Name: characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

אנו מודים Royena Tanaz הודא יוסוף, סדיקא Taasen על עזרה טכנית. . אנחנו מאוד אסירי פרופסור ג'יימס שורטר למתן נדיב ריאגנטים, סיוע רוחני בעיצוב של ניסויים כוונון סוכרוז. שמרים פלסמידים היו מתנה נדיבה של פרופסור אהרון גיטלר (כולל גל 303-FUS; Addgene פלסמיד # 29614). ברוקלין קולג, מרכז מחקר מדעי מתקדם (יופי), כמו גם NIH NINDS מתקדם פוסט-דוקטורט המעבר פרס (K22NS09131401) תמיכה M.P.T.

1. שינוי צורה של cerevisiae ס עם בונה חלבונים הקשורים proteinopathy ניווניות
<ol><li>לצמוח פראי סוג (WT) 303 שמרים, שמרים תמצית peptone מרק דקסטרוז (YPD) בין לילה עם טלטול (200 סל ד) ב- 30 ° C.</li>
	<li>לאחר 12−16 h של צמיחה, לדלל שמרים צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 0.25 עם YPD. כמו 10 מ"ל של תרבות נוזלי שמרים יהיה צורך לשינו...

<ol>
	<li>Landgrave-G&#243;mez, J., Mercado-G&#243;mez, O., Guevara-Guzm&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases.">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).</li><li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis:+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era.">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li><li>Beitz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease:+a+Review.">Parkinson's Disease: a Review.</a> Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS.">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes.">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li><li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS/TLS+in+ALS+and+beyond.">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li><li>King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tip+of+the+iceberg:+RNA-binding+proteins+with+prion-like+domains+in+neurodegenerative+disease.">The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease.</a> Brain Research. 1462, 61-80 (2012).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations.">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson's+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies.">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).</li><li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+parkinson's+disease:+dopamine,+vesicles+and+&#945;-synuclein.">Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and &#945;-synuclein.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).</li><li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle.">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 &#197; resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+concepts+of+epigenetics.">Basic concepts of epigenetics.</a> Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory.">Histone acetylation and transcriptional regulatory.</a> Genes &amp; Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Sanchez, Y., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP104+required+for+induced+thermotolerance.">HSP104 required for induced thermotolerance.</a> Science. 248 (4959), 1112 (1990).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772 (2003).</li><li>Johnson, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+Is+Intrinsically+Aggregation-prone,+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis-linked+Mutations+Accelerate+Aggregation+and+Increase+Toxicity.">TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+&#945;-synuclein.">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human &#945;-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reveal+a+&#8220;Druggable&#8221;+Rsp5/Nedd4+Network+that+Ameliorates+&#945;-Synuclein+Toxicity+in+Neurons.">Yeast Reveal a &#8220;Druggable&#8221; Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates &#945;-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979 (2013).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li><li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).</li><li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models.">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).</li><li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models.">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li><li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+sequestration+of+FUS/TLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1.">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li><li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+(ALS)+Causing+Genes.">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li><li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson&#8217;s+disease:+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions.">Epigenetic approach to early-onset Parkinson&#8217;s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li><li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Modifications+of+the+&#945;-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects.">Epigenetic Modifications of the &#945;-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן מספק דרך פשוטה, מועיל וחסכונית לסיווג שינויים PTM הגנום כולו היסטון בקורלציה עם proteinopathies ניווניות. אמנם ישנם דגמים אחרים של ALS ו PD, כגון במבחנה שורות תאים אנושיים, מאתר מודלים32, cerevisiae ס נותר אטרקטיבי בשל קלות השימוש. למשל, שמרים דגמים שאינם מצריכים ?...

מחלות ניווניות הן מחלות הרסנית עם מעט אין אפשרויות טיפול הזמינות. בין אלה, נוירודגנרטיביות (ALS), מחלת פרקינסון (PD) הם נורא במיוחד. כ- 90% מהמקרים ALS ו PD נחשבים לא סדיר, המתרחשים ללא היסטוריה משפחתית של המחלה, ואילו שאר המקרים בתורשה בדרך כלל מקושרות גנים ספציפיים מוטציה1,2. מעניין, שתי המחלות האלה קשורים עם חלבון mislocalization, צבירת3,4,5,6. למשל, התמזגו בסרקומה (FUS) ו DNA זפת מחייב חלבון 43 (TDP-43) הם חלבונים איגוד ה-RNA mislocalize אל הציטופלסמה, צבירה ב- ALS7,8,9,10, 11,12, בעוד α-synuclein הוא המרכיב עיקרון של אגרגטים proteinaceous כינה גופיפי PD5,13,14,15.
למרות המאמצים האגודה הגנום כולו מקיף אוכלוסיות מטופלים גדולים, רובם המכריע של המקרים ALS ו PD להישאר בלתי מוסברת גנטית. אפיגנטיקה יכול לשחק תפקיד במחלות ניווניות? אפיגנטיקה כוללת שינויים בביטוי הגנים המתרחשים ללא שינוי רצף ה-DNA כבסיס16. מנגנון epigenetic העיקרי כרוך השינויים translational פוסט (PTMs) של חלבוני היסטון16. התאים האיקריוטים, חומר גנטי הוא עטוף בחוזקה לתוך כרומטין. יחידת הבסיס של כרומטין הוא נוקלאוזום, המורכב 146 בסיסי זוגות של DNA סביב octamer היסטון, המורכב ארבעה זוגות של שינויים היסטוניים (שני עותקים לכל של שינויים היסטוניים H2A, ויזת עבודה H2B, H3 ו- H4)17. כל היסטון יש מעקב של N-מסוף בולט החוצה נוקלאוזום ולא ניתן לשנות על ידי התוספת של moieties כימיים שונים, בדרך כלל על שאריות של ליזין וארגינין-18. PTMs אלה הם דינאמיים, כלומר ניתן בקלות להוסיף, להסיר והם כוללים קבוצות כגון acetylation, מתילציה זירחון. PTMs לשלוט הנגישות של ה-DNA מכונות תעתיק, ובכך לסייע בקרת גנים ביטוי18. לדוגמה, acetylation היסטון מפחיתה את עוצמת האינטראקציה אלקטרוסטטית בין החלבון היסטון מאוד בסיסי עמוד השדרה ה-DNA טעונים שלילית, המאפשר את הגנים ארוז על ידי שינויים היסטוניים acetylated להיות נגיש יותר ובכך מאוד הביע19. לאחרונה, יחודיות ביולוגית יוצאת דופן של היסטון מסוים PTMs ושילובים שלהם הוביל היסטון קוד ההנחה20,21 ב אילו חלבונים זה לכתוב, למחוק, ולקרוא PTMs היסטון נפעל כדי לווסת את ביטוי גנים.
שמרים הוא מודל שימושי מאוד ללמוד הקשורים ניוון מוחיים. חשוב, משעולים הסלולר עצביים רבים נשמרים מן שמרים-בני22,23,24. שמרים מסכם את הדברים cytotoxicity פנוטיפים ואת החלבון הכללות על ביטוי של FUS, TDP-43 או α-synuclein22,23,24,25,26. למעשה, האפייה מודלים של ALS שימשו לזיהוי גורמי סיכון גנטיים בני27. יתר על כן, שמרים overexpressing האנושי α-synuclein מותרת עבור אפיון הרשת Rsp5 כמטרה druggable דהוא α-synuclein רעילות נוירונים28,29.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ניצול האפייה כדי לזהות שינויים PTM הגנום כולו היסטון המשויך ניווניות proteinopathies (איור 1). השימוש של cerevisiae ס הוא אטרקטיבי ביותר בשל קלות השימוש, עלות נמוכה, ומהירות לעומת דגמים אחרים במבחנה ובבעלי של הקשורים ניוון מוחיים. רתימת קודם לכן פיתחה ALS ו PD מודלים22,23,25,26, לנו יש overexpressed האנושי FUS, TDP-43 וα-synuclein שמרים, חשפו היסטון ברורים PTM שינויים המתרחשים חיבור עם כל proteinopathy30. פרוטוקול זה נתאר כאן יכולה להסתיים בתוך פחות משבועיים של טרנספורמציה כדי ניתוח נתונים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>-His DO Supplement</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Polyacrylamide Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>07-353 (Lot No. 2762291)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109463 (Lot No. GR187780)</td>
			<td>Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab46983 (Lot No. GR71882)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td>
			<td>Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate, 96 well</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td>
			<td>Dilution: 1/2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blot paper (filter paper)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare 50 % w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL Transfer Membranes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td>Prepare a 1 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>102855-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe I Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>101228-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-ccdB</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303Gal-FUS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>29614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-TDP-43</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td>Prepare a 50% w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504</td>
			<td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Prepare 10% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>201190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGal-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Prepare 0.2 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 303 S. cerevisiae yeast</td>
			<td>Gift from J. Shorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models

מחלות ניווניות, כגון נוירודגנרטיביות (ALS), מחלת פרקינסון (PD), לגרום לאובדן של מאות אלפי אנשים בכל שנה. אפשרויות טיפול יעיל מסוגל לעצור את התקדמות המחלה חסרים. למרות המאמצים רצף נרחב באוכלוסיות גדולות החולה, ברוב המקרים ALS ו PD להישאר בלתי מוסברת על ידי מוטציות גנטיות לבד. מנגנוני אפיגנטיקה, כגון שינוי post-translational של חלבוני היסטון, עשויים להיות מעורבים אטיולוגיה מחלות ניווניות והתקדמות ולהוביל מטרות חדשות להתערבות התרופות. אין ויוו בתרבית של דגמים במבחנה של ALS ו PD יקרות ולעיתים קרובות דורשים זמן ממושך ולא מייגעת פרוטוקולים ניסיוני. כאן, אנחנו חלוקה לרמות בגישה מעשית, מהירה וחסכונית לקביעת הגנום כולו שינויים ברמות שינוי היסטון באמצעות האפייה כמו מערכת מודל. פרוטוקול זה מאפשר מקיף חקירות שינויים epigenetic מחובר proteinopathies ניווניות המאששים ממצאים קודמים במערכות מודל שונה תוך הרחבת הידע שלנו באופן משמעותי epigenome מחלות ניווניות.

כדי להסביר שיטה זו, אנו ינצלו את היתרון של התוצאות שפורסמו לאחרונה30. FUS האנושי WT, TDP-43 overexpressed היו עבור 5 שעות, בעוד WT α-synuclein היה overexpressed במשך 8 שעות. בונה ccdB שימש פקד שלילי וקטור. איור 2 מציג את דיכוי צמיחה בתרבויות הנוזלית. שמרים היה נקצרו כמתואר, ס...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

פרוטוקול זה מתווה נהלים ניסיוני לאפיון הגנום כולו לשינויים ברמות של היסטון post-translational שינויים (PTM) המתרחשים בהקשר ביטוי של חלבונים הקשורים ALS מחלת פרקינסון ב מודלים האפייה . לאחר ההפרדה מרחביות-דף, רמות PTM היסטון בודדים מזוהים עם נוגדנים ספציפיים שינוי באמצעות סופג המערבי.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור בקלות את התכונות האפיגנטיות של מחלה נוירודגנרטיבית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מנצלת שמרים כמערכת מודל, בהשוואה למודלים תאיים ובעלי חיים אחרים של מחלה נוירודגנרטיבית, שמרים הוא יעיל וחסכוני. טכניקה זו מאפשרת לנו למפות את השינויים האפיגנטיים המתעוררים במחלה נוירודגנרטיבית, אשר עשוי להוביל סמנים חדשים לאבחון, כמו גם מטרות חדשות לטיפול.שיטה זו מאפשרת חקירה נוספת של תפקידם של סימנים אפיגנטיים במחלות ניווניות ו ניתן לשנותה להערכת פיברובלסטים אנושיים ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים. שיטה מסוימת זו מכילה מספר פרטים שיש להדגים חזותית, כגון טעינה נכונה של מנגנון הכתם המערבי. הדגימו את ההליך יהיו מישל פלאח ונבין ראנה, שניהם חוקרים לתואר ראשון במעבדת טורנטה.התחל על ידי restreaking שמרים ממניות גליצרול קפוא על היסטידין 2% גלוקוז אגר צלחות בינוניות סלקטיבית, עבור דגירה יומיים עד שלושה ימים ב 30 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לחסן שמרים restreaked עבור כל מודל ביטוי ושליטה בחמישה מיליליטר של מדיום נוזלי סלקטיבי היסטידין. בתוספת של 2% ב-30 מעלות צלזיוס ו-200 סיבובים בדקה, למשך הלילה.למחרת בבוקר, לגדל 100 מיליליטר של תרבות נוזלית עבור כל אחד מודלים overexpression ובקרות מדיומים סלקטיביים בתוספת 2% גלקטוז לילה. ולמדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר או OD600 כדי לקבוע את נפח תרבות הלילה הדרושה כדי לעבד מעל תרבויות ביטוי ב OD600 ההתחלה של 0.3. כדי לגרום ללחץ יתר של חלבון, לגדל את השמרים על מדיום גלקטוז עם רועד ב 30 מעלות צלזיוס לתקופת הזמן הניסיונית המתאימה.לאחר מכן למדוד את OD600 של כל תרבות בסוף תקופת אינדוקציה. ותקן את כל ספירת התאים לערך OD600 הנמוך ביותר. לקצור את התרבויות ב 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר על ידי צנטריפוגה ו resuspend כדורי במיליליטר אחד של מים סטריליים סטילס עבור כל 10 מיליליטר של תרבות גדל.Aliquot מיליליטר אחד של שימוש חוזר בתא לתוך צינורות microcentrifuge בודדים עבור צנטריפוגה נוספת לשאוף את supernatants. ואז הצמד להקפיא את כדורי התא בחנקן נוזלי לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי ללטף את התאים לניתוח כתם מערבי, להפשיר את כדורי תא השמרים על קרח לפני ההתכוונות ב 100 microliters של מים מזוקקים.הוסף 300 microliters של 0.2-טוחן נתרן הידרוקסיד ו 20 microliters של 2-Mercaptoethanol לכל דגימת תא. ולתלות מחדש את הכדורים על ידי צינורות. לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend את הדגימות ב 100 microliters של צבע טעינה.ואז להרתיח את הדגימות במשך 10 דקות על בלוק חימום. בזמן שהדגימות נדגמים, מניחים שני ג'לים במחזיק ג'ל וממלאים את התא הפנימי למעלה עם חיץ ריצה ואת התא החיצוני לסימן קו שני ג'ל. כאשר הדגימות מוכנות, לטעון 15 microliters כל אחד, פתרון תמיסת תא, לתוך כל באר של 10 באר, 12% פוליאקרילמיד ג'ל ולהוסיף חמישה microliters של סולם חלבון לנתיב סולם החלבון היטב.מפעילים את הג'ל כ-45 דקות ב-150 וולט או עד שהטענת צבע קדמי מגיעה לתחתית הג'ל. בזמן הג'ל פועל, להשרות שתי רפידות סיבים לכל ג'ל במאגר העברה אחד פוליווינילידין פלואוריד, או PVDF, קרום לכל ג'ל במתנול. כאשר הג'ל מוכן, יש לשטוף את הממברנה במאגר ההעברה ולהציב כרית סיבים אחת על תחתית תא מנגנון העברה יבש למחצה.ואחריו קרום PVDF, הג'ל ו כרית הסיבים השנייה. ואז להגדיר את הכוח ל150 מיליאמפר לשעה אחת. בסוף העברת החלבון, מוציאים את הממברנה ממנגנוני ההעברה לשטיפה קצרה במים מזוקקים.מניחים את הממברנה שטוף, צד חלבון למעלה בקופסת כתמים קטנה לכסות את הממברנה עם מלוחים טריס-buffered או TBS, חסימת חיץ עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה. בסוף הדגירה החוסמת, הדגירה את הממברנה לילה עם היסטון אנטי שמרים ונוגדן ספציפי לשינוי ב- TBS בארבע מעלות צלזיוס. ונוגדן בקרת טעינה גרעינית ראוי.למחרת בבוקר, לשטוף את הממברנה ארבע פעמים ב TBS, בתוספת 0.1% polysorbate 20 במשך חמש דקות עם נדנדה בטמפרטורת החדר לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, הדגירה את הכתם עם הנוגדנים המשניים המתאימים במשך שעה בטמפרטורת החדר. ואחריו ארבע, חמש דקות שוטף ב TBST ואחד חמש דקות לשטוף ב- TBS לבד עם נדנדה.ואז לדמיין את הכתם על מערכת כתמים מערבית פלואורסצנטיים לדמיין במשך שתי דקות. כאן, דיכוי צמיחה בתרבויות מוצקות ונוזליות מוצג עם השפעות משמעותיות על צמיחת שמרים שנצפו בנוכחות גלקטוז חדורים במודלים של לחץ יתר של סרקומה. ירידה משמעותית ברמות היסטון ניכרים במודל התמזגות בסרקומה overexpression ועליות משמעותיות ברמות של אצטילציה היסטון במודל 43 חלבון מחייב TAR overexpression, נצפו כי אינם נראים גם התמזגו סרקומה או אלפא סינוקליין מודל לחץ יתר.יש גם ירידות משמעותיות ברמות ההיסטון במודל הדיכוי המודח של אלפא סינוקליין. בניסוי זה של כוונון סוכרוז, כך כמות הגלקטוז המשמשת להעשרת סרקומה נמוכה יותר, כך הרעילות הנמוכה יותר נצפית הן בתרבות המוצקה והן בתרבות הנוזלית. חשוב לציין, ככל שרמת ההתמזגות בלחץ יתר של סרקומה נמוכה יותר, כך גודל הירידה ברמות היסטון קטן יותר.בעת ביצוע פרוטוקול זה, חובה לתקנן את כמות השמרים בכל מדגם כדי לאפשר השוואה נאותה ברמות של שינוי היסטון לאחר התרגום. 2-Mercaptoethanol יש להשתמש מתחת למכסה המנוע כדי למנוע שאיפה. אם נעשה שימוש בכתם פונסאו, יש להשליך אותו כראוי.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

שיטה כמותית ומהירה השינוי Post-translational וגרסא מופעלת מיפוי של פפטידים כדי הגנום

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...