Name: characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models
Uploaded: 2019-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Мы благодарим Royena Tanaz, Юсуф Худа и Sadiqa Taasen для получения технической помощи. Мы очень благодарны профессор Джеймс короче за щедрое предоставление реагентов и интеллектуальной помощи в разработке сахарозы настройки экспериментов. Плазмиды дрожжи были щедрый подарок от профессор Аарон Gitler (включая 303 Гал-Фу; Плазмиды # 29614 Addgene). Бруклинский колледж и расширенный научно исследовательский центр (КЮНИ), а также низ NINDS Advanced докторской перехода награду (K22NS09131401) поддержал M.P.T.

1. преобразование S. cerevisiae с нейродегенеративных proteinopathy связанные белком конструкции
<ol><li>Расти дикого типа (WT) 303 дрожжи в дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YPD) бульон на ночь с встряхивания (200 об/мин) при 30 ° C.</li>
	<li>После 12−16 h роста, развести дрожжи оптической плотности на 600 Нм (<...

<ol>
	<li>Landgrave-G&#243;mez, J., Mercado-G&#243;mez, O., Guevara-Guzm&#225;n, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases.">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).</li><li>Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis:+mechanisms+and+therapeutics+in+the+epigenomic+era.">Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).</li><li>Beitz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+Disease:+a+Review.">Parkinson's Disease: a Review.</a> Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+prion-like+domains+in+hnRNPA2B1+and+hnRNPA1+cause+multisystem+proteinopathy+and+ALS.">Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS.</a> Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).</li><li>Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+in+neurodegenerative+disease.">TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).</li><li>Couthouis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+functional+screen+predicts+new+candidate+ALS+disease+genes.">A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).</li><li>Da Cruz, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+TDP-43+and+FUS/TLS+in+ALS+and+beyond.">Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).</li><li>King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tip+of+the+iceberg:+RNA-binding+proteins+with+prion-like+domains+in+neurodegenerative+disease.">The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease.</a> Brain Research. 1462, 61-80 (2012).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations.">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson's+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies.">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).</li><li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+parkinson's+disease:+dopamine,+vesicles+and+&#945;-synuclein.">Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and &#945;-synuclein.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).</li><li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+in+Lewy+bodies.">&#945;-Synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li><li>Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+inheritance+during+the+cell+cycle.">Epigenetic inheritance during the cell cycle.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).</li><li>Luger, K., M&#228;der, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 &#197; resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+concepts+of+epigenetics.">Basic concepts of epigenetics.</a> Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).</li><li>Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+and+transcriptional+regulatory.">Histone acetylation and transcriptional regulatory.</a> Genes &amp; Development. 12 (5), 599-606 (1998).</li><li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).</li><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+language+of+covalent+histone+modifications.">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li><li>Sanchez, Y., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP104+required+for+induced+thermotolerance.">HSP104 required for induced thermotolerance.</a> Science. 248 (4959), 1112 (1990).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772 (2003).</li><li>Johnson, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+Is+Intrinsically+Aggregation-prone,+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis-linked+Mutations+Accelerate+Aggregation+and+Increase+Toxicity.">TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+analysis+of+yeast+ubiquitin+ligase+Rsp5+variants+that+alleviate+the+toxicity+of+human+&#945;-synuclein.">Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human &#945;-synuclein.</a> The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Reveal+a+&#8220;Druggable&#8221;+Rsp5/Nedd4+Network+that+Ameliorates+&#945;-Synuclein+Toxicity+in+Neurons.">Yeast Reveal a &#8220;Druggable&#8221; Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates &#945;-Synuclein Toxicity in Neurons.</a> Science. 342 (6161), 979 (2013).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+Disease+Proteinopathies+Are+Connected+to+Distinct+Histone+Post-translational+Modification+Landscapes.">Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).</li><li>Flick, J. S., Johnston, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+of+glucose+repression+of+the+GAL1+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).</li><li>Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Research+of+Neurodegenerative+Disorders+Using+Patient+iPSC-Based+Models.">Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models.</a> Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).</li><li>Armakola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RNA+lariat+debranching+enzyme+suppresses+TDP-43+toxicity+in+ALS+disease+models.">Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models.</a> Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).</li><li>Tibshirani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+sequestration+of+FUS/TLS+associated+with+ALS+alters+histone+marks+through+loss+of+nuclear+protein+arginine+methyltransferase+1.">Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1.</a> Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).</li><li>Masala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Changes+Associated+with+the+Expression+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+(ALS)+Causing+Genes.">Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes.</a> Neuroscience. 390, 1-11 (2018).</li><li>Eryilmaz, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+approach+to+early-onset+Parkinson&#8217;s+disease:+low+methylation+status+of+SNCA+and+PARK2+promoter+regions.">Epigenetic approach to early-onset Parkinson&#8217;s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions.</a> Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).</li><li>Daniele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Modifications+of+the+&#945;-Synuclein+Gene+and+Relative+Protein+Content+Are+Affected+by+Ageing+and+Physical+Exercise+in+Blood+from+Healthy+Subjects.">Epigenetic Modifications of the &#945;-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).</li></ol>

Протокол, описанные здесь обеспечивает простой, целесообразным и экономически эффективным способом изменения генома wide гистонов ПТМ, коррелирует с нейродегенеративных proteinopathies классификации. Хотя есть другие модели ALS и PD, например в vitro линий клеток человека и мышиным модели<sup cla...

Нейродегенеративные заболевания являются разрушительных болезней с практически нет доступных вариантов лечения. Среди них особенно страшны боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD). Примерно в 90% случаев ALS и PD считаются спорадические, происходящие без семейной истории болезни, в то время как оставшиеся дела работать в семьях и как правило связаны с конкретным ген мутации1,2. Интересно, что оба этих заболеваний связаны с белком mislocalization и агрегации3,4,5,6. К примеру, сливается в саркома (FUS) и TAR ДНК-связывающих белков 43 (TDP-43) являются белки, связывающие РНК mislocalize в цитоплазму и объединяют в ALS7,8,9,10, 11,12, в то время как α-synuclein — это компонент принципа белковых агрегатов, называется Леви органов в PD5,13,14,15.
Несмотря на обширные генома всей ассоциации в больших популяциях пациентов подавляющее большинство случаев ALS и PD оставаться необъяснимая генетически. Можно эпигенетики играть определенную роль в нейродегенеративных заболеваний? Эпигенетики включает в себя изменения в экспрессии генов, происходит без изменения базовой последовательности ДНК16. Основные эпигенетический механизм включает столб-поступательные изменения (PTMs) гистоновых белков16. В эукариотических клетках генетический материал плотно завернута в хроматина. Базовой единицей хроматина является нуклеосома, состоящий из 146 пар оснований ДНК, обернутые вокруг гистона octamer, состоящий из четырех пар гистонов (две копии каждого гистонами H2A, H2B, H3 и H4)17. Каждый гистона имеет N-терминальный хвост, который выступает из нуклеосомой и может быть изменена путем добавления различных химических постановление, обычно на остатков лизина и аргинина18. Эти PTMs являются динамическими, что означает, что они могут быть легко добавлены и удалены и включают группы ацетилирования, метилирование и фосфорилирования. PTMs контролировать доступность ДНК транскрипционный анализ техники и тем самым помочь управления ген выражение18. К примеру, ацетилирование гистона уменьшает силы электростатического взаимодействия между очень основные гистона белка и отрицательно заряженной ДНК позвоночника, позволяя гены, Упакованные ацетилированный гистонами быть более доступным и, таким образом высоко выраженная19. Совсем недавно замечательный биологических специфику конкретных гистона PTMs и их комбинаций привела к гистона кода гипотеза20,21 в котором белки, писать, стереть и чтение гистон PTMs все согласованно действовать для модулировать экспрессию генов.
Дрожжей является очень полезной моделью для изучения нейродегенеративные. Важно отметить, что многие нейрональных клеточных пути сохраняются из дрожжей для людей22,,2324. Дрожжи пилки цитотоксичность фенотипы и белковых включений по гиперэкспрессии FUS, TDP-43 или α-synuclein22,23,24,25,26. В самом деле Saccharomyces cerevisiae модели ALS были использованы для выявления генетических факторов риска в людей27. Кроме того дрожжи, экспрессирующих человека α-synuclein разрешено для характеристики сети Rsp5 как druggable цель улучшения α-synuclein токсичности в нейроны28,29.
Здесь мы описываем протокол эксплуатации Saccharomyces cerevisiae для выявления генома wide гистонов PTM изменения, связанные с нейродегенеративных proteinopathies (рис. 1). Использование S. cerevisiae весьма привлекательными из-за его простоту использования, низкая стоимость и скорость по сравнению с другими in vitro и животных моделей нейродегенеративные. Использование ранее разработан ALS и PD модели22,23,25,26, мы оверэкспрессировали человека FUS, TDP-43 и α-synuclein в дрожжей и открытые собственный гистона PTM изменения, происходящие в связь с каждой proteinopathy30. Протокол, который мы описываем здесь может быть завершена в менее чем за две недели от преобразования для анализа данных.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>-His DO Supplement</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Running Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12% Polyacrylamide Gels</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>456-1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary Antibody</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>07-353 (Lot No. 2762291)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109463 (Lot No. GR187780)</td>
			<td>Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab46983 (Lot No. GR71882)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)</td>
			<td>Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab188292 (Lot No. GR211874)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6133000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish (100 x 20 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate, 96 well</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30730011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)</td>
			<td>Dilution: 1/5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)</td>
			<td>Dilution: 1/2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra thick blot paper (filter paper)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1703968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare 50 % w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL Transfer Membranes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4158</td>
			<td>Prepare a 1 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>102855-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nhe I Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>101228-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>2800-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-a-synuclein-GFP</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-ccdB</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>14133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303Gal-FUS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>29614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG303GAL-TDP-43</td>
			<td>Gift from A. Gitler</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) (PEG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td>Prepare a 50% w/v solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3504</td>
			<td>Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Prepare 10% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>201190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGal-His plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate Loading Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Prepare 0.2 M solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Prepare 20% w/v stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline (TBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 303 S. cerevisiae yeast</td>
			<td>Gift from J. Shorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing histone post-translational modification alterations in yeast neurodegenerative proteinopathy models

Нейродегенеративные заболевания, такие как боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD), приводят к потере сотен тысяч жизней каждый год. Хватает эффективного лечения может остановить прогрессирование болезни. Несмотря на обширные последовательности в больших популяциях пациентов в большинстве случаев ALS и PD остаются необъяснимые, генетические мутации в одиночку. Эпигенетики такие механизмы, как столб-поступательные изменения гистона белков, могут быть вовлечены в этиологии нейродегенеративных заболеваний и прогрессии и привести к новые цели для фармацевтических вмешательства. Млекопитающих в vivo и in vitro модели ALS и PD являются дорогостоящими и зачастую требует длительных и трудоемких экспериментальных протоколов. Здесь мы приводим практический, быстрой и экономически подход к определению генома общесистемной изменения гистона модификации уровней с помощью Saccharomyces cerevisiae как модель системы. Этот протокол позволяет для всеобъемлющего расследования эпигеномные изменения, подключенных к нейродегенеративных proteinopathies, что подтверждают ранее сделанные выводы в различных модельных системах значительно расширяя наши знания о нейродегенеративные заболевания epigenome.

Для иллюстрации этого метода, мы будем использовать недавно опубликованные результаты30. WT человека FUS и TDP-43 были оверэкспрессировали за 5 ч, в то время как WT α-synuclein был оверэкспрессировали за 8 ч. Конструкция ccdB был использован как элемент отрицательный век...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models at JoVE.com

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Этот протокол определяет экспериментальной процедуры характеризовать геном-изменения в уровнях столб-поступательные изменения гистона (ПТМ), возникающих в связи с гиперэкспрессия белков, связанные с ALS и болезни Паркинсона в Saccharomyces cerevisiae модели. После разъединения SDS-PAGE отдельные гистона PTM уровни концентрации обнаружены с модификации специфические антитела через западный blotting.

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Этот протокол позволяет нам легко исследовать эпигенетические особенности нейродегенеративных заболеваний. Основным преимуществом этого метода является то, что он использует дрожжи в качестве образцовой системы, по сравнению с другими клеточными и животными моделями нейродегенеративных заболеваний, дрожжи являются целесообразными и экономически эффективными. Этот метод позволяет нам наметить эпигенетические изменения, которые возникают при нейродегенеративных заболеваниях, которые могут привести к новым маркерам для диагностики, а также новые цели для терапии.Этот метод позволяет продолжить исследование роли эпигенетических знаков в нейродегенеративных заболеваниях и может быть модифицирован для оценки фибробластов человека и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Данный метод содержит ряд деталей, которые необходимо продемонстрировать визуально, таких как надлежащая загрузка западного аппарата помарки. Демонстрация процедуры будет Мишель Фаллах и Навин Рана, как студентов исследователей в лаборатории Торренте.Начните с restreaking дрожжей из замороженных запасов глицерол на гистидин 2%глюкозы агар селективных средних пластин, в течение двух-трех дней инкубации при 30 градусов по Цельсию. В конце инкубации, привить restreaked дрожжей для каждого над моделью выражения и контроля в пяти миллилитров гистидина селективной жидкой среды. Дополняется 2%raffinose при 30 градусах по Цельсию и 200 оборотов в минуту, на ночь.На следующее утро вырастите 100 миллилитров жидкой культуры для каждой из моделей переэкспрессии и элементы управления в селективных средах, дополненных 2%galactose ночью. И измерить оптическую плотность на 600 нанометров или OD600, чтобы определить объем ночной культуры, необходимой для визуализации над культурами выражения в начале OD600 из 0,3. Чтобы вызвать переэкспрессию белка, выращивайте дрожжи на галактозной среде при встряхивании при 30 градусах по Цельсию в течение соответствующего экспериментального периода времени.Затем измерьте OD600 каждой культуры в конце индукционной периода. И стандартизируйте все значения ячейки до самого низкого значения OD600. Урожай культур в 50 миллилитровых центрифуг труб путем центрифугации и повторно гранулы в один миллилитр стерильной еще воды на каждые 10 миллилитров культуры выросли.Aliquot один миллилитр повторного деления клеток в отдельных микроцентрифуг трубки для дополнительной центрифугации и аспирировать супернатанты. Затем оснастки заморозить клеточные гранулы в жидком азоте для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы подлизать клетки для западного анализа помарки, оттепель дрожжевых клеток гранулы на льду до повторного незаменимия в 100 микролитров дистиллированной воды.Добавьте 300 микролитров 0,2-молярного гидроксида натрия и 20 микролитров 2-меркаптоэтанола в каждый образец клетки. И перерасход гранул путем трубопроводов. После 10-минутной инкубации на льду, гранулы клеток центрифугации и повторного использования образцов в 100 микролитров погрузочного красителя.Затем варить образцы в течение 10 минут на нагревательный блок. В то время как образцы в настоящее время lysed, поместите два геля в гель держатель и заполнить внутреннюю камеру на вершину с работает буфер и внешняя камера на два геля линии знака. Когда образцы будут готовы, загрузите по 15 микролитров каждый, раствор клеточного лиза, в каждую колодец из 10 хорошо, 12%полякриламидный гель и добавьте пять микролитров белковой лестницы в белковую лестницу хорошо.Вы запустите гель в течение примерно 45 минут при 150 вольт или до загрузки красителя фронт достигает нижней части геля. В то время как гель работает, замочить два волокна колодки на гель в буфер передачи и один поливинидин фторид, или PVDF, мембрана на гель в метаноле. Когда гель будет готов, промыть мембрану в буфер передачи и поместите один presoaked волокна площадку на дне полусухой клетки переноса аппарата.Затем мембрана PVDF, гель и второй presoaked волокна площадку. Затем установите мощность до 150 миллиампер в течение одного часа. В конце передачи белка удалите мембрану из переноса аппарата для краткого полоскания дистиллированной водой.Поместите промытую мембрану, белок вверх в небольшой ящик для окрашивания и накройте мембрану трис-буферным солевым раствором или TBS, блокируя буфер в течение одного часа инкубации при комнатной температуре с нежным раскачиванием. В конце блокирующего инкубации инкубировать мембрану на ночь с антидрожожного гистона и модификации специфических антител в TBS при четырех градусах по Цельсию. И правильное антитело контроля ядерной нагрузки.На следующее утро, мыть мембрану четыре раза в TBS, дополняется 0,1%полисорбат 20 в течение пяти минут с качания при комнатной температуре за стирку. После последней стирки инкубировать пятно с соответствующими вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре. Затем четыре, пять минут моет в TBST и одна пятиминутная стирка в TBS только с качания.Затем изображение пятно на флуоресцентной западной помарки воображая системы в течение двух минут. Здесь подавление роста в твердых и жидких культурах показано со значительным влиянием на рост дрожжей наблюдается в присутствии галактозы проникнуты в саркомы переэкспрессии моделей. Значительное снижение уровня гистона проявляется в сплавленной в саркоме модели переэкспрессии и значительное увеличение уровней ацетилирования гистона в ТДО связывания белка 43 переэкспрессии модели, наблюдаются, которые не наблюдаются ни в сплавленных в саркоме или альфа-синуклеин оверэкспрессии модели.Есть также значительное снижение уровня гистона в модели альфа-синуклеина переэкспрессии. В этом эксперименте по настройке сахарозы, чем меньше количество галактозы, используемой для индуцирования сплавленных в саркоме переэкспрессии, тем ниже токсичность, которая наблюдается как в твердой, так и в жидкой культуре. Важно отметить, что чем ниже уровень сливается в саркоме переэкспрессии, тем меньше величина снижения уровня гистона.При выполнении этого протокола, крайне важно стандартизировать количество дрожжей в каждом образце, чтобы обеспечить надлежащее сравнение уровней гистон пост-трансляционной модификации. 2-Меркаптоэтанол следует использовать под капотом, чтобы избежать вдыхания. Если ponceau пятно используется, он должен быть отброшен должным образом.

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

целевое<em&gt; В Ситу</em&gt; мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Учредительные и индуцибельной систем для генетических в естественных условиях изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Иммунопреципитации Chromatin (чип) изменения гистона от Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Джин целевой случайных мутагенеза выбрать дестабилизирующих гетерохроматин протеасом мутантов в деления дрожжевой

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Быстрый и количественный метод для столб-поступательные изменения и вариант включено сопоставление пептидов в геномов

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

На основе спаривания гиперэкспрессия библиотека скрининга в дрожжи

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Подготовка и генной модификации нечеловеческих приматов гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...