Name: characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

技術的なヘルプ、Royena Tanaz、Huda ユーサフと Sadiqa Taasen に感謝します。試薬およびスクロース チューニング実験の設計における知的支援の寛大な提供のため教授ジェームズ ・ ショーターに非常に感謝しております。酵母プラスミドだった (; 303 Gal FUS を含む教授アーロン ワシントンからの寛大な贈り物Addgene プラスミド # 29614)。ブルックリン大学、高度の科学研究センター (CUNY)、NIH NINDS 高度なポスドク遷移賞 (K22NS09131401) は郵政省をサポート

1. 神経変性認知症予備関連タンパク質の構造と出芽酵母の変換
<ol><li>酵母エキス ペプトン ブドウ糖 (YPD) スープ 30 ° C に (200 rpm) を振動で一晩で野生型 (WT) 303 酵母を育てる</li>
	<li>12−16 成長の h 後、希釈 600 光学密度酵母 YPD で 0.25 nm (外径600)。酵母液の培養の 10 mL は、各変換に必要となる、50 mL の液体培養の酵母のネガティブ コントロールの変換と同様、FUS、TDP 43、シヌク...

<ol>
	<li>Landgrave-G&#243;mez, J., Mercado-G&#243;mez, O., Guevara-Guzm&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases.">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).</li><li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis:+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era.">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li><li>Beitz, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS.">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes.">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li><li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS/TLS+in+ALS+and+beyond.">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li><li>King, O. D., Gitler, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle.">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+Is+Intrinsically+Aggregation-prone,+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis-linked+Mutations+Accelerate+Aggregation+and+Increase+Toxicity.">TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+&#945;-synuclein.">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human &#945;-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reveal+a+&#8220;Druggable&#8221;+Rsp5/Nedd4+Network+that+Ameliorates+&#945;-Synuclein+Toxicity+in+Neurons.">Yeast Reveal a &#8220;Druggable&#8221; Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates &#945;-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979 (2013).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li><li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).</li><li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models.">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).</li><li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models.">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li><li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+sequestration+of+FUS/TLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1.">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li><li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+(ALS)+Causing+Genes.">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li><li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson&#8217;s+disease:+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions.">Epigenetic approach to early-onset Parkinson&#8217;s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li><li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Modifications+of+the+&#945;-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects.">Epigenetic Modifications of the &#945;-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).</li></ol>

ここで説明したプロトコルでは、神経変性の proteinopathies に関連するゲノム ヒストン PTM 変化を分類する、方便、簡単でコスト効果の高い方法を提供します。ALS は、PD の他のモデルがありますが、体外などひと細胞およびマウス モデル32、出芽酵母のままその使いやすさのために魅力的です。例えば、無菌フードの使用を必要としない酵母モデルも集中的な訓?...

神経変性疾患は、治療オプションがなしにはほとんどの壊滅的な病気です。これらのうち、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) やパーキンソン病 (PD) は特に恐ろしいです。ALS と PD 症例の約 90% は散発的な残りのケースが家族で実行、一般に特定の遺伝子変異の1,2にリンクされている疾患の家族歴なしで発生すると見なされます。興味深いことに、これらの疾患の両方はタンパク質サッカード定位誤りと集計3,4,5,6に関連付けられます。例えば、肉腫 (FUS) の融合し、43 (TDP-43) のタール DNA 結合タンパク質が RNA 結合蛋白質細胞質に mislocalize、ALS7,8,9,10、集計 11,12, α-シヌクレインは PD5,13,14,15にレビー小体と呼ばれるタンパク質の集合体の主成分。
患者集団における大規模なゲノム広い連合の努力にもかかわらず ALS と PD 症例の大多数は遺伝子説明されていなく残る。エピジェネティクスは、神経変性疾患における役割を再生できますか。エピジェネティクスは、基になる DNA シーケンス16に変更もなしで起こる遺伝子発現の変化を構成されています。主要なエピジェネティックなメカニズムには16ヒストン蛋白質の翻訳後修飾 (Ptm) が含まれます。真核生物の細胞の遺伝物質はしっかりとクロマチンにラップされます。クロマチンの基本単位は、DNA がヒストン 8 量体の周りをラップの 146 の塩基対から成る、ヌクレオソーム ヒストン (2 部各ヒストン H2A、H2B、H3、および H4)17の 4 つのペアから成るです。各ヒストンは N ターミナル尾ヌクレオソームの突き出した、リジンとアルギニン残基18上通常の様々 な化学基の付加によって変更することができます。これらの Ptm は動的なつまり、彼らは、簡単に追加することができます削除とアセチル化、メチル化、リン酸化などのグループが含まれます。Ptm は DNA の転写の機械へのアクセシビリティを制御し、制御遺伝子式18のため。たとえば、ヒストンのアセチル化は、非常に基本的なヒストン蛋白質と負荷電 DNA のバックボーン、充填よりアクセスできるアセチル化されたヒストン遺伝子を許可するとの間の静電相互作用の強さを軽減でき、高19を表明しました。最近では、特定のヒストン Ptm との組み合わせの顕著な生物学的特異性が、ヒストン コード仮説20,21どの蛋白質を書き込み、消去、およびヒストン Ptm のすべての行為にコンサートを読むにつながっています。遺伝子発現を調節します。
酵母は、神経変性疾患の研究に非常に有用なモデルです。重要なは、多くの神経細胞は、酵母から人間22,23,24に保存されます。酵母は、細胞毒性や α-シヌクレイン22,23,24,25,26や TDP-43、FUS の過剰発現タンパク質含有を要約します。実際には、ALS の酵母モデルは人間27遺伝的リスク要因を識別するために使用されています。さらに、酵母の過剰発現ヒト α シヌクレイン ニューロン28,29α シヌクレインの毒性を改善するための Rsp5 ネットワークの特性を druggable ターゲットとしての許可。
ここでは、神経変性 proteinopathies (図 1) に関連付けられているゲノム ヒストン PTM の変更を検出する酵母を利用するプロトコルについて述べる。出芽酵母の使用は、その使いやすさ、低コストと神経変性の他の in vitro および動物モデルと比較して速度のため非常に魅力的です。ALS は、PD モデル22,23,25,26を開発活用以前、我々 人間の FUS、TDP-43、および α-シヌクレイン酵母と覆いを取られた異なるヒストン PTM 変化で過剰に発現認知症予備30との接続。ここで説明されているプロトコルは、データ解析への変換から 2 週間足らずで完了ことができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>-His DO Supplement</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Polyacrylamide Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>07-353 (Lot No. 2762291)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109463 (Lot No. GR187780)</td>
			<td>Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab46983 (Lot No. GR71882)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td>
			<td>Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate, 96 well</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td>
			<td>Dilution: 1/2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blot paper (filter paper)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare 50 % w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL Transfer Membranes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td>Prepare a 1 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>102855-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe I Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>101228-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-ccdB</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303Gal-FUS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>29614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-TDP-43</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td>Prepare a 50% w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504</td>
			<td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Prepare 10% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>201190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGal-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Prepare 0.2 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 303 S. cerevisiae yeast</td>
			<td>Gift from J. Shorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models

神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) やパーキンソン病 (PD) などは、毎年の生活の何千もの何百もの損失を引き起こします。病気の進行を停止することができる効果的な治療オプションが不足しています。患者集団における広範なシーケンスの努力にもかかわらずほとんどの ALS と PD の場合単独で遺伝的変異が原因不明のまま。ヒストン蛋白質の翻訳後修飾などのエピジェネティクス機構は、神経変性疾患病因と進展に関与する可能性があり、薬学的介入のための新しいターゲットに 。ALS と PD の哺乳類の生体内および生体外モデルは高価であり、しばしば長引くと面倒な実験的プロトコルを必要とします。ここでは、我々 は出芽酵母をモデル システムとして使用してヒストン修正レベルのゲノム変化を決定する実用的な高速、かつコスト効率の高いアプローチを概説します。このプロトコルは、エピジェネティックな変化の知識を大幅に拡大している間別のモデル システムの前の調査結果を裏付ける神経変性 proteinopathies に接続されている包括的な調査、神経変性疾患エピゲノム。

このメソッドを示すためには、我々 を最近公開された結果30の利用します。WT 人間 FUS と TDP 43 はいた WT α-シヌクレインが過剰に発現して 8 時間中 5 時間過剰発現。CcdB コンストラクトは、ベクトルのネガティブ コントロールとして使用されました。図 2は、固体および液体文化で成長抑制を示しています。前述の酵母が収穫さ...

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Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

このプロトコル ヒストン翻訳後修飾 (PTM) ALS およびパーキンソン病に関連するタンパク質の過剰発現に関連して発生するレベルのゲノム変化を特徴づける実験手順の概要を説明します。出芽酵母のモデル。SDS ページの分離後個々 のヒストン翻訳後修飾レベルは西部にしみが付くことによって修飾特異抗体で検出されます。

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

このプロトコルは、神経変性疾患のエピジェネティックな特徴を容易に探求することを可能にする。この技術の主な利点は、酵母をモデルシステムとして利用し、神経変性疾患の他の細胞および動物モデルと比較して、酵母が便宜的かつコスト効率が良いということです。この技術は、診断のための新しいマーカーにつながる可能性のある神経変性疾患で生じるエピジェネティックな変化と、治療のための新しい標的をマッピングすることを可能にする。この方法は、神経変性疾患におけるエピジェネティックマークの役割のさらなる調査を可能にし、ヒト線維芽細胞および誘導多能性幹細胞の評価のために改変することができる。この特定の方法には、ウェスタンブロット装置の適切なローディングなど、視覚的に実証する必要がある多くの詳細が含まれています。この手順のデモンストレーションは、トレント研究所の学部研究者であるミシェル・ファラとナヴィン・ラナです。冷凍グリセロールストックからヒスチジン2%グルコース寒天選択的培地プレートに酵母を取り付け、摂氏30度で2〜3日間インキュベーションすることから始めます。インキュベーションの終了時に、各オーバー発現モデルに対して酵母を接種し、ヒスチジン選択的液体培地の5ミリリットルで制御する。摂氏30度で2%ラフィノース、毎分200回転、一晩で補います。翌朝、一晩で2%ガラクトースを補充した選択的培地における過剰発現モデルおよび制御のそれぞれについて、100ミリリットルの液体培養液を成長させる。そして、600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定し、0.3の開始OD600で発現培養に必要な一晩の培養量を決定します。タンパク質の過剰発現を誘導するために、ガラクトース培地上で酵母を成長させ、適切な実験期間に摂氏30度で揺れる。次に、誘導期間の終わりに各培養のOD600を測定する。そして、すべてのセルカウントを最小のOD600値に標準化します。遠心分離によって50ミリリットル遠心分離管で培養物を収穫し、成長した培養物の10ミリリットルごとに無菌スティル水の1ミリリットルでペレットを再懸濁する。アリコート1ミリリットルの細胞再懸濁液を個々のマイクロ遠心分離チューブに追加の遠心分離のために、上清を吸引する。その後、液体窒素中の細胞ペレットをマイナス80°Cで保存するためにスナップします。ウエスタンブロット分析のために細胞を解凍するには、蒸留水100マイクロリットルで再懸濁する前に、氷上の酵母細胞ペレットを解凍します。各細胞サンプルに0.2モル水酸化ナトリウム300マイクロリットルと20マイクロリットルの2-メルカプトエタノールを加えます。そして、ピペット処理によってペレットを再中断します。氷上で10分間のインキュベーションの後、遠心分離により細胞をペレット化し、100マイクロリットルの負荷染料でサンプルを再懸濁した。その後、加熱ブロックで10分間サンプルを沸騰させます。サンプルが取り付けられている間、ゲルホルダーに2つのゲルを入れ、内側のチャンバーをランニングバッファで上部に、外側のチャンバーを2ゲルラインマークに充填します。サンプルの準備ができたら、それぞれ15マイクロリットル、細胞溶解溶液を10ウェルの各ウェルに12%ポリアクリルアミドゲルにロードし、タンパク質ラダーレーンによくタンパク質ラダーの5マイクロリットルを追加します。ゲルを約45分間150ボルトで実行するか、またはローディング染料前面がゲルの底部に達するまで実行します。ゲルが動いている間に、転写バッファーにゲルあたり2つの繊維パッドを浸し、1つのポリビニリデンフッ化物、またはPVDF、1ゲルあたりの膜をメタノールに浸します。ゲルが準備ができたら、膜を転写バッファーにすい、半乾燥転写装置の下部に1つのプリ浸し繊維パッドを置く。その後PVDF膜、ゲル及び第2のプリ浸し繊維パッドが続く。その後、1時間150ミリアンペアに電力を設定します。タンパク質の移動の終了時に、蒸留水で短時間リンスするために、転写装置から膜を取り除く。すすい膜、タンパク質側を小さな染色ボックスに置き、トリスバッファー付き生理食物またはTBSで膜を覆い、緩やかな揺れで室温で1時間のインキュベーションを阻止します。ブロッキングインキュベーションの終了時に、抗酵母ヒストンと改変特異的抗体を摂氏4度でTBSで一晩インキュベートします。そして、適切な核負荷制御抗体。翌朝、膜をTBSで4回洗浄し、0.1%ポリソルベート20を5分間、洗浄ごとに室温で揺らします。最後の洗浄後、適当な二次抗体を室温で1時間インキュベートします。その後、TBSTで4分、5分間の洗浄、TBSだけで5分間の洗浄を行います。その後、蛍光ウェスタンブロットイメージングシステム上のブロットを2分間イメージングします。ここで、固体および液体培養における成長抑制は、肉腫過剰発現モデルにおいてガラクトース注入された酵母の存在下で観察される酵母の増殖に有意な影響を与えることを示している。ヒストンレベルの有意な減少は肉腫過剰発現モデルにおける融合において明らかであり、また、TAR結合タンパク質43過剰発現モデルにおけるヒストンアセチル化のレベルの有意な増加は、肉腫またはαシヌクレイン過剰発現モデルのいずれにも見られないことが観察される。αシヌクレイン過剰発現モデルのヒストンレベルにも有意な低下がある。本ショ糖チューニング実験では、肉腫過発現に融合を誘導するために用いられるガラクトースの量が少ないほど、固体培養液と液培養液の両方で観察される毒性が低くなる。重要なのは、肉腫過剰発現における融合のレベルが低いほど、ヒストンレベルの減少の大きさが小さくなる。このプロトコルを実行している間、ヒストン翻訳後修飾のレベルで適切な比較を可能にするために、各サンプル中の酵母の量を標準化することが不可欠です。2-メルカプトエタノールは、吸入を避けるためにフードの下で使用する必要があります。ポンソー染色を使用する場合は、適切に廃棄する必要があります。

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

流体の尾静脈注射を使用してマウス肝細胞の生体内で遺伝的変更の構成および誘導システム

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

翻訳後修飾とバリアントの高速、定量的な方法はペプチドのゲノムへのマッピングを有効に

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

準備とヒト以外の霊長造血幹・前駆細胞の遺伝子の改変

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...