiée par l’addition des fractions chimiques diverses, généralement sur de résidus de lysine et arginine18. Ces Sptm est dynamiques, ce qui signifie qu’ils peuvent être facilement ajoutés et supprimés et comprennent des groupes tels que l’acétylation, méthylation et phosphorylation. Sptm contrôle l’accessibilité de l’ADN à la machinerie transcriptionnelle et aidera ainsi le contrôle gene expression18. Par exemple, l’acétylation des histones réduit la force de l’interaction électrostatique entre la protéine histone très basiques et l’échine d’ADN chargée négativement, ce qui permet des gènes emballés par les histones acétylées soit plus accessible et donc très a19. Plus récemment, la spécificité biologique remarquable de Sptm histone particulière et leurs combinaisons a conduit à l’histone code hypothèse20,21 dans lequel les protéines qui écrire, effacer et lire histone Sptm tous agir de concert pour moduler l’expression des gènes.
La levure est un modèle très utile pour étudier la neurodégénérescence. Important, nombreuses voies cellulaires neuronales sont conservés de la levure à l’homme22,23,24. Levure récapituler les phénotypes de la cytotoxicité et inclusions de protéine sur la surexpression de FUS, TDP-43 ou α-synucléine22,23,24,25,26. En fait, modèles Saccharomyces cerevisiae de la SLA ont été utilisés pour identifier les facteurs de risque génétiques humains27. En outre, levure surexprimant la synucléine α humain autorisé pour la caractérisation du réseau Rsp5 comme cible thérapeutiques pour atténuer la toxicité de la synucléine α en neurones28,29.
Nous décrivons ici un protocole exploitant Saccharomyces cerevisiae pour détecter les modifications PTM pangénomique histone associées neurodégénératives proteinopathies (Figure 1). L’utilisation de S. cerevisiae est très attrayante en raison de sa facilité d’utilisation, faible coût et de la vitesse par rapport aux autres modèles in vitro et animaux de la neurodégénérescence. Harnessing précédemment développé ALS et PD modèles22,23,25,26, nous avons surexprimé humaines FUS, TDP-43 et α-synucléine dans les levures et changements PTM histone distincts non couverts dans connexion avec chaque proteinopathy30. Le protocole que nous décrivons ici peut être complété en moins de deux semaines d’une transformation à l’analyse des données.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>-His DO Supplement</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Polyacrylamide Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>07-353 (Lot No. 2762291)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109463 (Lot No. GR187780)</td>
			<td>Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab46983 (Lot No. GR71882)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td>
			<td>Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate, 96 well</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td>
			<td>Dilution: 1/2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blot paper (filter paper)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare 50 % w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL Transfer Membranes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td>Prepare a 1 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>102855-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe I Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>101228-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-ccdB</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303Gal-FUS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>29614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-TDP-43</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td>Prepare a 50% w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504</td>
			<td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Prepare 10% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>201190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGal-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Prepare 0.2 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 303 S. cerevisiae yeast</td>
			<td>Gift from J. Shorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models

Les maladies neurodégénératives, comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de la maladie de Parkinson (MP), entraîner la perte de centaines de milliers de vies chaque année. Options de traitement efficaces capables de stopper la progression de la maladie ne manquent pas. Malgré les efforts de séquençage des grandes populations de patients, la plupart des cas de SLA et la MP demeure inexpliquée par des mutations génétiques. Mécanismes épigénétique, telles que la modification post-traductionnelle des protéines histones, pourraient être impliqués dans la progression et l’étiologie des maladies neurodégénératives et conduisent à de nouvelles cibles d’intervention pharmaceutique. Des modèles mammifères in vivo et in vitro de la SLA et la MP sont coûteuses et nécessitent souvent de longues et laborieuses des protocoles expérimentaux. Ici, nous présentons une méthode pratique, rapide et rentable pour déterminer pangénomique modifications dans les niveaux de modification d’histone utilisant Saccharomyces cerevisiae comme modèle. Ce protocole permet d’enquêtes approfondies dans les changements épigénétiques connectés à proteinopathies neurodégénérative que corroborent les conclusions antérieures dans des systèmes différents modèles tout en élargissant considérablement notre connaissance de la épigénome de maladies neurodégénératives.

Pour illustrer cette méthode, nous profiterons des résultats récemment publiés,30. WT FUS humain et TDP-43 ont été surexprimé pendant 5 h, tandis que WT α-synucléine était surexprimée pendant 8 h. Une construction de base de données a été utilisée comme contrôle négatif vector. La figure 2 illustre la suppression de la croissance dans des cultures liquides et solides. Levure a été récolté comme décrit et éponger ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Ce protocole énonce les procédures expérimentales afin de caractériser le génome des changements dans les concentrations des modifications post-traductionnelles des histones (PTM) survenant dans le cadre de la surexpression de protéines associées à la SLA et la maladie de Parkinson dans Modèles de Saccharomyces cerevisiae . Après la séparation de SDS-PAGE, niveaux PTM histones individuelles sont détectés avec une modification spécifique des anticorps par Western Blot.

Caractériser l’Histone modifications post-traductionnelles levure neurodégénératives Proteinopathy modèles

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Ce protocole nous permet d’explorer facilement les caractéristiques épigénétiques de la maladie neurodégénérative. Le principal avantage de cette technique est qu’elle exploite la levure comme un système modèle, par rapport à d’autres modèles cellulaires et animaux de la maladie neurodégénérative, la levure est rapide et rentable. Cette technique nous permet de cartographier les changements épigénétiques qui surviennent dans les maladies neurodégénératives, ce qui peut conduire à de nouveaux marqueurs pour le diagnostic, ainsi que de nouvelles cibles pour la thérapie.Cette méthode permet une étude plus approfondie du rôle des marques épigénétiques dans la maladie neurodégénérative et peut être modifiée pour l’évaluation des fibroblastes humains et des cellules souches pluripotentes induites. Cette méthode particulière contient un certain nombre de détails qui doivent être démontrés visuellement, tels que le chargement approprié de l’appareil de tache occidentale. Michel Fallah et Navin Rana, tous deux chercheurs de premier cycle au laboratoire Torrente, démontreront la procédure.Commencez par réédifier la levure des stocks congelés de glycérol sur les plaques moyennes sélectives d’agar d’histidine 2%, pour une incubation de deux à trois jours à 30 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, inoculer la levure restreaked pour chaque modèle de sur-expression et contrôler en cinq millilitres de milieu liquide sélectif d’histidine. Complété par 2% raffinose à 30 degrés Celsius et 200 rotations par minute, pendant la nuit.Le lendemain matin, cultiver 100 millilitres de culture liquide pour chacun des modèles de surexpression et les contrôles dans les médiums sélectifs complétés par 2% galactose pendant la nuit. Et mesurer la densité optique à 600 nanomètres ou OD600 pour déterminer le volume de la culture du jour au lendemain nécessaire pour rendre plus de cultures d’expression à un OD600 de départ de 0,3. Pour induire une surexpression des protéines, faire pousser la levure sur le milieu galactose avec des secousses à 30 degrés Celsius pour la période expérimentale appropriée.Mesurez ensuite l’OD600 de chaque culture à la fin de la période d’induction. Et normaliser tous les nombres de cellules à la valeur OD600 la plus basse. Récoltez les cultures dans des tubes de centrifugeuse de 50 millilitres par centrifugation et réutilisez les granulés dans un millilitre d’eau calme stérile pour chaque 10 millilitres de culture cultivés.Aliquot un millilitre de résuspension cellulaire dans les tubes individuels de microcentrifugeuse pour une centrifugation supplémentaire et aspirer les supernatants. Puis casser congeler les granulés cellulaires dans l’azote liquide pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour lyse les cellules pour l’analyse occidentale de tache, décongeler les granules de cellules de levure sur la glace avant la resuspension dans 100 microlitres d’eau distillée.Ajouter 300 microlitres d’hydroxyde de sodium de 0,2 molaire et 20 microlitres de 2-Mercaptoéthanol à chaque échantillon cellulaire. Et resuspendez les granulés par pipetting. Après une incubation de 10 minutes sur la glace, pelleter les cellules par centrifugation et resuspendre les échantillons dans 100 microlitres de colorant de chargement.Faire bouillir ensuite les échantillons pendant 10 minutes sur un bloc chauffant. Pendant que les échantillons sont lysés, placez deux gels dans un porte-gel et remplissez la chambre intérieure vers le haut avec tampon en cours d’exécution et la chambre extérieure à la marque de ligne de deux gels. Lorsque les échantillons sont prêts, chargez 15 microlitres chacun, solution de lyse cellulaire, dans chaque puits du puits 10, 12% gel polyacrylamide et ajouter cinq microlitres d’échelle de protéines à la voie échelle de protéines bien.Faire fonctionner le gel pendant environ 45 minutes à 150 volts ou jusqu’à ce que le chargement du front de teinture atteigne le fond du gel. Pendant que le gel est en cours d’exécution, tremper deux tampons de fibres par gel dans le tampon de transfert et un fluorure de polyvinylidene, ou PVDF, membrane par gel dans le méthanol. Lorsque le gel est prêt, rincer la membrane dans le tampon de transfert et placer un tampon de fibre présoaked sur le fond d’une cellule d’appareil de transfert semi-sec.Suivi de la membrane PVDF, le gel et le deuxième tampon de fibre présoaked. Réglez ensuite la puissance à 150 milliamps pendant une heure. À la fin du transfert de protéines, retirer la membrane de l’appareil de transfert pour un bref rinçage à l’eau distillée.Placez la membrane rincée, côté protéine vers le haut dans une petite boîte à taches et couvrez la membrane avec de la solution saline ou tbs tamponnée par tris, bloquant le tampon pendant une incubation d’une heure à température ambiante avec un basculement doux. À la fin de l’incubation de blocage, incuber la membrane pendant la nuit avec un histone anti-levure et un anticorps spécifique à la modification dans le SCT à quatre degrés Celsius. Et un anticorps de contrôle de chargement nucléaire approprié.Le lendemain matin, laver la membrane quatre fois dans le SCT, complété par 0,1% polysorbate 20 pendant cinq minutes avec basculement à température ambiante par lavage. Après le dernier lavage, incuber la tache avec les anticorps secondaires appropriés pendant une heure à température ambiante. Suivi de quatre lavages de cinq minutes au TBST et d’un lavage de cinq minutes dans le SCT seul avec bascule.Puis l’image de la tache sur un système fluorescent d’imagination de tache occidentale pendant deux minutes. Ici, la suppression de croissance dans les cultures solides et liquides est montrée avec des effets significatifs sur la croissance de levure observés en présence de galactose-infusé dans les modèles de surexpression de sarcome. Une diminution significative des niveaux d’histone sont évidentes dans le modèle fusionné de surexpression de sarcome et des augmentations significatives des niveaux d’acétylation d’histone dans le modèle de surexpression de protéine de liaison de TAR 43, sont observées qui ne sont pas vues dans le modèle fusionné dans le sarcome ou l’exexpression alpha de synucléine.Il y a également des diminutions significatives des niveaux d’histone dans le modèle de surexpression d’alpha synucléine. Dans cette expérience de sucrose-tuning, plus la quantité de galactose utilisée pour induire fusionné dans la surexpression de sarcome, la toxicité inférieure qui est observée dans la culture solide et liquide. Fait important, plus le niveau de fusion dans la surexpression du sarcome est faible, plus l’ampleur de la réduction des niveaux d’histone est faible.Lors de l’exécution de ce protocole, il est impératif de normaliser la quantité de levure dans chaque échantillon pour permettre une comparaison appropriée dans les niveaux de modification post-translationnelle histone. 2-Mercaptoéthanol doit être utilisé sous un capot pour éviter l’inhalation. Si la tache Ponceau est utilisée, elle doit être jetée correctement.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogénétiques mutagenèse aléatoire Utilisation Histone-miniSOG dans<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Recherche

Génétique

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenèse de Histone gènes dans la levure bourgeonnante

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Systèmes inductibles et constitutives génétique In Vivo modification des hépatocytes de souris à l’aide d’Injection dans la veine queue hydrodynamique

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Une méthode rapide et Quantitative pour Modification post-traductionnelle et variante compatible cartographie des Peptides aux génomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...