Name: cultivation of green microalgae in bubble column photobioreactors and an assay for neutral lipids
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids at JoVE.com

Support af denne forskning blev leveret af USDA National Institute for fødevarer og landbrug Hatch projekt ALA0HIGGINS og Auburn University kontorer i Provst, Vice President for forskning og af Samuel Ginn College of Engineering. Støtte blev også leveret fra NSF give CBET-1438211.

1. opsætning af boble kolonne Photobioreactors
<ol><li>Konstruere en række udluftet låg fra plast låg, der fulgte med 1 L glasflasker og hybridisering rør (Se figur 1 for skematisk og fotos). Konstruere låg luftfugter, blande fælde, hver luft lift photobioreactor og hver flaske reaktor.<ol>
<li>Bore ¼" huller i låget: 2 huller er nødvendige for bioreaktor og luftfugter låg; 3 huller er nødvendige for at blande fælde.</li>
		<li>Slip en ¼" O-ring over trådene i en 1/8" panel ...

<ol>
	<li>Prandini, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+nutrient+removal+from+swine+wastewater+digestate+coupled+to+biogas+purification+by+microalgae+Scenedesmus+spp.">Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp.</a> Bioresource Technology. , 67-75 (2016).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoremediation+of+dairy+and+winery+wastewater+using+Diplosphaera+sp.+MM1.">Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1.</a> Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).</li><li>Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dairy+Wastewaters+for+Algae+Cultivation,+Polyhydroxyalkanote+Reactor+Effluent+Versus+Anaerobic+Digester+Effluent.">Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent.</a> BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).</li><li>Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+a+native+alga+for+biomass+and+biofuel+accumulation+in+coal+bed+methane+production+water.">Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water.</a> Algal Research. 19, 63-68 (2016).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+accumulation+mechanisms+of+the+oleaginous+microalga+Chlorella+protothecoides+revealed+through+its+genome,+transcriptomes,+and+proteomes.">Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes.</a> BMC Genomics. 15, (2014).</li><li>Burch, A. R., Franz, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+nitrogen+limitation+and+hydrogen+peroxide+treatment+enhances+neutral+lipid+accumulation+in+the+marine+diatom+Phaeodactylum+tricornutum.">Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum.</a> Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).</li><li>Brennan, L., Owende, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofuels+from+microalgae--A+review+of+technologies+for+production,+processing,+and+extractions+of+biofuels+and+co-products.">Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products.</a> Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).</li><li>Branyikova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microalgae+-+Novel+highly+efficient+starch+producers.">Microalgae - Novel highly efficient starch producers.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).</li><li>Chalima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+Volatile+Fatty+Acids+from+Microalgae+for+the+Production+of+High+Added+Value+Compounds.">Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds.</a> Fermentation. 3 (4), (2017).</li><li>Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocess+engineering+of+microalgae+to+produce+a+variety+of+consumer+products.">Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+method+for+genetic+transformation+of+the+green+alga+Chlorella+ellipsoidea.">Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutate+Chlorella+sp.+by+nuclear+irradiation+to+fix+high+concentrations+of+CO2.">Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2.</a> Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).</li><li>Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techno-economic+analysis+of+autotrophic+microalgae+for+fuel+production.">Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production.</a> Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).</li><li>Sales, C. M., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Scale+in+a+Photosynthetic+Reactor+System+for+Algal+Remediation+of+Wastewater.">Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).</li><li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+symbiosis+for+enhanced+algal+growth,+biofuel+production,+and+wastewater+treatment.">Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment.</a> Algal Research. 17, 308-315 (2016).</li><li>Higgins, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal-bacterial+synergy+in+treatment+of+winery+wastewater.">Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater.</a> Nature Clean Water. 1 (6), (2017).</li><li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+thiamine+metabolites+and+spent+medium+from+Chlorella+sorokiniana+on+metabolism+in+the+green+algae+Auxenochlorella+prototheciodes.">Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes.</a> Algal Research. 33, 197-208 (2018).</li><li>L&#233;pinay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+insight+on+interactions+between+bacteria+and+the+marine+diatom+Haslea+ostrearia:+Algal+growth+and+metabolomic+fingerprinting.">First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting.</a> Algal Research. 31, 395-405 (2018).</li><li>Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+three+microalgae+strains+and+nutrient+removal+from+an+agro-zootechnical+digestate.">Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate.</a> Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).</li><li>Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azospirillum+brasilense+Increases+CO2+Fixation+on+Microalgae+Scenedesmus+obliquus,+Chlorella+vulgaris,+and+Chlamydomonas+reinhardtii+Cultured+on+High+CO2+Concentrations.">Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations.</a> Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).</li><li>Higgins, B., VanderGheynst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Escherichia+coli+on+mixotrophic+growth+of+Chlorella+minutissima+and+production+of+biofuel+precursors.">Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors.</a> PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).</li><li>Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+assay+for+quantitation+of+neutral+lipids+in+extracts+from+microalgae.">Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae.</a> Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).</li><li>Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+elevated+CO2+concentration+on+the+quality+of+algal+starch+as+a+potential+biofuel+feedstock.">The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informatics+for+improved+algal+taxonomic+classification+and+research:+A+case+study+of+UTEX+2341.">Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341.</a> Algal Research. 12, 545-549 (2015).</li><li>Garrett, R. H., Grisham, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , 578-730 (2012).</li><li>de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -. P., Bashan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorella+sorokiniana+UTEX+2805,+a+heat+and+intense,+sunlight-tolerant+microalga+with+potential+for+removing+ammonium+from+wastewater.">Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater.</a> Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).</li><li>Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual International Meeting of the ASABE. , (2018).</li></ol>

Den vigtigste overvejelse ved dyrkning af alger er en forståelse af de specifikke behov i organismen eller gruppe af organismer. Algerne dyrkning system beskrevet her kan bruges til kultur en bred vifte af alger, men de specifikke abiotiske faktorer (temperatur, medier, pH, lysintensitet, CO2 niveau, beluftning sats) skal tilpasses til behovene, som skadegøreren. Bemærk de parametre, der beskrives her blev anvendt til dyrkning af Chlorella og Auxenochlorella. Disse organismer er af industr...

Anvendelsen af mikroalger i ingeniør- og bioteknologi har tiltrukket sig stor interesse i de seneste år. Mikroalger er undersøgt til brug i spildevand behandling1,2,3,4, biobrændstof produktion5,6,7,8, og den produktion af nutraceuticals og andre høje værdi produkter9,10. Alger er også er genetisk modificerede til højere priser i et forsøg på at forbedre deres egnethed til specifikke tekniske applikationer11,12. Der er derfor stor interesse i eksperimenter med industrielt relevante organismer i kontrolleret indstillinger. Formålet med denne metode er at kommunikere en effektiv tilgang til kultur mikroalger i et kontrolleret laboratoriemiljø og måle vækst og neutral lipid indhold af at alger. Forbedre vækst priser og neutral lipid indhold af mikroalger er blevet identificeret som to centrale flaskehalse mod kommercialisering af alger biobrændstoffer13.
En bred vifte af tilgange har været brugt til kultur alger til forsøgsformål. Generelt er kan disse tilgange opdeles mellem store udendørs dyrkningen og små indendørs dyrkning. Udendørs dyrkningen i photobioreactors og åben damme er egnet til eksperimenter med henblik på optrapning af processer, der allerede er blevet påvist i laboratoriet målestok (f.eks., at teste skala-up af en ny high-lipid stamme af alger)14. Dog, indendørs små dyrkning er relevant ved udviklingen af nye eller forbedrede alger stammer eller udføre eksperimenter til formål at forstå biologiske mekanismer. I disse sidstnævnte tilfælde kræves en høj grad af eksperimentelle kontrol at drille subtile ændringer i biologiske opførsel. Med henblik herpå, er axenic kulturer ofte nødvendige for at minimere de komplekse biotiske faktorer i forbindelse med andre organismer (fx bakterier og andre alger), der uundgåeligt vokser i store udendørs systemer. Selv når man studerer interaktioner blandt alger og andre organismer, har vi fundet, at brug af stærkt kontrollerede forsøgsbetingelser er nyttigt, når undersøge molekylære udveksling mellem organismer15,16,17.
Inden for kategorien af mindre indendørs alger dyrkning, har været brugt en vifte af tilgange. Måske er den mest almindelige metode at dyrke alger i Erlenmeyerkolben kolber på en shakerbord under en lys bank18,19. Udvekslingen af ilt og CO2 finder sted ved passiv diffusion gennem en skum prop i toppen af kolben. Nogle forskere har forbedret dette set-up gennem aktive beluftning af kolberne20. En anden metode er at dyrke alger i flasker, mixet af rør bar og aktive beluftning. Trods deres enkelhed, har vi fundet, at brug af flasker og flasker ofte fører til inkonsistente resultater blandt biologiske replikater. Formentlig skyldes holdning effekter - forskellige positioner modtager forskellige mængder af lys, som også berører intern reaktor temperaturer. Daglige rotation af reaktorer til nye stillinger kan hjælpe, men ikke afhjælpe problemet, fordi visse faser af algevækst (fx tidligt eksponentiel) er mere følsomme over for positionelle effekter end andre (fx log fase).
På den modsatte side af spektret af teknologisk sofistikerede er fuldt kontrolleret kommercielle photobioreactors. Disse systemer løbende overvåge og justere forholdene i reaktoren til at optimere algevækst. De programmerbare lys, real-time temperaturkontrol og pH kontrol. Desværre, de er dyre og koster typisk flere tusinde dollars pr. reaktor. Mest videnskabelige og tekniske tidsskrifter kræver biologiske replikering af resultater, hvilket kræver køb af flere bioreaktorer. Vi præsenterer her en boble kolonne reaktor system at broer kløft mellem simple (kolbe) og sofistikerede (fuldt kontrolleret bioreaktor) tilgange til lab-skala alger dyrkning. Boble kolonner bruger stigende gasbobler til at lette gasudveksling og bland reaktoren. Denne fremgangsmåde giver en vis grad af styring af belysning og temperatur men gør det på en måde, der er omkostningseffektive. Desuden har vi fundet dette system til at give meget ensartede resultater blandt biologiske replikater, at reducere det nødvendige antal biologiske replikater nødvendige for at opnå statistisk signifikante resultater i forhold til metoden kolbe eller flaske. Vi har også brugt dette system med succes dyrker blandinger af alger og bakterier21. Foruden alger dyrkning skitsere vi en procedure til måling af neutrale lipid indhold i de dyrkede alger. Sidstnævnte metode har været offentliggjort andetsteds22, men vi omfatter proceduren her for at give en trinvis vejledning til, hvordan du anvender det med succes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies for airlift photobioreactor setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>16157-191</td>
			<td>For bottle reactors, humidifiers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2&#34; hose clamp</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>UC953A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; female luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FTLL360-6005</td>
			<td>1/4&#34; ID, PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; ID, 3/8&#34; OD autoclaveable PVC tubing</td>
			<td>Thermo-Nalgene</td>
			<td>63013-244</td>
			<td>50&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; in O-rings</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>1REC5</td>
			<td>#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239&#34; I.D., 0.379&#34;O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>FTLL230-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD autoclaveable PVC tubing</td>
			<td>Thermo-Nalgene</td>
			<td>63013-608</td>
			<td>250&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; male spinning luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>MLRL013-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; multiport barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>4PLL230-6005</td>
			<td>1/8&#34; multiport barb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; NPT to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>18230-6005</td>
			<td>1/8&#34; 200 series barb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; panel mount luer</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson MLRLB230-6005</td>
			<td>1/8&#34;, PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 gallon fish tank</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>802262</td>
			<td>Can hold up to 8 bioreactors depending on layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-13-SSV</td>
			<td>For bottle reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ft fluorescent light bank</td>
			<td>Agrobrite</td>
			<td>FLT24 T5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200-2500 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-14-SSV</td>
			<td>For air regulation upstream of humidifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Pyrex bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>16157-136</td>
			<td>For gas mixing after humidifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-500 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-12-SSV</td>
			<td>For hybridization tube reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-50 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-151-SSV</td>
			<td>For CO2 flow rate control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air filters 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman/ Fisher</td>
			<td>09-745-1A</td>
			<td>Polyvent, 28 mm, 0.2 &#181;m, PTFE, 50 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning lids for pyrex bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-233</td>
			<td>10 GL45 lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer endcap</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FTLLP-6005</td>
			<td>Female stable PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>32645-030</td>
			<td>35x300 mm, pack of 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light timer</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>556393626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locknuts</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson LNS-3</td>
			<td>1/4&#34;, red nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-690</td>
			<td>Low profile magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male luer endcap</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson LP4-6005</td>
			<td>Male plug PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning luer lock ring</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FSLLR-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars - long</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-040</td>
			<td>38.1 mm, for bottle reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars - medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-034</td>
			<td>25 mm, for hyridization tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies and reagents for culturing algae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-491</td>
			<td>13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Air-tite</td>
			<td>89215-216</td>
			<td>For filtering spent media from daily culture sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-482</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100x15 mm stackable petri dishes, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-276</td>
			<td>Sterile (or equivalent), polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Serological pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82051-584</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-298</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-348</td>
			<td>Sterile (or equivalent), polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>89089-578</td>
			<td>Polystyrene with lid, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inocculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-478</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid carbon dioxide tank and regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL bead tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10158-556</td>
			<td>Polypropylene tube w/ lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-774</td>
			<td>Polypropylene, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>550646751</td>
			<td>Only use regular bleach, not cleaning bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1109-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TCN0659-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vegetable oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>9276383</td>
			<td>Any vegetable oil should work as long as it is fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>Biospec products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XS205DU</td>
			<td>Capable of at least 4 decimal accuracy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead homogenizer</td>
			<td>Omni</td>
			<td>19-040E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop micro centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Heraeus Fresco 21 with 24x2</td>
			<td>Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75838-282</td>
			<td>Including dry block for a microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td>2.5L freeze drying system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Tissue</td>
			<td>Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2</td>
			<td>Capable of reading absorbance and fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of green microalgae in bubble column photobioreactors and an assay for neutral lipids

Der er betydelig interesse for studiet af mikroalger til engineering applikationer såsom fremstilling af biobrændsel, højværdiprodukter, og til behandling af affald. Som de fleste nye forskningsindsats begynder på laboratoriet skala, er der behov for omkostningseffektive metoder til dyrkning mikroalger på en reproducerbar måde. Her, kommunikerer vi en effektiv tilgang til kultur mikroalger i laboratoriet-skala photobioreactors, og at måle vækst og neutral lipid indhold af at alger. Vejledningen er også medtaget på hvordan man opsætter photobioreactor systemet. Selv om eksempel organismer er arter af Chlorella og Auxenochlorella, kan dette system tilpasses for at dyrke en bred vifte af mikroalger, herunder Co kulturer af alger med ikke-alger. Stock kulturer dyrkes først i flasker til at producere inokulum for photobioreactor system. Alger inokulum er koncentreret og overført til photobioreactors til dyrkning i batch-mode. Prøver indsamles dagligt for absorbansaflæsningerne. For enden af batch kultur celler er høstet af centrifuge, vasket, og fryse tørrede at opnå en endelig tørvægt koncentration. Den endelige tørvægt koncentration bruges til at skabe en sammenhæng mellem den optiske tæthed og tørvægt koncentration. En modificeret Folch metode bruges efterfølgende til at udtrække samlede indhold af lipider fra den frysetørrede biomasse og ekstraktet er analyseret for sin neutrale lipid indhold ved hjælp af en mikrotiterplade assay. Denne analyse har været offentliggjort tidligere, men protokollen trin indgik her for at fremhæve vigtige trin i den procedure, hvor der ofte opstår fejl. Den bioreaktor system beskrevet her udfylder en niche mellem simple kolbe dyrkning og fuldt kontrolleret kommercielle bioreaktorer. Selv med kun 3-4 biologiske replikater per behandling, vores tilgang til dyrkning af alger fører til stramme standardafvigelser i vækst og lipid-assays.

Denne procedure giver et tidsforløb af alge ekstinktionen data på OD 550 nm (figur 4A). Optisk tæthed og tørvægt koncentration data kan være korreleret (figur 4B). Dette opnås ved første beregning af den endelige tørvægt alger koncentration efter de freeze-drying trin. Næste, Ekstinktionen af kultur seriel fortynding (udføres på den sidste dag i prøvetagning) og de faktiske tørvægt koncentrationer kan være korrel...

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids at JoVE.com

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Vi præsenterer her, en protokol for at konstruere lab-skala boble kolonne photobioreactors og bruge dem til kultur mikroalger. Det giver også en metode til bestemmelse af kultur vækstrate og neutral lipid indhold.

Dyrkning af grøn mikroalger i boble kolonne Photobioreactors og en analyse for Neutral lipider

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Denne protokol indeholder instruktioner til konstruktion og brug af en Bubble Column Photobioreactor system til at vokse mikroalger, og bør være af interesse for alle, der studerer algel biobrændstoffer, spildevandsbehandling, eller algel biologi. Vi har fundet spirereaktorsystemet til at producere velrenommerede resultater. Reaktorsystemet kan også tilpasses en bred rang af alger og koster langt mindre end mange kommercielle tilbud.Demonstration af proceduren vil være Qichen Wang, en kandidat studerende fra mit laboratorium. For at begynde opsætningen af Bubble Column Photobioreactors, konstruere et sæt ventilerede låg fra plast låg af en liter glasflasker og hybridisering rør som beskrevet i tekstprotokollen. Slip en 1 / 4 tommer O ring over slidbaner af en 1/8th tommer panel mount lokke montering, og skub dette ind i 1 / 4 tommer hul boret i låget.Slip en anden 1/ 4 tommer over trådene, så låget er klemt inde mellem de to O ringe. Derefter glide en lås møtrik på trådene og stramme den til at fastsætte panelet mount lokke på plads. Nu snap at låse ringe på den udsatte mandlige lokke, projicere fra låget.Gentag denne procedure for hvert hul i låget. For låg, der vil blive brugt på Bubble Kolonne og flaske reaktorer, vedhæfte 1/8th tommer kvindelige lokke til modhager fittings til 1 1/2 tommer stykker af 1/8th tommer ID PVC slanger. Fastgør disse til hver af udsatte mandlige lokke fittings på låget.Tilslut en kontraventil til den frie ende af en af de 1/8th tommer stykker. Derefter tilslutte en mandlig lokke til modhager montering til det andet stykke 1/8th tommer slanger fremprojektering fra låget. Klik på den roterende låsering på plads og fastgør et 0,2 mikron luftfilter til dette.Compleat samling af luften levere systemet, akvarier, rør plader, og lys som fordømte det teksten protokol. Koncentrat den afviklede mikroalger lager ved at fjerne supernatent ved hjælp af en vakuumpumpe. Lad mindre end 100 milliliter medium i hver flaske, men undgå at fjerne afviklede alger.Algers gylle suspenderes og overføres til sterile 50 millilitercentrifugerør. Centrifuge 1,000 gange G i fem minutter for yderligere at koncentrere algerne. I biosikkerhedsskabet skal du fjerne nok supernatent til at opnå et samlet volumen på ca. 80 milliliter algerkoncentrater til 12 fotobioreaktorer.Undgå at støvsuge pellet. Overfør algkoncentratet til en steril beholder. Nu tilsættes seks milliliter alger gylle i hver fotobioreaktor med en steril 10 milliliter serologisk pipette.Hvirvle bioreaktorer til at blande alger i mediet. Der udtages en prøve på to milliliter fra hver bioreaktor ved hjælp af en serologisk pipette, og overføres til et rør med to milliliter. Indsamle en to milliliter prøve hver 24 timer til at overvåge kultur fremskridt.Prøven kontrolleres for ph ved hjælp af teststrips, og reaktoren justeres efter behov. Stram bioreaktorlågene, og læg alle bioreaktorer i vandbadet i akvariet. Juster befrugtning, kuldioxid og belysning til de relevante niveauer for arten.Bioreaktorpositionen roteres hver dag efter prøveudtagningen. Påfør 200 mikroliter af hver kulturprøve i tre eksemplarer på brønde af en 96 brøndmikroplade. Derefter måles optisk tæthed ved 550 nanometer og 680 nanometer.Mål en fast mængde algerkultur fra hver bioreaktor med en kandidatcylinder og overførsel i centrifugeflasker. Centrifuge kulturen 4, 696 gange G i fem minutter. Kassér supernatenten ved forsigtigt at støvsuge den ud.Pellets overføres til mærket 50 milliliterrør. Centrifugeflaskerne skylles med destilleret vand, og indholdet overføres til de 50 milliliterrør. Sørg for, at det samlede volumen ikke overstiger 45 milliliter.Efter vask af algiller som beskrevet i tekstprotokollen skal supernatenten kasseres. Derefter tilsættes 7,5 milliliter destilleret vand til hvert 50 milliliterrør. Nu vortex de 50 milliliter rør og overføre alger slurries i forvejede 15 milliliter rør.De 50 milliliterrør skylles med ekstra destilleret vand, og væsken overføres til de 15 milliliterrør, der holder det samlede volumen i disse rør på mindre end 12 milliliter. Efter centrifugering af de 15 milliliterrør og kassér supernatenten som før, fryses rørene med pellets ved minus 80 grader Celsius i mindst 30 minutter som forberedelse til frysetørring. Der tilsættes 1,5 milliliter folchopløsningsmiddel til hvert to milliliterrør, der indeholder 20 mg frysetørret alger.Hæld ca. 0,5 milliliter zirconia silicaperler i hvert rør, indtil væskeniveauet når to milliliter. Homogeniser algprøverne i en perlemølle i 20 sekunder med en hastighed på 6,5 meter i sekundet. Overfør rørene til is i 30 sekunder for at køle prøverne.Gentag derefter fem gange mere for fuldt ud at udtrække lipiderne. Homogenate gennem en fem milliliter sprøjte, der indeholder en rustfrit stål trådnet disk til at stamme ud perlerne, indsamling filtrate i en 15 milliliter rør. Vask perlerne med 1,5 milliliter folch opløsningsmiddel, skubbe væske igennem med syring efter behov.Denne vask gentages yderligere 2 gange, og alle filtrat i 15 milliliterrøret opsamler et endeligt volumen på ca. seks milliliter. Der tilsættes 1,2 milliliter 0,9 % natriumchloridopløsning til folchekstraktet i 15 milliliterrøret og vortex til at blande godt. Centrifuge de 15 milliliter rør på 6, 000 gange G i fem minutter.Det nederste chloroform-fasevolumen registreres til nærmeste 0,1 milliliter ved hjælp af linjer på siden af 15 milliliterrøret. Overfør derefter den nederste fase til et glas modbydeligt ved hjælp af en glasgræspipette. For at udføre den neutrale lipid assay, fortynde lipid ekstrakter og vegetabilsk olie standard tre gange med methanol.For hver fortyndet prøve tilsættes 80 mikroliter til en 96 brøndpoyylenmikroplade i firdobbelt. For opløsningsmiddel blank, anvende 80 mikroliter af folch opløsningsmiddel i firdolik. For standarder, tilsæt 10, 30, 60, 90 og 120 mikroliter af den fortyndede vegetabilske olie standard også i firdoliceret.Anlækker mikropladen i røghætten på et forvarmet tør blokvarmer ved 55 grader Celsius i 20 til 30 minutter, indtil alt opløsningsmiddel er fordampet. Fjern mikropladen fra varmeblokken, og lad den køle af til stuetemperatur. Derefter tilsættes 30 mikroliter isopropylalkohol til hver brønd og blandes ved pipettering op og ned.Sørg for, at alle pipettekanaler blander opløsningen og opsprænker lipiderne, hvilket giver en homogen grøn væske. Nu tilsættes 200 mikroliter af et mikrogram per milliliter en nile rød opløsning til hver brønd, og rør det op og ned 10 gange for at blande. Efter en fem minutters inkubation ved stuetemperatur, tilsæt 20 mikroliter af 50% blegemiddel opløsning til hver brønd, og rør det op og ned fem gange for at blande godt.Lad platen inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter 30 minutter læses lyssætningen i prøverne hvert femte til 10 minutter ved 530 nanometer excitation, 575 nanometer emission, med auto afskæringer indstillet til 570 nanometer, indtil signalet fra algprøverne stabiliserer sig. Denne procedure giver et tidsforløb af algeloptiske tæthedsdata ved OD 550 nanometer.Kontrolkulturer blev dyrket på frisk anate NH4 medium. Behandling et, er co-kulturer auxenochlorella protothecoides og azospirillum brasiliense dyrket på frisk medfødte NH4 medium. Behandling to, er en azinic A.Protothecoides dyrket på medfødte NH4 medium suppleret med 50 milligram per milliliter IAS, som helt hæmmet algevækst.Behandling tre, er azinic A.Protothecoides, dyrket på brugt medium fra A.Brasilienes. Vækstkurverne viser kulturer af auxenochlorella protothecoides ind i sen logaritmisk vækst ved 120 timer. Vist her er corelation kurver mellem den optiske tæthed ved 550 nanometer og den endelige tørvægt koncentration, ved hjælp af en anden ordre polynomial pasform.Endelig kan farvningen anvendes på tidsforløbets optiske tæthedsdata for at opnå en tørvægtvækstkurve. De samme behandlinger anvendes her, bortset fra at chlorella sorokiniana dyrkes i stedet for auxenochlorella protothecoides. Procent tørvægt neutral lipid opnået i den neutrale lipid assay korrelerer godt med triose glycerol indhold på en tilsvarende tyndt lag kromatografi plade.I modsætning til A.Protothecoides hæmmede IAA-behandlingen ikke C.Sorkinianas vækst. Efter lipidudvinding af algerne kan den resterende cellepalle analyseres for dens stivelses- og cellevægindhold, hvilket giver et mere detaljeret billede af energilagringsprodukter i cellen. De metoder, der er beskrevet her, har gjort det muligt at gøre nye opdagelser inden for algelbiobrændstoffer og spildevandsrensning.Specifikt, dette system er blevet brugt til bedre at forstå, hvordan bakterier påvirker algel vækst.

Research

JoVE Journal

Environment

Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Analyse af Fatty Acid indhold og sammensætning i mikroalger

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimer Røggas indstillinger for at fremme mikroalger Vækst i fotobioreaktorer via computersimuleringer

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Transcript og Metabolit Profilering for Vurdering af tobak Tree og Poppel som råvare til Bio-industri

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Kvantificering af tungmetaller og andre uorganiske forureninger på produktivitet mikroalger

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måling og kortlægning mønstre af jorderosion og Deposition relateret til jordbunden karbonat koncentrationer Under landbrugsdrift

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Kollektion og udvinding af erhvervsmæssig Luftprøver til analyse af svampe DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plante infektion Test: Spray og sår-medieret podning med plante patogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

En anaerob Biosensor Assay til påvisning af kviksølv og Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Påvisning af Tilapia søen Virus ved hjælp af konventionelle RT-PCR og SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Kemiske Isolation, kvantificering og adskillelse af huden lipider fra krybdyr

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...