Name: characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Vi takker Royena Tanaz, Huda Yousuf og Sadiqa Taasen for teknisk hjelp. Vi er svært takknemlig til Prof James Shorter for sjenerøs levering av reagenser og intellektuell hjelp i utformingen av sukrose tuning eksperimenter. Gjær plasmider var en sjenerøs gave fra Prof Aaron Gitler (inkludert 303Gal-Fu; Addgene plasmider # 29614). Brooklyn College og den avanserte Science Research Center (CUNY) samt en NIH NINDS avansert postdoktor overgang Award (K22NS09131401) støttet M.P.T.

1. transformere S. cerevisiae med nevrodegenerative proteinopathy-assosiert protein konstruksjoner
<ol><li>Vokse vill type (WT) 303 gjær i gjær ekstrakt pepton druesukker (YPD) buljong natten med risting (200 rpm) på 30 ° C.</li>
	<li>Etter 12−16 h vekst, fortynne gjær til en optisk tetthet på 600 nm (OD600) på 0,25 med YPD. 10 mL av gjær flytende kultur vil være nødvendig for hver transformasjon forberede 50 mL av gjær flytende kultur fem transformasjoner tilsvarer Fu, TDP-43, en synuc...

<ol>
	<li>Landgrave-G&#243;mez, J., Mercado-G&#243;mez, O., Guevara-Guzm&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases.">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).</li><li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis:+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era.">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li><li>Beitz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease:+a+Review.">Parkinson's Disease: a Review.</a> Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS.">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes.">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li><li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS/TLS+in+ALS+and+beyond.">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li><li>King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tip+of+the+iceberg:+RNA-binding+proteins+with+prion-like+domains+in+neurodegenerative+disease.">The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease.</a> Brain Research. 1462, 61-80 (2012).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations.">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson's+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies.">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).</li><li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+parkinson's+disease:+dopamine,+vesicles+and+&#945;-synuclein.">Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and &#945;-synuclein.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).</li><li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle.">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 &#197; resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+concepts+of+epigenetics.">Basic concepts of epigenetics.</a> Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory.">Histone acetylation and transcriptional regulatory.</a> Genes &amp; Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Sanchez, Y., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP104+required+for+induced+thermotolerance.">HSP104 required for induced thermotolerance.</a> Science. 248 (4959), 1112 (1990).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772 (2003).</li><li>Johnson, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+Is+Intrinsically+Aggregation-prone,+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis-linked+Mutations+Accelerate+Aggregation+and+Increase+Toxicity.">TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+&#945;-synuclein.">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human &#945;-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reveal+a+&#8220;Druggable&#8221;+Rsp5/Nedd4+Network+that+Ameliorates+&#945;-Synuclein+Toxicity+in+Neurons.">Yeast Reveal a &#8220;Druggable&#8221; Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates &#945;-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979 (2013).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li><li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).</li><li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models.">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).</li><li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models.">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li><li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+sequestration+of+FUS/TLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1.">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li><li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+(ALS)+Causing+Genes.">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li><li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson&#8217;s+disease:+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions.">Epigenetic approach to early-onset Parkinson&#8217;s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li><li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Modifications+of+the+&#945;-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects.">Epigenetic Modifications of the &#945;-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).</li></ol>

Protokollen beskrevet her gir en enkel, hensiktsmessig og kostnadseffektiv måte å kategorisere genomet hele histone PTM endringer korrelert med nevrodegenerative proteinopathies. Det finnes andre modeller av ALS og PD, som i vitro modeller humane cellelinjer og Trouble32, S. cerevisiae fortsatt attraktive på grunn av sin brukervennlighet. For eksempel gjær modeller krever ikke bruk av steril hette, eller de krever intensiv trening som går langs med celle kultur arbeid. Vider...

Nevrodegenerative sykdommer er ødeleggende sykdommer med liten eller ingen behandlingstilbud tilgjengelig. Blant disse er amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD) spesielt forferdelig. Ca 90% av ALS og PD anses sporadisk, skjer uten familiehistorie med sykdommen, mens de resterende kjøre i familier og er vanligvis knyttet til et bestemt gen mutasjon1,2. Interessant, er begge disse sykdommer assosiert med protein mislocalization og aggregering3,4,5,6. For eksempel smeltet i sarkomspesialitet (FUS) og TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) er RNA bindende proteiner som mislocalize til cytoplasma og samlet i ALS7,8,9,10, 11,12, mens α-synuclein er komponenten prinsippet av proteinaceous aggregater kalt Lewy organer i PD5,13,14,15.
Til tross for omfattende genomet hele association i store pasientgrupper forbli det overveldende flertallet av ALS og PD uforklarlig genetisk. Kan epigenetics spille en rolle i neurodegenerative sykdom? Epigenetics omfatter endringer i genuttrykk oppstår endringer i underliggende DNA sekvens16. En viktigste epigenetic mekanisme innebærer innlegg translasjonsforskning endringene (PTMs) av histone proteiner16. I eukaryote celler, er genetisk materiale tett pakket inn i chromatin. Lagerenheten chromatin er nucleosome, består av 146 base par DNA pakket rundt en histone octamer, består av fire histones (to eksemplarer hvert av histones H2A, H2B H3 og H4)17. Hver histone har en N-terminal hale som stikker ut av nucleosome og kan bli endret med tillegg av ulike kjemiske moieties, vanligvis på lysin og arginin rester18. Disse PTMs er dynamisk, som betyr at de enkelt kan legges og fjernet, og inkluderer grupper som acetylation og metylering fosforylering. PTMs kontrollere tilgjengeligheten av DNA til transcriptional maskiner, og dermed hjelpe kontroll gene expression18. For eksempel histone acetylation reduserer styrken på elektrostatisk samspillet mellom svært grunnleggende histone protein og negativt ladde DNA ryggraden, slik at genene pakket acetylated histones å være mer tilgjengelig og dermed svært uttrykt19. Flere nylig, bemerkelsesverdig biologisk spesifisiteten av bestemt histone PTMs og kombinasjoner har ført til histone koden hypotesen20,21 i som proteiner som skrive, slette og lese histone PTMs alle handle sammen slik modulere genuttrykk.
Gjær er et svært nyttig eksempel å studere neurodegeneration. Viktigere, er mange neuronal mobilnettet baner bevart fra gjær til mennesker22,23,24. Gjær recapitulate cytotoksisitet fenotyper og protein inkluderinger på overuttrykte Fu, TDP-43 eller α-synuclein,22,,23,,24,,25,,26. Faktisk har Saccharomyces cerevisiae modeller av ALS blitt brukt til å identifisere genetiske risikofaktorer i mennesker27. Videre gjær overexpressing menneskelige α-synuclein tillatt for karakterisering av Rsp5 nettverket som druggable mål å forbedre α-synuclein toksisitet i neurons28,29.
Her beskriver vi en protokoll utnytte Saccharomyces cerevisiae å oppdage genomet hele histone PTM filendringer tilknyttet nevrodegenerative proteinopathies (figur 1). Bruk av S. cerevisiae er meget attraktivt på grunn av dens lette av bruk, lave kostnader, og hastighet i forhold til andre in vitro og dyr modeller av neurodegeneration. Utnytte tidligere utviklet ALS og PD modeller22,23,25,26, vi har overexpressed menneskelige FUS TDP-43 og α-synuclein i gjær og avdekket distinkte histone PTM omveltningene i forbindelse med hver proteinopathy30. Protokollen som beskriver vi her kan gjennomføres på mindre enn to uker fra transformasjon til dataanalyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>-His DO Supplement</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Polyacrylamide Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>07-353 (Lot No. 2762291)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109463 (Lot No. GR187780)</td>
			<td>Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab46983 (Lot No. GR71882)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td>
			<td>Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate, 96 well</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td>
			<td>Dilution: 1/2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blot paper (filter paper)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare 50 % w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL Transfer Membranes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td>Prepare a 1 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>102855-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe I Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>101228-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-ccdB</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303Gal-FUS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>29614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-TDP-43</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td>Prepare a 50% w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504</td>
			<td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Prepare 10% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>201190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGal-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Prepare 0.2 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 303 S. cerevisiae yeast</td>
			<td>Gift from J. Shorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models

Nevrodegenerative sykdommer, slik som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD), føre til tap av hundretusener av liv hvert år. Effektive behandlingstilbud kunne stoppe sykdomsprogresjon mangler. Til tross for omfattende sekvensering i store pasientgrupper forbli fleste ALS og PD tilfeller uforklarlig av genetiske mutasjoner alene. Epigenetics mekanismer, som den post-translasjonell modifikasjonen av histone proteiner, kan være involvert i neurodegenerative sykdom etiologien og progresjon og føre til nye mål for farmasøytiske intervensjon. Pattedyr i vivo og in vitro modeller av ALS og PD er kostbare og ofte krever langvarig og arbeidskrevende eksperimentelle protokoller. Her skissere vi en praktisk, rask og kostnadseffektiv tilnærming til å bestemme genomet-omfattende endringer i histone endring nivåer ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae som modellsystem. Denne protokollen gir omfattende etterforskning epigenetic endringer koblet til nevrodegenerative proteinopathies som bekrefte tidligere funn i annen modellsystemer samtidig betydelig utvide vår kunnskap om den neurodegenerative sykdom epigenome.

Illustrere denne metoden, vil vi dra nytte av nylig publiserte resultatene30. WT menneskelige Fu og TDP-43 var overexpressed 5 h, mens WT α-synuclein var overexpressed 8 h. En ccdB konstruksjon ble brukt som en vektor negativ kontroll. Figur 2 viser vekst undertrykkelse i faste og flytende kulturer. Gjær ble slaktet som beskrevet og vestlige blotting med endring-spesifikke antistoffer ble utført. Anti-totalt H3 ble brukt som en last...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Denne protokollen skisserer eksperimentelle prosedyrer for å karakterisere genomet-omfattende endringer i nivåer av histone post-translasjonell endringer (PTM) oppstår i forbindelse med overuttrykte proteiner knyttet ALS og Parkinsons Saccharomyces cerevisiae modeller. Etter SDS side separasjon oppdages personlige histone PTM nivåer med endring-spesifikke antistoffer via Western blotting.

Karakterisere Histone post-translasjonell modifikasjon endringer i gjær nevrodegenerative Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Denne protokollen tillater oss å enkelt utforske de epigenetiske egenskapene til nevrodegenerativ sykdom. Den største fordelen med denne teknikken er at den utnytter gjær som et modellsystem, sammenlignet med andre cellulære og animalske modeller av nevrodegenerativ sykdom, gjær er hensiktsmessig og kostnadseffektiv. Denne teknikken tillater oss å kartlegge de epigenetiske endringene som oppstår i nevrodegenerativ sykdom, noe som kan føre til nye markører for diagnose, samt nye mål for terapi.Denne metoden tillater videre undersøkelse av rollen som epigenetiske merker i nevrodegenerativ sykdom og kan endres for vurdering av menneskelige fibroblaster og induserte pluripotente stamceller. Denne metoden inneholder en rekke detaljer som må demonstreres visuelt, for eksempel riktig lasting av det vestlige flekkapparatet. Demonstrere prosedyren vil være Michel Fallah og Navin Rana, begge lavere forskere i Torrente laboratoriet.Begynn med å restreaking gjær fra frosne glyserol aksjer på histidin 2% glukose agar selektive medium plater, for en to til tre dagers inkubasjon ved 30 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, inokulert restreaked gjær for hver over uttrykk modell og kontroll i fem milliliter av histidin selektiv væske medium. Supplert med 2% raffinose ved 30 grader Celsius og 200 rotasjoner per minutt, over natten.Neste morgen, vokse 100 milliliter flytende kultur for hver av overexpression modeller og kontroller i selektive medier supplert med 2% galaktose over natten. Og mål den optiske tettheten på 600 nanometer eller OD600 for å bestemme volumet av overnattingskulturen som trengs for å gjengi over uttrykkskulturer ved en start OD600 på 0,3. For å indusere proteinoveruttrykk, dyrke gjæren på galaktosemedium med risting ved 30 grader Celsius for riktig eksperimentell tidsperiode.Mål deretter OD600 for hver kultur på slutten av induksjonsperioden. Og standardiser alle celletellingene til den laveste OD600-verdien. Høst kulturene i 50 milliliter sentrifugerør ved sentrifugering og gjenoppuss pellets i en milliliter sterilt stilled vann for hver 10 milliliter kultur dyrket.Aliquot en milliliter celleuspensjon i individuelle mikrocentrifuge rør for en ekstra sentrifugering og aspirere supernatantene. Deretter snap fryse celle pellets i flytende nitrogen for lagring på minus 80 grader celsius. For å lyse cellene for vestlig flekkanalyse, tin gjærcellepellets på is før gjenoppliving i 100 mikroliter destillert vann.Tilsett 300 mikroliter med 0,2-molar natriumhydroksid og 20 mikroliter 2-Mercaptoethanol til hver celleprøve. Og resuspend pellets ved pipettering. Etter en 10 minutters inkubasjon på is, pellet cellene ved sentrifugering og resuspend prøvene i 100 mikroliter av lasting fargestoff.Kok deretter prøvene i 10 minutter på en varmeblokk. Mens prøvene lyses, legg to geler i en gelholder og fyll det indre kammeret til toppen med løpebuffer og det ytre kammeret til to-gellinjemerket. Når prøvene er klare, last 15 mikroliter hver, cellelyseløsning, inn i hver brønn av de 10 brønnene, 12% polyakrylamidgel og legg til fem mikroliter proteinstige til proteinstigebanen godt.Kjør gelen i ca. 45 minutter ved 150 volt eller til lasting fargestoff foran når bunnen av gelen. Mens gelen er i gang, suge to fiber pads per gel i overføring buffer og en polyvinyliden fluor, eller PVDF, membran per gel i metanol. Når gelen er klar, skyll membranen i overføringsbuffer og legg en pressoaked fiberpute på bunnen av en halvtørr overføringsapparatcelle.Etterfulgt av PVDF-membranen, gelen og den andre presoderte fiberputen. Sett deretter strømmen til 150 milliamper i en time. På slutten av proteinoverføringen fjerner du membranen fra overføringsapparatet for en kort skylling med destillert vann.Legg den skyllede membranen, proteinsiden opp i en liten fargeboks og dekk membranen med trisbufret saltvann eller TBS, blokkerer buffer i en time inkubasjon ved romtemperatur med mild gynge. På slutten av blokkeringsinkubasjonen inkuberer membranen over natten med et anti-gjær histone og modifiseringsspesifikt antistoff i TBS ved fire grader Celsius. Og et skikkelig kjernefysisk lastekontrollantistoff.Neste morgen, vask membranen fire ganger i TBS, supplert med 0,1% polysorbat 20 i fem minutter med gynge ved romtemperatur per vask. Etter siste vask, inkuber blot med passende sekundære antistoffer i en time ved romtemperatur. Etterfulgt av fire, fem minutters vasker i TBST og en fem minutters vask i TBS alene med gynge.Deretter bilde blot på en fluorescerende vestlige flekk forestille system i to minutter. Her er vekstundertrykkelse i faste og flytende kulturer vist med betydelige effekter på gjærvekst observert i nærvær av galaktose-infundert i sarkom overuttrykksmodeller. En signifikant reduksjon i histonenivåer er tydelige i den smeltede i sarkomoveruttrykksmodellen, og signifikante økninger i nivåene av histoneacetylering i TAR-bindingsproteinet 43 overuttrykksmodell, observeres som ikke ses i verken smeltet i sarkom eller alfa synuclein overexpression modell.Det er også betydelige reduksjoner i histonenivåene i alfasynuclein-overuttrykksmodellen. I dette sukrose-tuning eksperimentet, jo lavere mengde galaktose som brukes til å indusere smeltet i sarkom overuttrykk, den lavere toksisiteten som observeres i både fast og flytende kultur. Viktigere, jo lavere nivå av smeltet i sarkom overuttrykk, jo mindre størrelsen på reduksjonen i histone nivåer.Mens du utfører denne protokollen, er det viktig å standardisere mengden gjær i hver prøve for å muliggjøre en riktig sammenligning i nivåene av histone post-translational modifikasjon. 2-Mercaptoethanol bør brukes under en hette for å unngå innånding. Hvis Ponceau flekken brukes, må den kastes riktig.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; mutagenese av Histone Gener i Budding Gjær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Grunnleggende og induserbart systemer for genetisk i Vivo endring av musen hepatocytter bruker etter halen blodåre injeksjon

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histone endringer fra Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gene målrettede tilfeldig mutagenese Velg Heterochromatin-destabilisere Proteasome mutanter fisjon gjær

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

En rask og kvantitativ metode for post-translasjonell modifikasjon og Variant aktivert tilordning av peptider å genomer

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parring-baserte overuttrykte biblioteket Screening i gjær

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Forberedelse og genet modifikasjon Nonhuman primas blodkreft stilk og Progenitor celler

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...