Name: characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Agradecemos Royena Tanaz, Huda Yousuf e Sadiqa Taasen para ajuda técnica. Nós estamos muito gratos ao Prof James Shorter para a oferta generosa de reagentes e assistência intelectual no design de experimentos de sintonização de sacarose. Plasmídeos de levedura foram um presente generoso do Prof Aaron Gitler (incluindo 303Gal-FUS; Plasmídeo Addgene # 29614). Brooklyn College e o centro de pesquisa ciência avançada (CUNY), bem como um NIH NINDS Advanced Postdoctoral transição Award (K22NS09131401) com suporte M.P.T.

1. transformar S. cerevisiae com construções de proteína associada proteinopathy neurodegenerativas
<ol><li>Crescer tipo selvagem (WT) 303 fermento no fermento extrato peptona dextrose (YPD) caldo de carne durante a noite com agitação (200 rpm) a 30 ° C.</li>
	<li>Após 12−16 h do crescimento, diluir o fermento para uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0.25 com YPD. Como 10 mL de cultura de levedura líquida serão necessários para cada transformação, preparar 50 mL de cultura de le...

<ol>
	<li>Landgrave-G&#243;mez, J., Mercado-G&#243;mez, O., Guevara-Guzm&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases.">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).</li><li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis:+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era.">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li><li>Beitz, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS.">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes.">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li><li>Da Cruz, S., Cleveland, D. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle.">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+&#945;-synuclein.">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human &#945;-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reveal+a+&#8220;Druggable&#8221;+Rsp5/Nedd4+Network+that+Ameliorates+&#945;-Synuclein+Toxicity+in+Neurons.">Yeast Reveal a &#8220;Druggable&#8221; Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates &#945;-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979 (2013).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li><li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).</li><li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models.">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).</li><li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models.">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li><li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+sequestration+of+FUS/TLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1.">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li><li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+(ALS)+Causing+Genes.">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li><li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson&#8217;s+disease:+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions.">Epigenetic approach to early-onset Parkinson&#8217;s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li><li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Modifications+of+the+&#945;-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects.">Epigenetic Modifications of the &#945;-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).</li></ol>

O protocolo descrito aqui fornece uma maneira simples, conveniente e econômica de categorização de alterações de todo o genoma do histone PTM correlacionadas com proteinopathies neurodegenerativas. Embora existam outros modelos de ALS e PD, como in vitro murino e linhas de células humanas modelos de32, S. cerevisiae permanece atraente por causa de sua facilidade de uso. Por exemplo, modelos de fermento não requer o uso de um capuz estéril, nem eles exigem o intensivo trei...

Doenças neurodegenerativas são doenças devastadoras, com pouca ou nenhuma opção de tratamento disponível. Entre estes, a esclerose lateral amiotrófica (ela) e a doença de Parkinson (PD) são particularmente terrível. Aproximadamente 90% dos casos de ALS e PD são considerados esporádicos, ocorrendo sem histórico familiar da doença, enquanto os restantes casos funcionar nas famílias e geralmente estão ligados a um gene específico mutação1,2. Curiosamente, ambos destas doenças estão associados com a proteína mislocalization e agregação de3,4,5,6. Por exemplo, fundido em sarcoma de (FUS) e proteína de ligação a DNA TAR 43 (TDP-43) são proteínas de ligação de RNA que mislocalize para o citoplasma e agregam em ALS7,8,9,10, 11,12, enquanto α-synuclein é o componente do princípio de agregados proteicos denominados corpos de Lewy em PD5,13,14,15.
Apesar dos esforços de associação ampla de genoma-largo em grandes populações de pacientes, a esmagadora maioria dos casos de ALS e PD permanecem inexplicável geneticamente. Pode epigenética desempenham um papel na doença neurodegenerativa? Epigenetics compreende alterações na expressão gênica que ocorrem sem alterações de sequência de DNA subjacente16. Um mecanismo epigenético principal envolve as modificações borne-translational (PTMs) de histona proteínas16. Em células eucarióticas, material genético é fortemente envolvido na cromatina. A unidade básica da cromatina é a nucleossoma, composto por 146 pares de bases de DNA enrolado ao redor de um octamer de histona, composto por quatro pares de histonas (duas cópias de cada das histonas H2A, H2B, H3 e H4)17. Cada histona tem a cauda do N-terminal que se projeta fora do nucleossoma e pode ser modificada pela adição de várias partes de químicas, normalmente em resíduos de lisina e arginina18. Estes PTMs são dinâmicas, o que significa que eles podem ser facilmente adicionados e removidos e incluem grupos como fosforilação, metilação e acetilação. PTMs controlar a acessibilidade do DNA para a maquinaria transcricional e contribuindo assim para controle de expressão de gene18. Por exemplo, a acetilação da histona reduz a força da interação eletrostática entre a proteína histona altamente básica e o backbone de DNA carregado negativamente, permitindo que os genes embalados por histones acetificados para ser mais acessível e, portanto, altamente expresso19. Mais recentemente, a notável especificidade biológica de histona particular PTMs e suas combinações levou o histona código hipótese20,21 na quais proteínas que escrever, apagar e ler PTMs de histona todos agem em conjunto para Module a expressão gênica.
O fermento é um modelo muito útil para estudar a neurodegeneração. Importante, muitos caminhos celulares neuronais são conservados de levedura para seres humanos22,23,24. Levedura recapitular fenótipos de citotoxicidade e inclusões de proteína com superexpressão de FUS, TDP-43 ou α-synuclein22,23,24,25,26. Na verdade, modelos de Saccharomyces cerevisiae de ALS já foram usados para identificar fatores de risco genéticos em seres humanos27. Além disso, o fermento superexpressão α-synuclein humana permitida a caracterização da rede Rsp5 como um destino druggable para amenizar a toxicidade de α-synuclein em neurônios28,29.
Aqui, descrevemos um protocolo explorando Saccharomyces cerevisiae para detectar alterações no genoma-largo do histone PTM associadas com proteinopathies neurodegenerativas (Figura 1). O uso de S. cerevisiae é altamente atraente por causa de sua facilidade de uso, baixo custo e a velocidade em comparação com outros modelos in vitro e animais de neurodegeneração. Aproveitamento anteriormente desenvolvido ALS e PD modelos22,23,25,26, podemos ter overexpressed humana FUS, TDP-43 e α-synuclein em levedura e mudanças PTM descobertos histona distintas ocorrem em conexão com cada proteinopathy30. O protocolo que descrevemos aqui pode ser concluído em menos de duas semanas de transformação para análise de dados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>-His DO Supplement</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Polyacrylamide Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>07-353 (Lot No. 2762291)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109463 (Lot No. GR187780)</td>
			<td>Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab46983 (Lot No. GR71882)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td>
			<td>Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate, 96 well</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td>
			<td>Dilution: 1/2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blot paper (filter paper)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare 50 % w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL Transfer Membranes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td>Prepare a 1 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>102855-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe I Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>101228-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-ccdB</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303Gal-FUS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>29614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-TDP-43</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td>Prepare a 50% w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504</td>
			<td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Prepare 10% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>201190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGal-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Prepare 0.2 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 303 S. cerevisiae yeast</td>
			<td>Gift from J. Shorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models

Doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica (ela) e a doença de Parkinson (PD), causam a perda de centenas de milhares de vidas anualmente. Opções de tratamento eficazes, capazes de impedir a progressão da doença são escassos. Apesar dos esforços de sequenciamento extensa em grandes populações de pacientes, a maioria dos casos de ALS e PD permanecem inexplicável por mutações genéticas sozinhos. Epigenetics mecanismos, tais como a modificação pós-traducional de proteínas histonas, podem estar envolvidos na progressão e etiologia de doenças neurodegenerativas e levam a novos alvos para intervenção farmacêutica. Mamíferos modelos in vivo e in vitro da ALS e PD são caros e muitas vezes exigem prolongados e laboriosos de protocolos experimentais. Aqui, podemos delinear uma abordagem prática, rápida e econômica para determinar todo o genoma de alterações nos níveis de modificação de histona utilizando Saccharomyces cerevisiae como um sistema modelo. Este protocolo permite investigações abrangentes sobre alterações epigenéticas, ligadas ao proteinopathies neurodegenerativas que corroborar conclusões anteriores em sistemas diferentes do modelo ao mesmo tempo expandindo significativamente nosso conhecimento sobre o Epigenoma de doenças neurodegenerativas.

Para ilustrar este método, nós vai aproveitar resultados recentemente publicados30. WT FUS humana e TDP-43 eram overexpressed por 5h, enquanto WT α-synuclein foi overexpressed para 8 h. Uma construção de ccdB foi usada como um controle negativo do vetor. A Figura 2 mostra a supressão do crescimento em culturas de sólidos e líquidas. Levedura foi colhida conforme descrito e mancha ocidental com anticorpos específicos modificaç...

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Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Este protocolo descreve procedimentos experimentais para caracterizar todo o genoma de alterações nos níveis de modificações borne-translational do histone (PTM) ocorrendo em relação a superexpressão de proteínas associadas com a ALS e a doença de Parkinson em Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Após a separação de SDS-PAGE, níveis PTM histona individuais são detectados anticorpos específicos de modificação através da mancha ocidental.

Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Este protocolo nos permite explorar facilmente as características epigenéticas da doença neurodegenerativa. A principal vantagem dessa técnica é que ela explora a levedura como um sistema modelo, em comparação com outros modelos celulares e animais de doença neurodegenerativa, a levedura é conveniente e econômica. Essa técnica nos permite mapear as alterações epigenéticas que surgem na doença neurodegenerativa, que podem levar a novos marcadores para diagnóstico, bem como novos alvos para a terapia.Este método permite uma investigação mais aprofundada do papel das marcas epigenéticas na doença neurodegenerativa e pode ser modificado para a avaliação de fibroblastos humanos e células-tronco pluripotentes induzidas. Este método em particular contém uma série de detalhes que precisam ser demonstrados visualmente, como o carregamento adequado do aparelho de mancha ocidental. Demonstrando o procedimento estarão Michel Fallah e Navin Rana, ambos pesquisadores de graduação do laboratório Torrente.Comece ressuando levedura de estoques de glicerol congelados em placas médias seletivas de ágar de 2% glicose, para uma incubação de dois a três dias a 30 graus Celsius. No final da incubação, a levedura reescrita inoculada para cada modelo de expressão sobre expressão e controle em cinco mililitros de meio líquido seletivo histidina. Complementado com 2% de raffinose a 30 graus Celsius e 200 rotações por minuto, durante a noite.Na manhã seguinte, cresça 100 mililitros de cultura líquida para cada um dos modelos de superexpressão e controles em meios seletivos complementados com 2% de galactose durante a noite. E meça a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD600 para determinar o volume da cultura durante a noite necessária para renderizar sobre culturas de expressão a um OD600 inicial de 0,3. Para induzir a superexpressão proteica, cresça a levedura no meio galactose com agitação a 30 graus Celsius para o período experimental adequado.Em seguida, meça o OD600 de cada cultura no final do período de indução. E padronizar todas as contagens de células para o menor valor OD600. Colher as culturas em tubos de centrífugas de 50 mililitros por centrifugação e resuspensar as pelotas em um mililitro de água estéril para cada 10 mililitros de cultura cultivadas.Alíquota de um mililitro de resuspensão celular em tubos de microcentrifuusidade individual para uma centrifugação adicional e aspirar os supernantes. Em seguida, congele as pelotas de célula em nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus celsius. Para lise as células para análise de manchas ocidentais, descongele as pelotas de células de levedura no gelo antes da resuspensão em 100 microlitres de água destilada.Adicione 300 microlitres de hidróxido de sódio 0,2 molar e 20 microlitres de 2-Mercaptoetanol a cada amostra celular. E resuspense as pelotas por pipetação. Após uma incubação de 10 minutos no gelo, pelota as células por centrifugação e resuspensa as amostras em 100 microliters de corante de carga.Em seguida, ferva as amostras por 10 minutos em um bloco de aquecimento. Enquanto as amostras estão sendo líricas, coloque dois géis em um suporte de gel e encha a câmara interna até o topo com tampão de corrida e a câmara externa para a marca de linha de dois gel. Quando as amostras estiverem prontas, carregue 15 microliters cada um, solução de lise celular, em cada poço dos 10 poços, 12% de gel de poliacrilamida e adicione cinco microlitadores de escada de proteína à pista de escada de proteína bem.Execute o gel por aproximadamente 45 minutos a 150 volts ou até que o carregamento da frente de corante atinja a parte inferior do gel. Enquanto o gel estiver funcionando, mergulhe duas almofadas de fibra por gel no buffer de transferência e um fluoreto de polivinida, ou PVDF, membrana por gel em metanol. Quando o gel estiver pronto, enxágue a membrana no tampão de transferência e coloque uma almofada de fibra preso na parte inferior de uma célula de aparelho de transferência semi-seca.Seguido pela membrana PVDF, o gel e o segundo bloco de fibra preso. Em seguida, afina a energia para 150 miliamperes por uma hora. No final da transferência de proteínas, remova a membrana do aparelho de transferência para uma breve lavagem com água destilada.Coloque a membrana enxaguada, o lado da proteína em uma pequena caixa de coloração e cubra a membrana com soro fisiológico ou TBS, bloqueando o tampão para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente com balanço suave. No final da incubação de bloqueio, incubar a membrana durante a noite com uma histona anti-levedura e anticorpo específico de modificação em TBS a quatro graus Celsius. E um anticorpo de controle de carga nuclear adequado.Na manhã seguinte, lave a membrana quatro vezes em TBS, suplementada com 0,1% de polisorbato 20 por cinco minutos com balanço à temperatura ambiente por lavagem. Após a última lavagem, incubar a mancha com os anticorpos secundários apropriados durante uma hora em temperatura ambiente. Seguido por quatro, cinco minutos de lavagem em TBST e uma lavagem de cinco minutos em TBS sozinho com balanço.Em seguida, imagine a mancha em um sistema de imaginação de manchas ocidentais fluorescentes por dois minutos. Aqui, a supressão do crescimento em culturas sólidas e líquidas é mostrada com efeitos significativos sobre o crescimento da levedura observado na presença de galactose-infundido em modelos de superexpressão de sarcoma. Uma diminuição significativa dos níveis de histona são aparentes no modelo fundido no modelo de superexpressão de sarcoma e aumentos significativos nos níveis de acetilação de histona no modelo de superexpressão da proteína de ligação TAR 43, que não são vistos no modelo de superexpressão de sarcoma ou alfa sinucleína.Também há reduções significativas nos níveis de histona no modelo de superexpressão da sinucleína alfa. Neste experimento de afinação de sacarose, menor a quantidade de galactose usada para induzir fundido na superexpressão do sarcoma, a menor toxicidade observada na cultura sólida e líquida. É importante ressaltar que quanto menor o nível de fundição na superexpressão do sarcoma, menor a magnitude da redução dos níveis de histona.Ao executar este protocolo, é imperativo padronizar a quantidade de levedura em cada amostra para permitir uma comparação adequada nos níveis de modificação pós-translacional de histona. 2-Mercaptoetanol deve ser usado sob um capô para evitar a inalação. Se a mancha de Ponceau for usada, deve ser descartada corretamente.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Um método rápido e quantitativo para a modificação pós-traducional e variante habilitado para mapeamento de peptídeos de genomas

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...