Name: characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Ringraziamo Royena Tanaz, Huda Yousuf e Sadiqa Taasen per assistenza tecnica. Siamo molto grati al Prof James Shorter per la generosa fornitura di reagenti e intellettuale assistenza nella progettazione di esperimenti di ottimizzazione di saccarosio. Plasmidi di lievito sono stati un dono generoso da Prof. ssa Aaron Gitler (tra cui 303Gal-FUS; Plasmide Addgene # 29614). Brooklyn College e il centro di ricerca scienza avanzata (CUNY), nonché un NIH NINDS Postdoctoral transizione premio Advanced (K22NS09131401) supportato M.P.T.

1. trasformare S. cerevisiae con costrutti di proteina associata proteinopathy neurodegenerative
<ol><li>Crescere il lievito 303 wild type (WT) in brodo di lievito estratto peptone destrosio (YPD) pernottamento con agitazione (200 giri/min) a 30 ° C.</li>
	<li>Dopo 12−16 h di crescita, diluire il lievito a densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,25 con YPD. Come 10 mL di coltura liquida lievito saranno necessari per ogni trasformazione, preparare 50 mL di coltura liquida lievito per cinque trasform...

<ol>
	<li>Landgrave-G&#243;mez, J., Mercado-G&#243;mez, O., Guevara-Guzm&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases.">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).</li><li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis:+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era.">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li><li>Beitz, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS.">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes.">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li><li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS/TLS+in+ALS+and+beyond.">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li><li>King, O. D., Gitler, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle.">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+&#945;-synuclein.">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human &#945;-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reveal+a+&#8220;Druggable&#8221;+Rsp5/Nedd4+Network+that+Ameliorates+&#945;-Synuclein+Toxicity+in+Neurons.">Yeast Reveal a &#8220;Druggable&#8221; Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates &#945;-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979 (2013).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li><li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).</li><li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models.">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).</li><li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models.">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li><li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+sequestration+of+FUS/TLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1.">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li><li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+(ALS)+Causing+Genes.">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li><li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson&#8217;s+disease:+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions.">Epigenetic approach to early-onset Parkinson&#8217;s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li><li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Modifications+of+the+&#945;-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects.">Epigenetic Modifications of the &#945;-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).</li></ol>

Il protocollo descritto qui fornisce un modo semplice, conveniente e redditizio di categorizzare i cambiamenti PTM istone genoma correlati con proteinopathies neurodegenerative. Mentre ci sono altri modelli di ALS e PD, come in vitro murino e linee cellulari umane modelli32, S. cerevisiae rimane attraente per la sua facilità d'uso. Per esempio, modelli di lievito non richiedono l'uso di una cappa sterile, né richiedono l'allenamento che intensivo va con il lavoro della coltura ...

Le malattie neurodegenerative sono malattie devastanti con poco o nessun opzioni di trattamento disponibili. Tra questi, la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e malattia di Parkinson (MDP) sono particolarmente terribile. Circa il 90% dei casi di SLA e PD sono considerati sporadici, che si verificano senza storia di famiglia della malattia, mentre i restanti casi funzionare in famiglie e sono generalmente collegati a un gene specifico mutazione1,2. Interessante, entrambe queste malattie sono associate con la proteina mislocalization e aggregazione3,4,5,6. Per esempio, fusa nel sarcoma (FUS) e proteina obbligatoria del DNA del catrame-43 (TDP-43) sono proteine che legano RNA che mislocalize nel citoplasma e aggregare in ALS7,8,9,10, 11,12, mentre α-synuclein è il componente di principio di aggregati proteici chiamati corpi di Lewy in PD5,13,14,15.
Nonostante gli sforzi di vasta associazione genome-wide in grandi popolazioni di pazienti, la stragrande maggioranza dei casi di SLA e PD rimanga inspiegabile geneticamente. Può l'epigenetica svolge un ruolo nella malattia neurodegenerative? Epigenetics comprende cambiamenti nell'espressione genica che si verificano senza cambiamenti a sottostante DNA sequenza16. Un meccanismo epigenetico principale comporta le modifiche post traduzionale (PTM) di istone proteine16. Nelle cellule eucariotiche, il materiale genetico è strettamente avvolto nella cromatina. L'unità di base della cromatina è il nucleosoma, composto da 146 paia di basi del DNA avvolto intorno un istone istonico, è composto da quattro coppie di istoni (due copie ciascuno degli istoni H2A, H2B, H3 e H4)17. Ogni istone ha una coda N-terminale che sporge fuori il nucleosoma e può essere modificato con l'aggiunta di vari moiety chimico, solitamente su di residui di lisina e arginina18. Questi PTMs sono dinamici, il che significa che possono essere facilmente aggiunti e rimossi e includere gruppi quali acetilazione, metilazione e fosforilazione. PTMs determinano l'accessibilità del DNA al macchinario trascrizionale e contribuire così controllo gene espressione18. Ad esempio, acetilazione dell'istone riduce la forza di interazione elettrostatica tra le proteine istoniche altamente basici e la spina dorsale del DNA caricata negativamente, permettendo i geni imballati da istoni acetilati di essere più accessibile e quindi altamente espresso19. Più recentemente, la notevole specificità biologica di PTMs particolare istone e loro combinazioni ha portato all'istone codice ipotesi20,21 in quali proteine che scrivere, cancellare e leggere istone PTMs tutti agiscono di concerto per modulano l'espressione genica.
Il lievito è un modello molto utile per studiare la neurodegenerazione. Soprattutto, molte vie cellulari neuronali sono conservate dal lievito per gli esseri umani22,23,24. Lievito ricapitolano citotossicità fenotipi e inclusioni di proteina all'iperespressione di FUS, TDP-43 o α-synuclein22,23,24,25,26. Infatti, i modelli di Saccharomyces cerevisiae di ALS sono stati utilizzati per identificare fattori di rischio genetici in esseri umani27. Inoltre, il lievito che overexpressing umano α-synuclein ammessi per la caratterizzazione della rete Rsp5 come bersaglio trattabili per migliorare la tossicità di α-synuclein in neuroni28,29.
Qui, descriviamo un protocollo sfruttando Saccharomyces cerevisiae per rilevare le modifiche PTM genoma istone connesse con proteinopathies neurodegenerative (Figura 1). L'uso di S. cerevisiae è molto attraente per la sua facilità d'uso, basso costo e velocità rispetto agli altri modelli in vitro ed animali di neurodegenerazione. Sfruttando precedentemente sviluppato ALS e PD modelli22,23,25,26, noi abbiamo sovraespresso umano FUS, TDP-43 e α-synuclein in lievito e scoperte distinte istone PTM trasformazioni che avvengono in connessione con ogni proteinopathy30. Il protocollo che descriviamo qui può essere completato in meno di due settimane dalla trasformazione all'analisi dei dati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>-His DO Supplement</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Polyacrylamide Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>07-353 (Lot No. 2762291)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109463 (Lot No. GR187780)</td>
			<td>Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab46983 (Lot No. GR71882)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td>
			<td>Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate, 96 well</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td>
			<td>Dilution: 1/2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blot paper (filter paper)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare 50 % w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL Transfer Membranes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td>Prepare a 1 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>102855-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe I Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>101228-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-ccdB</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303Gal-FUS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>29614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-TDP-43</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td>Prepare a 50% w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504</td>
			<td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Prepare 10% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>201190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGal-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Prepare 0.2 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 303 S. cerevisiae yeast</td>
			<td>Gift from J. Shorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models

Malattie neurodegenerative quali la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e malattia di Parkinson (MDP), causano la perdita di centinaia di migliaia di vite ogni anno. Mancano opzioni di trattamento efficace in grado di fermare la progressione di malattia. Nonostante gli sforzi di sequenziamento estesa in grandi popolazioni di pazienti, la maggior parte dei casi di SLA e PD rimanga inspiegabile mutazioni genetiche da solo. Meccanismi di Epigenetics, quali la modificazione post-traduzionale delle proteine istoniche, possono essere coinvolti nella progressione e nella eziologia di malattia neurodegenerative e portano a nuovi bersagli per l'intervento farmaceutico. Modelli di mammiferi in vivo e in vitro di ALS e PD sono costosi e richiedono spesso prolungati e laboriosi protocolli sperimentali. Qui, descriviamo un approccio pratico, veloce e conveniente per determinare alterazioni del genoma nei livelli di modifiche dell'istone usando Saccharomyces cerevisiae come sistema modello. Questo protocollo permette di complete indagini cambiamenti epigenetici collegati al proteinopathies neurodegenerative che confermano i risultati precedenti in sistemi diversi modello allargando significativamente la nostra conoscenza della neurodegenerative malattia epigenoma.

Per illustrare questo metodo, ci si avvarrà dei risultati recentemente pubblicati30. WT umano FUS e TDP-43 overexpressed per 5 h, mentre WT α-synuclein overexpressed per 8 h. Un costrutto ccdB è stato usato come controllo negativo vettoriale. La figura 2 Mostra la soppressione della crescita nelle culture di solide e liquide. Lievito è stato raccolto come descritto e Western blotting con anticorpi specifici per modifica è stata ef...

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Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Questo protocollo delinea le procedure sperimentali per caratterizzare il genoma cambiamenti nei livelli di modifiche post-traduzionali degli istoni (PTM) che si verificano in relazione la sovraespressione di proteine associate con ALS e malattia del Parkinson in Modelli di Saccharomyces cerevisiae . Dopo la separazione di SDS-PAGE, vengono rilevati livelli PTM istone individuali con gli anticorpi specifici di modifiche tramite Western blotting.

Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Questo protocollo ci permette di esplorare facilmente le caratteristiche epigenetiche della malattia neurodegenerativa. Il principale vantaggio di questa tecnica è che sfrutta il lievito come sistema modello, rispetto ad altri modelli cellulari e animali di malattia neurodegenerativa, il lievito è conveniente ed economico. Questa tecnica ci consente di mappare i cambiamenti epigenetici che sorgono nella malattia neurodegenerativa, che possono portare a nuovi marcatori per la diagnosi, così come nuovi obiettivi per la terapia.Questo metodo consente un'ulteriore indagine sul ruolo dei segni epigenetici nella malattia neurodegenerativa e può essere modificato per la valutazione dei fibroblasti umani e delle cellule staminali pluripotenti indotte. Questo particolare metodo contiene una serie di dettagli che devono essere dimostrati visivamente, come il corretto caricamento dell'apparato western blot. A dimostrare la procedura saranno Michel Fallah e Navin Rana, entrambi ricercatori universitari del laboratorio Torrente.Iniziare riposando il lievito dalle scorte di glicerolo congelato su lastre medie selettive di agar di istidina al 2%, per un'incubazione da due a tre giorni a 30 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, inoculare il lievito restreaked per ogni modello di espressione superiore e controllare in cinque millilitri di mezzo liquido selettivo di istidina. Integrato con 2%raffinose a 30 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto, durante la notte.La mattina seguente, coltivare 100 millilitri di coltura liquida per ciascuno dei modelli di sovraespressione e controlli in mezzi selettivi integrati con il 2% di galattosio durante la notte. E misurare la densità ottica a 600 nanometri o OD600 per determinare il volume della coltura notturna necessaria per rendere le colture di espressione ad un OD600 iniziale di 0,3. Per indurre l'iperespressione proteica, far crescere il lievito su un mezzo di galattosio con scuotimento a 30 gradi Celsius per l'appropriato periodo di tempo sperimentale.Quindi misurare l'OD600 di ogni cultura alla fine del periodo di induzione. E standardizzare tutti i conteggi delle celle al valore OD600 più basso. Raccogliere le colture in tubi di centrifuga da 50 millilitri per centrifugazione e rimosogliere i pellet in un millilitro di acqua sterile ancorata per ogni 10 millilitri di coltura coltivati.Aliquota un millilitro di resuspensione cellulare in singoli tubi di microcentrifugo per un'ulteriore centrifugazione e aspirare i supernaganti. Quindi agganciare congelare i pellet cellulari in azoto liquido per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per lire le cellule per l'analisi western delle macchie, scongelare il pellet di cellule di lievito sul ghiaccio prima della resuspensione in 100 microlitri di acqua distillata.Aggiungere 300 microlitri di idrossido di sodio 0,2 molare e 20 microlitri di 2-Mercaptoetanolo a ciascun campione cellulare. E rimospendare il pellet con la pipettazione. Dopo un'incubazione di 10 minuti sul ghiaccio, pellettò le cellule mediante centrifugazione e rimospendò i campioni in 100 microlitri di colorante di carico.Quindi far bollire i campioni per 10 minuti su un blocco riscaldante. Durante la lysed dei campioni, posizionare due gel in un supporto in gel e riempire la camera interna verso l'alto con il tampone di corsa e la camera esterna al segno di linea a due gel. Quando i campioni sono pronti, caricare 15 microlitri ciascuno, soluzione di lysis cellulare, in ogni pozzo del pozzo 10, gel di poliacrilammide al 12% e aggiungere bene cinque microlitri di scala proteica alla corsia della scala proteica.Eseguire il gel per circa 45 minuti a 150 volt o fino a quando il caricamento della parte anteriore del colorante raggiunge il fondo del gel. Mentre il gel è in funzione, immergere due cuscinetti in fibra per gel nel tampone di trasferimento e un fluoruro di polivinilidene, o PVDF, membrana per gel in metanolo. Quando il gel è pronto, sciacquare la membrana nel tampone di trasferimento e posizionare un cuscinetto in fibra presoaked sul fondo di una cella dell'apparato di trasferimento semi-secco.Seguito dalla membrana PVDF, dal gel e dal secondo cuscinetto in fibra presoaked. Quindi impostare la potenza su 150 milliarti per un'ora. Al termine del trasferimento proteico, rimuovere la membrana dall'apparato di trasferimento per un breve risciacquo con acqua distillata.Posizionare la membrana risciacquata, il lato proteico in una piccola scatola di colorazione e coprire la membrana con soluzione salina tris-tamponata o TBS, bloccando il buffer per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente con un dolce dondolo. Alla fine dell'incubazione di blocco, incubare la membrana durante la notte con un istono anti-lievito e anticorpi specifici per la modifica in TBS a quattro gradi Celsius. E un vero e proprio anticorpo di controllo del carico nucleare.La mattina seguente, lavare la membrana quattro volte in TBS, integrata con 0,1% polisorbato 20 per cinque minuti con dondolo a temperatura ambiente per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la macchia con gli anticorpi secondari appropriati per un'ora a temperatura ambiente. Seguito da quattro lavaggi di cinque minuti in TBST e un lavaggio di cinque minuti in TBS da solo con dondolo.Quindi immagina la macchia su un sistema di immaginazione western fluorescente per due minuti. Qui, la soppressione della crescita nelle colture solide e liquide è mostrata con effetti significativi sulla crescita del lievito osservati in presenza di galattosio infuso nei modelli di sovraespressione del sarcoma. Una significativa diminuzione dei livelli di istoni è evidente nel modello di sovraespressione del sarcoma e si osservano aumenti significativi dei livelli di acetilazione dell'istone nel modello di sovraespressione della proteina legante TAR 43 che non sono visti né nel modello di sovraespressione del sarcoma né in quello della sinuleina alfa.Ci sono anche significative diminuzioni dei livelli istoni nel modello di sovraespressione alfa sinuleina. In questo esperimento di accordatura del saccarosio, minore è la quantità di galattosio utilizzata per indurre fusa nella sovraespressione del sarcoma, minore è la tossicità che si osserva sia nella coltura solida che liquida. È importante sottolineare che più basso è il livello di sovraespressione del sarcoma, minore è la grandezza della riduzione dei livelli di istoni.Durante l'esecuzione di questo protocollo, è imperativo standardizzare la quantità di lievito in ogni campione per consentire un confronto corretto nei livelli di modifica post-traslazionale istonale. 2-Mercaptoetanolo deve essere usato sotto una cappa per evitare l'inalazione. Se viene utilizzata la macchia di Ponceau, deve essere scartata correttamente.

Research

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Genetics

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