Name: characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Wir danken Royena Tanaz, Huda Yousuf und Sadiqa Taasen für technische Hilfe. Wir sind sehr dankbar für die großzügige Bereitstellung von Reagenzien und geistige Unterstützung bei der Gestaltung von Saccharose tuning Experimente Prof. James Shorter. Hefe-Plasmide wurden ein großzügiges Geschenk von Prof. Aaron Gitler (einschließlich 303Gal-FUS; Addgene Plasmid # 29614). Brooklyn College und der Advanced Science Research Center (CUNY) sowie ein NIH NINDS Advanced Postdoc Übergang Award (K22NS09131401) unterstützt M.P.T

1. Umwandlung S. Cerevisiae mit Neurodegenerative Proteinopathy-assoziierten Protein Konstrukte
<ol><li>Wachsen Sie Wildtyp (WT) 303 Hefe in Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Brühe über Nacht mit schütteln (200 u/min) bei 30 ° C.</li>
	<li>Nach 12−16 h des Wachstums, verdünnen Hefe zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,25 mit YPD. Da 10 mL liquid Hefekultur für jede Transformation benötigt wird, bereiten Sie fünf Transformationen, FUS, TDP-43, a-Synuclein sowie Vektor nu...

<ol>
	<li>Landgrave-G&#243;mez, J., Mercado-G&#243;mez, O., Guevara-Guzm&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases.">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).</li><li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis:+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era.">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li><li>Beitz, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle.">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reveal+a+&#8220;Druggable&#8221;+Rsp5/Nedd4+Network+that+Ameliorates+&#945;-Synuclein+Toxicity+in+Neurons.">Yeast Reveal a &#8220;Druggable&#8221; Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates &#945;-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979 (2013).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li><li>Flick, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson&#8217;s+disease:+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions.">Epigenetic approach to early-onset Parkinson&#8217;s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li><li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Modifications+of+the+&#945;-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects.">Epigenetic Modifications of the &#945;-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine einfache, sinnvolle und kostengünstige Möglichkeit kategorisieren genomweite Histon PTM Veränderungen korreliert mit Neurodegenerative Proteinopathies. Zwar gibt es andere Modelle ALS auch PD, z. B. in-vitro- humanen Zelllinien und Murine Modelle32, S. Cerevisiae bleibt attraktiv wegen seiner einfachen Handhabung. Zum Beispiel Hefe Modelle benötigen keine Verwendung von sterilen Kapuze, noch benötigen sie das Intensive training, da...

Neurodegenerative Krankheiten sind verheerende Krankheiten mit wenig bis keine Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung. Unter diesen sind die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und der Parkinson-Krankheit (PD) besonders schrecklich. Etwa 90 % der Fälle ALS und PD gelten nur sporadisch, auftritt ohne Familiengeschichte der Krankheit, während die übrigen Fälle in der Familie und sind in der Regel auf ein bestimmtes Gen Mutation1,2verbunden. Interessanterweise sind beide dieser Krankheiten verbunden mit Protein Mislocalization und Aggregation3,4,5,6. Zum Beispiel in Sarkom (FUS) verschmolzen und TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43) sind RNA-bindende Proteine, die mislocalize, Zytoplasma und aggregieren ALS7,8,9,10, 11,12, während α-Synuclein das Prinzip Komponente proteinhaltige Aggregate Lewy-Körper in PD5,13,14,15bezeichnet.
Trotz der umfangreichen genomweite Bemühungen in großen Patientenkollektiven sind die überwiegende Mehrheit der Fälle ALS und PD genetisch ungeklärt. Kann Epigenetik Neurodegenerative Erkrankung eine Rolle? Epigenetik umfasst Änderungen im Genausdruck auftritt ohne Änderungen auf zugrunde liegende DNA-Sequenz16. Ein wichtigste epigenetischer Mechanismus beinhaltet die post-translationalen Modifikationen (PTMs) Histon-Proteine-16. In eukaryotischen Zellen ist genetisches Material in Chromatin fest gewickelt. Die Basiseinheit von Chromatin ist das Nukleosom, bestehend aus 146 Basenpaare der DNA umwickelt ein Histon-Octamer, bestehend aus vier Paare von Histonen (jeweils zwei Kopien der Histone H2A, H2B, H3 und H4)17. Jedes Histon hat eine N-terminale Endstück, das ragt aus dem Nukleosom und kann durch die Zugabe von verschiedenen chemischen Moieties, in der Regel auf Lysin und Arginin Rückstände18geändert werden. Diese PTMs sind dynamisch, d.h. sie können leicht hinzugefügt und entfernt und gehören Gruppen wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung. PTMs die Zugänglichkeit der DNA auf die transkriptionelle Maschinen zu kontrollieren, und damit Kontrolle gen Ausdruck18. Z. B. Histon Acetylierung verringert die Festigkeit der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen dem stark grundlegende Histon Protein und negativ geladenen DNA Rückgrat, so dass die Gene verpackt durch acetylierte Histone mehr zugänglich zu machen und damit hoch 19ausgedrückt. Vor kurzem hat die bemerkenswerte biologische Besonderheit des bestimmten Histon PTMs und deren Kombinationen führten zu die Histon-Code-Hypothese20,21 in welche Proteine, die schreiben, löschen und lesen Histon PTMs alle an einem Strang zu ziehen Genexpression zu modulieren.
Hefe ist ein sehr nützliches Modell Neurodegeneration zu studieren. Wichtig ist, sind viele neuronale zelluläre Signalwege von Hefe zu Menschen22,23,24konserviert. Hefe rekapitulieren Zytotoxizität Phänotypen und Protein Einschlüsse bei Überexpression von FUS, TDP-43 oder α-Synuclein22,23,24,25,26. In der Tat wurden Saccharomyces Cerevisiae Modelle Alsen zur genetischen Risikofaktoren im Menschen27zu identifizieren. Darüber hinaus Hefe-überexprimierenden menschlichen α-Synuclein erlaubt für die Charakterisierung des Rsp5-Netzwerks als druggable Ziel, α-Synuclein Toxizität in Neuronen28,29zu verbessern.
Hier beschreiben wir ein Protokoll Nutzung von Saccharomyces Cerevisiae um genomweite Histon PTM Veränderungen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Proteinopathies (Abbildung 1) zu erkennen. Die Verwendung von S. Cerevisiae ist höchst attraktiv wegen seiner Mühelosigkeit, niedrige Kosten und Geschwindigkeit im Vergleich zu anderen in-vitro- und tierischen Modellen der Neurodegeneration. Nutzung der zuvor entwickelten ALS auch PD Modelle22,23,25,26, wir haben überexprimiert menschlichen FUS, TDP-43 und α-Synuclein in Hefe und ungedeckten unterschiedliche Histon PTM Veränderungen in Verbindung mit jedem Proteinopathy30. Das Protokoll, die wir hier beschreiben, kann in weniger als zwei Wochen von Transformation zur Datenanalyse abgeschlossen werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>-His DO Supplement</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Polyacrylamide Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>07-353 (Lot No. 2762291)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109463 (Lot No. GR187780)</td>
			<td>Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab46983 (Lot No. GR71882)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td>
			<td>Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate, 96 well</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td>
			<td>Dilution: 1/2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blot paper (filter paper)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare 50 % w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL Transfer Membranes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td>Prepare a 1 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>102855-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe I Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>101228-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-ccdB</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303Gal-FUS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>29614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-TDP-43</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td>Prepare a 50% w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504</td>
			<td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Prepare 10% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>201190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGal-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Prepare 0.2 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 303 S. cerevisiae yeast</td>
			<td>Gift from J. Shorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models

Neurodegenerative Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und der Parkinson-Krankheit (PD), verursachen den Verlust von Hunderten von Tausenden von Menschenleben pro Jahr. Es fehlen wirksame Behandlungsmöglichkeiten in der Lage, das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen. Trotz der umfangreichen Sequenzierung Bemühungen in großen Patientenkollektiven sind zum Großteil ALS auch PD durch eine genetische Mutation allein ungeklärt. Epigenetik-Mechanismen, wie die Post-translationale Modifikation der Histonproteine, können bei neurodegenerativen Krankheit Ätiologie und Progression einbezogen werden und führen zu neuen Zielen für pharmazeutische Intervention. Säugetieren in vivo und in vitro-Modelle ALS auch PD sind teuer und erfordern oft langen und mühsamen experimentelle Protokolle. Hier beschreiben wir einen praktische, schnellen und kostengünstigen Ansatz zur Bestimmung der genomweiten Veränderungen in Histon Modifikation Ebenen mit Saccharomyces Cerevisiae als Modellsystem. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Untersuchungen in epigenetische Veränderungen verbunden, Neurodegenerative Proteinopathies, die bisherigen Ergebnisse in verschiedenen Modellsysteme bestätigen, während deutlich erweitern unser Wissen der Neurodegenerative Krankheit Epigenom.

Um diese Methode zu veranschaulichen, werden wir vor kurzem veröffentlichten Ergebnisse30nutzen. WT menschlichen FUS und TDP-43 wurden für 5 h überexprimiert, während für 8 h WT α-Synuclein überexprimiert wurde. Ein CcdB Konstrukt wurde als Vektor Negativkontrolle verwendet. Abbildung 2 zeigt Wachstum Unterdrückung in festen und flüssigen Kulturen. Hefe wurde geerntet, wie beschrieben und westliche Beflecken mit Modifikation-s...

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Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren zur Charakterisierung von genomweiten Änderungen in der Höhe von Histon post-translationalen Modifikationen (PTM) in Verbindung mit der Überexpression der Proteine zugeordnet ALS und Parkinson in auftretenden Saccharomyces Cerevisiae Modelle. Nach der Trennung der SDS-PAGE werden einzelne Histon PTM Ebenen mit Modifikation-spezifische Antikörper über Western blotting erkannt.

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die epigenetischen Merkmale neurodegenerativer Erkrankungen leicht zu erforschen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Hefe als Modellsystem ausnutzt, im Vergleich zu anderen zellulären und tierischen Modellen neurodegenerativer Erkrankungen, Hefe ist zweckmäßig und kosteneffizient. Diese Technik ermöglicht es uns, die epigenetischen Veränderungen zu kartieren, die bei neurodegenerativen Erkrankungen auftreten, was zu neuen Markern für die Diagnose führen kann, sowie neue Therapieziele.Diese Methode ermöglicht eine weitere Untersuchung der Rolle epigenetischer Markierungen bei neurodegenerativen Erkrankungen und kann für die Beurteilung menschlicher Fibroblasten und induzierter pluripotenter Stammzellen modifiziert werden. Diese spezielle Methode enthält eine Reihe von Details, die visuell demonstriert werden müssen, wie z. B. die ordnungsgemäße Beladung des westlichen Blot-Geräts. Demonstriert wird das Verfahren von Michel Fallah und Navin Rana, beide Forscher im Torrente-Labor.Beginnen Sie mit der Umsalzung der Hefe aus gefrorenen Glycerinvorräten auf Histidin 2%Glucose-Agar-selektive mittelplatte, für eine zwei- bis dreitägige Inkubation bei 30 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation, inoculate restreaked Hefe für jede Über-Ausdrucksmodell und Kontrolle in fünf Milliliter von Histidin selektive flüssige Medium. Ergänzt mit 2%raffinose bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute, über Nacht.Am nächsten Morgen wachsen 100 Milliliter flüssige Kultur für jedes der Überexpressionsmodelle und Kontrollen in selektiven Medien, die über Nacht mit 2% Galaktose ergänzt werden. Und messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD600, um das Volumen der Nachtkultur zu bestimmen, das benötigt wird, um über Ausdruckskulturen bei einem beginnenden OD600 von 0,3 zu rendern. Um eine Proteinüberexpression zu induzieren, wachsen Sie die Hefe auf Galaktosemedium mit Schütteln bei 30 Grad Celsius für den entsprechenden experimentellen Zeitraum.Messen Sie dann die OD600 jeder Kultur am Ende der Induktionsperiode. Und standardisieren Sie alle Zellenanzahlen auf den niedrigsten OD600-Wert. Die Kulturen in 50 Milliliter Zentrifugenrohren durch Zentrifugieren ernten und die Pellets in einem Milliliter sterilem Stillwasser für jeden 10 Milliliter Kulturanbau wieder aufhängen.Aliquot einen Milliliter Zellresuspension in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen für eine zusätzliche Zentrifugation und Aspirat der Übersprecher. Dann schnappen Sie die Zellpellets in flüssigem Stickstoff für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Zellen für die Western-Blot-Analyse zu lysieren, tauen Sie die Hefezellpellets auf Eis auf, bevor Sie in 100 Mikroliter destilliertem Wasser wieder aufsuspensionen.Fügen Sie 300 Mikroliter 0,2-molares Natriumhydroxid und 20 Mikroliter 2-Mercaptoethanol zu jeder Zellprobe hinzu. Und die Pellets durch Pipettieren wieder aussetzen. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis die Zellen durch Zentrifugieren pellet und die Proben in 100 Mikroliter Naderfarbstoff wieder aufsetzen.Dann kochen Sie die Proben für 10 Minuten auf einem Heizblock. Während die Proben lysiert werden, legen Sie zwei Gele in einen Gelhalter und füllen Sie die Innenkammer nach oben mit Laufpuffer und die Außenkammer bis zur Zwei-Gel-Linienmarkierung. Wenn die Proben fertig sind, laden Sie jeweils 15 Mikroliter, Zelllyselösung, in jeden Brunnen des 10 Brunnens, 12% Polyacrylamid-Gel und fügen Sie fünf Mikroliter Proteinleiter in die Proteinleiter Lane gut.Führen Sie das Gel ca. 45 Minuten bei 150 Volt oder bis die Ladefarbe vorne den Boden des Gels erreicht. Während das Gel läuft, tränken Sie zwei Faserpads pro Gel im Transferpuffer und eine Polyvinylidenfluorid, oder PVDF, Membran pro Gel in Methanol. Wenn das Gel fertig ist, spülen Sie die Membran im Transferpuffer aus und legen Sie ein vorgetränktes Faserpad auf den Boden einer halbtrockenen Transfergerätezelle.Gefolgt von der PVDF-Membran, dem Gel und dem zweiten vorgetränkten Faserpad. Stellen Sie dann die Leistung für eine Stunde auf 150 Milliampere ein. Am Ende des Proteintransfers die Membran aus dem Transfergerät für eine kurze Spülung mit destilliertem Wasser entfernen.Legen Sie die abspülte Membran, Die Proteinseite in eine kleine Färbebox und bedecken Sie die Membran mit tris-gepufferter Kochsalzlösung oder TBS, wobei der Puffer für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur mit sanftem Schaukeln blockiert wird. Am Ende der blockierenden Inkubation die Membran über Nacht mit einem Anti-Hefe-Histon und modifikationsspezifischem Antikörper in TBS bei vier Grad Celsius inkubieren. Und ein richtiger Kernladekontroll-Antikörper.Am nächsten Morgen die Membran viermal in TBS waschen, ergänzt mit 0,1%Polysorbat 20 für fünf Minuten mit Schaukeln bei Raumtemperatur pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche den Blot mit den entsprechenden Sekundärantikörpern für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Es folgten vier, fünfminütige Wätsche in TBST und eine fünfminütige Wäsche allein in TBS mit Schaukeln.Dann stellen Sie den Fleck auf einem fluoreszierenden Western Blot Imaginierungssystem für zwei Minuten. Hierzeigt sich die Wachstumsunterdrückung in festen und flüssigen Kulturen mit signifikanten Auswirkungen auf das Hefewachstum, die in Gegenwart von Galaktose-infundiert in Sarkom-Überexpressionsmodellen beobachtet werden. Eine signifikante Abnahme der Histonspiegel sind in der im Sarkom-Überexpression-Modell verschmolzenen Und signifikante Erhöhungen der Histonacetylierung im TAR-Bindungsprotein 43-Überexpression-Modell sind beobachtet, die weder im In-Sarkom- als auch beim Alpha-Synuclein-Überexpressionsmodell zu sehen sind.Es gibt auch signifikante Abnahmen der Histonspiegel im Alpha-Synuclein-Überexpression-Modell. In diesem Saccharose-Tuning-Experiment, je geringer die Menge an Galaktose verwendet, um in Sarkat-Überexpression verschmolzen zu induzieren, die geringere Toxizität, die sowohl in fester als auch in flüssiger Kultur beobachtet wird. Wichtig ist, je niedriger der Grad der Verschmelzung in Sarkom-Überexpression, desto kleiner ist die Größe der Verringerung der Histonspiegel.Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es unerlässlich, die Hefemenge in jeder Probe zu standardisieren, um einen korrekten Vergleich in den Ebenen der posttranslationalen Änderung zu ermöglichen. 2-Mercaptoethanol sollte unter einer Haube verwendet werden, um einEinatmen zu vermeiden. Wenn Ponceau Fleck verwendet wird, muss es richtig entsorgt werden.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Eine schnelle und Quantitative Methode für Post-translationale Modifikation und Variante aktiviert Mapping von Peptiden mit Genomen

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...