Name: cultivation of green microalgae in bubble column photobioreactors and an assay for neutral lipids
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids at JoVE.com

Diese Forschung wurde von USDA nationalen Institut für Ernährung und Landwirtschaft Luke Projekt ALA0HIGGINS und Auburn Universität Büros der Propstei, Vizepräsident für Forschung und Samuel Ginn College of Engineering unterstützt. Auch wurde unterstützt durch NSF CBET 1438211 zu gewähren.

1. Aufbau der Blase Spalte Photobioreaktoren
<ol><li>Konstruieren Sie eine Reihe von belüfteten Deckeln aus Kunststoff-Deckel, die kam mit 1 L Glasflaschen und Hybridisierung Rohre (siehe Abbildung 1 für Schaltplan und Fotos). Deckel für Luftbefeuchter, mischen, Trap, jede Luft-Lift-Photobioreaktor und jede Flasche-Reaktor zu bauen.<ol>
<li>¼" Löcher in den Deckel Bohren: 2 Löcher sind erforderlich für Bioreaktor und Luftbefeuchter Deckel; 3 Löcher sind für die Rührschüssel Fall...

<ol>
	<li>Prandini, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+nutrient+removal+from+swine+wastewater+digestate+coupled+to+biogas+purification+by+microalgae+Scenedesmus+spp.">Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp.</a> Bioresource Technology. , 67-75 (2016).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoremediation+of+dairy+and+winery+wastewater+using+Diplosphaera+sp.+MM1.">Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1.</a> Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).</li><li>Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. 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M., VanderGheynst, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+assay+for+quantitation+of+neutral+lipids+in+extracts+from+microalgae.">Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae.</a> Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).</li><li>Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+elevated+CO2+concentration+on+the+quality+of+algal+starch+as+a+potential+biofuel+feedstock.">The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informatics+for+improved+algal+taxonomic+classification+and+research:+A+case+study+of+UTEX+2341.">Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341.</a> Algal Research. 12, 545-549 (2015).</li><li>Garrett, R. H., Grisham, C. 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Die wichtigste Überlegung bei der Kultivierung von Algen ist ein Verständnis für die spezifischen Bedürfnisse des Organismus oder der Gruppe von Organismen. Die Algen Anbausystem hier beschriebenen kann verwendet werden, um eine breite Palette von Algen aber die spezifischen abiotischen Faktoren (Temperatur, Medien, pH-Wert, Lichtintensität, CO-2 -Ebene, Belüftung Rate) Kultur auf die Bedürfnisse des Organismus angepasst werden müssen. Hinweis: die hier beschriebenen Parameter für den Anbau von Ch...

Die Anwendung von Mikroalgen in Technik und Biotechnologie hat großes Interesse in den letzten Jahren angezogen. Mikroalgen werden für den Einsatz in Abwasser Behandlung1,2,3,4, Biofuel Produktion5,6,7,8, untersucht und die Herstellung von Nutraceuticals und andere hochwertige Produkte9,10. Algen sind auch größere Preisen in dem Bemühen zur Verbesserung der Fitness für spezielle technische Anwendungen11,12genmanipuliert sein. Infolgedessen gibt es großes Interesse am Experimentieren mit industriell relevante Organismen in kontrollierter Einstellungen. Der Zweck dieser Methode ist, einen effektiven Ansatz zur Kultur Mikroalgen in einer kontrollierten Laborumgebung zu kommunizieren und um das Wachstum und die neutralen Lipidgehalt dieser Algen zu messen. Verbesserung des Wachstums raten und neutrale Lipidgehalt der Mikroalgen als zwei wichtigsten Engpässe in Richtung Kommerzialisierung von Algen Biokraftstoffe13eingestuft wurden.
Eine Vielzahl von Ansätzen wurden verwendet, um Kultur-Algen um zu Versuchszwecken. Im Allgemeinen können diese Ansätze großflächigen Anbau im Freien und kleine indoor-Anbau aufgeteilt werden. Freilandkultur in Photobioreaktoren und offene Teiche eignet sich für Experimente zur Aufstockung der Prozesse, die bereits im Labormaßstab (z. B. testen Sie Scale-Up von einen neuen High-Lipid-Stamm von Algen) nachweislich14. Aber kleine indoor-Anbau eignet sich bei der Entwicklung neuer oder verbesserter Algen Stämme oder Durchführung von Experimenten darauf abzielen, das Verständnis biologischer Mechanismen. In diesen letzteren Fällen ist eine hohe experimentelle Kontrolle erforderlich, um subtile Veränderungen im biologischen Verhalten herauskitzeln. Zu diesem Zweck müssen die axenic Kulturen häufig zur Minimierung der komplexen biotischen Faktoren im Zusammenhang mit anderen Organismen (z. B. Bakterien, andere Algen), die unweigerlich in Großanlagen im Freien wachsen. Auch wenn Wechselwirkungen zwischen Algen und andere Organismen zu studieren, haben wir festgestellt, dass Verwendung von hoch-kontrollierten Versuchsbedingungen hilfreich ist, bei der Untersuchung von molekularen Austausch zwischen Organismen15,16,17.
Innerhalb der Kategorie der kleinen indoor Algenkultivierung wurden verschiedene Ansätze verwendet. Vielleicht ist der am häufigsten verwendete Ansatz wachsen Algen im Erlenmeyerkolben auf einem Shaker Tisch unter einer leichten Bank18,19. Austausch von Sauerstoff und CO2 erfolgt durch passive Diffusion durch ein Schaum Plug-in der Spitze des Kolbens. Einige Forscher haben dieses Set-up durch aktive Lüftung der Kolben20verbessert. Ein anderer Ansatz ist, Algen in Flaschen, gemixt von Stir Bar und aktive Belüftung zu kultivieren. Trotz ihrer Schlichtheit haben wir festgestellt, dass die Verwendung von Flaschen und Flaschen oft zu inkonsistenten Ergebnissen unter biologischen repliziert führt. Dies ist vermutlich auf Positionseffekte - Positionen erhalten unterschiedliche Mengen an Licht, die auch interne Reaktor Temperaturen beeinflussen. Tägliche Rotation der Reaktoren auf neue Positionen können helfen, aber ist nicht das Problem lindern, weil bestimmte Stadien der Algenwachstum (z. B. früh exponentielle) sind empfindlicher gegenüber positionellen Effekte als andere (z. B. Log-Phase).
Auf der gegenüberliegenden Seite des Spektrums der technische Raffinesse sind kommerzielle Photobioreaktoren vollständig kontrolliert. Diese Systeme kontinuierlich überwachen und Anpassen von Bedingungen im Reaktor, Algenwachstum zu optimieren. Sie haben programmierbare Beleuchtung, Echtzeit-Temperaturregelung und die Kontrolle des pH-Werts. Leider, sie sind teuer und Kosten in der Regel mehrere tausend Dollar pro Reaktor. Die meisten wissenschaftliche und technische Zeitschriften erfordern biologische Replikation der Ergebnisse erfordern den Kauf mehrere Bioreaktoren. Wir stellen Ihnen hier eine Blase Spalte Reaktorsystem, Brücken, nähert sich die Kluft zwischen den einfachen (Kolben) und anspruchsvolle (vollständig kontrolliert Bioreaktor) für Labor-Maßstab Algenzucht. Blase Spalten verwenden steigende Gasblasen zu erleichtern Gasaustausch und Mischen des Reaktors. Dieser Ansatz bietet ein gewisses Maß an Kontrolle über die Beleuchtung und die Temperatur aber tut dies in einer Weise, die kostengünstig ist. Darüber hinaus fanden wir dieses System sehr konsistente Ergebnisse unter biologischen Wiederholungen reduziert die erforderliche Anzahl von biologischen Wiederholungen notwendig, um statistisch signifikante Ergebnisse im Vergleich zu der Flasche oder Flasche Ansatz zu erhalten. Wir haben dieses System auch verwendet, um Mischungen aus Algen und Bakterien21erfolgreich zu kultivieren. Neben der Algenzucht beschreiben wir ein Verfahren zur Messung der neutralen Fettgehalt in den kultivierten Algen. Die letztere Methode wurde an anderer Stelle veröffentlicht22, aber wir gehören das Verfahren hier um Schritt für Schritt Anleitungen wie man es erfolgreich einsetzen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies for airlift photobioreactor setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>16157-191</td>
			<td>For bottle reactors, humidifiers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2&#34; hose clamp</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>UC953A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; female luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FTLL360-6005</td>
			<td>1/4&#34; ID, PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; ID, 3/8&#34; OD autoclaveable PVC tubing</td>
			<td>Thermo-Nalgene</td>
			<td>63013-244</td>
			<td>50&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; in O-rings</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>1REC5</td>
			<td>#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239&#34; I.D., 0.379&#34;O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>FTLL230-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD autoclaveable PVC tubing</td>
			<td>Thermo-Nalgene</td>
			<td>63013-608</td>
			<td>250&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; male spinning luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>MLRL013-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; multiport barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>4PLL230-6005</td>
			<td>1/8&#34; multiport barb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; NPT to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>18230-6005</td>
			<td>1/8&#34; 200 series barb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; panel mount luer</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson MLRLB230-6005</td>
			<td>1/8&#34;, PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 gallon fish tank</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>802262</td>
			<td>Can hold up to 8 bioreactors depending on layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-13-SSV</td>
			<td>For bottle reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ft fluorescent light bank</td>
			<td>Agrobrite</td>
			<td>FLT24 T5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200-2500 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-14-SSV</td>
			<td>For air regulation upstream of humidifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Pyrex bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>16157-136</td>
			<td>For gas mixing after humidifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-500 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-12-SSV</td>
			<td>For hybridization tube reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-50 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-151-SSV</td>
			<td>For CO2 flow rate control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air filters 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman/ Fisher</td>
			<td>09-745-1A</td>
			<td>Polyvent, 28 mm, 0.2 &#181;m, PTFE, 50 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning lids for pyrex bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-233</td>
			<td>10 GL45 lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer endcap</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FTLLP-6005</td>
			<td>Female stable PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>32645-030</td>
			<td>35x300 mm, pack of 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light timer</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>556393626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locknuts</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson LNS-3</td>
			<td>1/4&#34;, red nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-690</td>
			<td>Low profile magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male luer endcap</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson LP4-6005</td>
			<td>Male plug PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning luer lock ring</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FSLLR-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars - long</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-040</td>
			<td>38.1 mm, for bottle reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars - medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-034</td>
			<td>25 mm, for hyridization tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies and reagents for culturing algae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-491</td>
			<td>13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Air-tite</td>
			<td>89215-216</td>
			<td>For filtering spent media from daily culture sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-482</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100x15 mm stackable petri dishes, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-276</td>
			<td>Sterile (or equivalent), polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Serological pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82051-584</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-298</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-348</td>
			<td>Sterile (or equivalent), polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>89089-578</td>
			<td>Polystyrene with lid, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inocculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-478</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid carbon dioxide tank and regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL bead tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10158-556</td>
			<td>Polypropylene tube w/ lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-774</td>
			<td>Polypropylene, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>550646751</td>
			<td>Only use regular bleach, not cleaning bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1109-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TCN0659-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vegetable oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>9276383</td>
			<td>Any vegetable oil should work as long as it is fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>Biospec products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XS205DU</td>
			<td>Capable of at least 4 decimal accuracy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead homogenizer</td>
			<td>Omni</td>
			<td>19-040E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop micro centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Heraeus Fresco 21 with 24x2</td>
			<td>Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75838-282</td>
			<td>Including dry block for a microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td>2.5L freeze drying system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Tissue</td>
			<td>Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2</td>
			<td>Capable of reading absorbance and fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of green microalgae in bubble column photobioreactors and an assay for neutral lipids

Es gibt großes Interesse an der Studie von Mikroalgen für technische Anwendungen wie etwa die Herstellung von Biokraftstoffen, hochwertigen Produkten, und für die Behandlung von Abfällen. Wie die meisten neuen Forschungsanstrengungen im Labormaßstab beginnen, gibt es eine Notwendigkeit für kostengünstige Methoden zur Kultivierung von Mikroalgen reproduzierbar. Hier kommunizieren wir einen effektiven Ansatz zur Kultur Mikroalgen im Labormaßstab Photobioreaktoren, und das Wachstum und die neutralen Lipidgehalt dieser Algen zu messen. Anweisungen sind auch zum Einrichten des Photobioreaktor-Systems enthalten. Obwohl die Beispiel Organismen Arten von Chlorella und Auxenochlorellasind, kann dieses System angepasst werden, um eine Vielzahl von Mikroalgen, einschließlich Ko-Kulturen von Algen mit Algenarten zu kultivieren. Stammkulturen sind zum ersten Mal in Flaschen, Inokulum für das Photobioreaktor-System zu produzieren angebaut. Algen-Inokulum ist konzentriert und in Photobioreaktoren zur Kultivierung im Batch-Modus übertragen. Proben werden täglich für die optische Dichte-Messwerte gesammelt. Am Ende der Batch-Kultur Zellen werden geerntet, indem Zentrifuge gewaschen, und gefriergetrocknet, eine endgültige Trockengewicht Konzentration zu erhalten. Die endgültige Trockengewicht Konzentration wird verwendet, um eine Korrelation zwischen der optischen Dichte und das Trockengewicht Konzentration zu erstellen. Eine modifizierte Folch Methode wird anschließend verwendet, um insgesamt Lipide aus gefriergetrockneten Biomasse zu extrahieren und der Extrakt ist für seine neutrale Fettgehalt mit einer Mikrotestplatte Assay untersucht. Dieser Assay ist bisher erschienen aber Protokoll Schritte wurden hier aufgenommen, um kritische Schritte des Verfahrens zu markieren, wo häufig Fehler auftreten. Die hier beschriebenen Bioreaktorsystem füllt eine Nische zwischen einfachen Flasche Anbau und kommerziellen Bioreaktoren vollständig kontrolliert. Sogar mit nur 3-4 biologische repliziert pro Behandlung, unser Ansatz zur Kultivierung von Algen führt zu engen Standardabweichungen in der Wachstums- und Lipid-Assays.

Diese Prozedur ergibt einen zeitlichen Verlauf der Algen optische Dichte Daten bei OD 550 nm (Abb. 4A). Die optische Dichte und Trockengewicht Konzentration Daten korreliert (Abbildung 4 b). Dies wird erreicht durch die erste Berechnung der endgültigen Trockengewicht Algen Konzentration nach der Gefriertrocknung Schritt. Als nächstes kann die optische Dichte der Kultur serielle Verdünnung (durchgeführt am letzten Tag der Prob...

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Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Labormaßstab Blase Spalte Photobioreaktoren zu konstruieren und zu Kultur Mikroalgen zu verwenden. Es bietet auch eine Methode zur Bestimmung der Wachstumsrate Kultur und neutrale Lipidgehalt.

Anbau von grünen Mikroalgen in Bubble Spalte Photobioreaktoren und ein Test für neutrale Lipide

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für den Bau und die Verwendung eines Bubble Column Photobioreaktor-Systems zum Anbau von Mikroalgen und sollte für jeden von Interesse sein, der Algel-Biokraftstoffe, Abwasserbehandlung oder Algelbiologie studiert. Wir haben das Turmreaktorsystem gefunden, um hoch angesehene Ergebnisse zu erzielen. Das Reaktorsystem ist auch an ein breites Algengewirr anpassbar und kostet weit weniger als viele kommerzielle Angebote.Demonstriert wird das Verfahren von Qichen Wang, einem Doktoranden aus meinem Labor. Um mit dem Aufbau der Bubble Column Photobioreaktors zu beginnen, konstruieren Sie einen Satz belüfteter Deckel aus den Kunststoffdeckeln der Einliter-Glasflaschen und Hybridisierungsrohre, wie im Textprotokoll beschrieben. Schieben Sie einen 1/4 Zoll O-Ring über die Stufen einer 1/8-Zoll-Panel-Köder-Fitting-Fitting, und schieben Sie dies in das 1/4 Zoll Loch in den Deckel gebohrt.Schieben Sie einen zweiten 1/4 Zoll über die Gewinde, so dass der Deckel zwischen den beiden O-Ringen eingeklemmt ist. Dann schieben Sie eine Verriegelungsmutter auf die Fäden und ziehen Sie sie fest, um die Platte montieren Köder an Ort und Stelle zu fixieren. Jetzt schnappen, um Ringe auf den exponierten männlichen Köder zu sperren, projiziert aus dem Deckel.Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Loch im Deckel. Für Deckel, die auf der Blasensäule und Flaschenreaktoren verwendet werden, befestigen Sie 1/8 Zoll weibliche Köder an Barb Armaturen an 1 1/2 Zoll Stücke von 1/8 Zoll ID PVC-Schläuche. Befestigen Sie diese an jeder der freiliegenden männlichen Köderarmaturen auf dem Deckel.Schließen Sie ein Rückschlagventil an das freie Ende eines der 1/8 Zoll-Stücke an. Dann verbinden Sie einen männlichen Köder mit Widerhaken, die mit dem zweiten Stück 1/8 Zoll Schlauch projiziert aus dem Deckel. Klicken Sie auf den rotierenden Verriegelungsring und befestigen Sie einen 0,2-Mikron-Luftfilter daran.Compleat Montage der Luft liefern System, Fischtanks, Rührplatten und Lichter, wie es das Textprotokoll. Konzentrieren Sie den abgesetzten Mikroalgenbestand, indem Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe entfernen. Lassen Sie weniger als 100 Milliliter Medium in jeder Flasche, aber vermeiden Sie das Entfernen von sesshaften Algen.Die Algenschlämme aufhängen und in sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen übertragen. Zentrifuge 1.000 mal G für fünf Minuten, um die Algen weiter zu konzentrieren. Entfernen Sie im Biosicherheitsschrank genügend Überstand, um ein Gesamtvolumen von ca. 80 MilliliterAlgenkonzentraten für 12 Photobioreaktoren zu erreichen.Vermeiden Sie das Absaugen des Pellets. Das Algenkonzentrat in einen sterilen Behälter geben. Fügen Sie nun sechs Milliliter Algenschlämme in jeden Photobioreaktor mit einer sterilen 10 Milliliter serologischen Pipette hinzu.Die Bioreaktoren verwirbeln, um Algen in das Medium zu mischen. Ziehen Sie eine Zwei-Milliliter-Probe aus jedem Bioreaktor mit einer serologischen Pipette und übertragen Sie in ein Zwei-Milliliter-Rohr. Sammeln Sie alle 24 Stunden eine Zwei-Milliliter-Probe, um den Kulturfortschritt zu überwachen.Überprüfen Sie die Probe anhand von Teststreifen auf ph und passen Sie den Reaktor nach Bedarf an. Ziehen Sie die Bioreaktordeckel an und legen Sie alle Bioreaktoren in das Fischtank-Wasserbad. Passen Sie belüftung, Kohlendioxid und Beleuchtung auf die entsprechenden Werte für die Art an.Drehen Sie die Position des Bioreaktors jeden Tag nach der Probenahme. Tragen Sie 200 Mikroliter jeder Kulturprobe in dreifacher Auslage auf Die Brunnen einer 96-Well-Mikroplatte auf. Messen Sie dann die optische Dichte mit 550 Nanometern und 680 Nanometern.Messen Sie ein festes Volumen der Algenkultur aus jedem Bioreaktor mit einem Graduiertenzylinder und transferieren Sie in Zentrifugenflaschen. Zentrifugieren Sie die Kultur 4, 696 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn sorgfältig aussaugen.Übertragen Sie die Pellets in beschriftete 50-Milliliter-Rohre. Spülen Sie die Zentrifugenflaschen mit destilliertem Wasser und übertragen Sie den Inhalt in die 50 Milliliter-Rohre. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 45 Milliliter nicht überschreitet.Nach dem Waschen der Algenpellets, wie im Textprotokoll beschrieben, entsorgen Sie das Überstand. Dann fügen Sie 7,5 Milliliter destilliertes Wasser zu jedem 50 Milliliter Rohr hinzu. Nun wirbeln die 50-Milliliter-Röhren aus und übertragen Die Algenschlämme in vorgewogene 15 Milliliter-Röhren.Spülen Sie die 50 Milliliter-Rohre mit zusätzlichem destilliertem Wasser und übertragen Sie die Flüssigkeit auf die 15 Milliliter-Rohre, wobei das Gesamtvolumen in diesen Röhren auf weniger als 12 Milliliter bleibt. Nach zentrifugieren der 15 Milliliter-Rohre und Wegwerfen des Überstandes wie bisher, die Rohre mit Pellets bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten einfrieren, um sich auf die Gefriertrocknung vorzubereiten. Fügen Sie 1,5 Milliliter Folchlösungsmittel in jede zwei Milliliter Tube mit 20 Milligramm gefriergetrockneten Algen.Gießen Sie etwa 0,5 Milliliter Zirkonia-Kieselsäure-Perlen in jedes Rohr, bis der Flüssigkeitsstand zwei Milliliter erreicht. Homogenisieren Sie die Algenproben in einer Perlenmühle für 20 Sekunden mit einer Geschwindigkeit von 6,5 Metern pro Sekunde. Übertragen Sie die Rohre für 30 Sekunden auf Eis, um die Proben zu kühlen.Wiederholen Sie dann fünf weitere Male, um die Lipide vollständig zu extrahieren. Filtern Sie das Homogenat durch eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer Edelstahl-Drahtgitterscheibe, um die Perlen zu belasten und Filtrat in einem 15-Milliliter-Rohr zu sammeln. Waschen Sie die Perlen mit 1,5 Milliliter Folch-Lösungsmittel, drücken Sie Flüssigkeit durch mit dem Syring nach Bedarf.Wiederholen Sie diese Wäsche 2 weitere Male und sammeln Sie alle Filtrat in der 15 Milliliter Tube, was zu einem Endvolumen von etwa sechs Millilitern. Fügen Sie 1,2 Milliliter 0,9%Natriumchloridlösung in den Folh-Extrakt in der 15-Milliliter-Röhre hinzu und Wirbel gut zu mischen. Zentrifugieren Sie die 15 Milliliter-Röhren bei 6.000 mal G für fünf Minuten.Zeichnen Sie das Volumen der unteren Chloroform-Phase auf die nächsten 0,1 Milliliter mit Linien an der Seite des 15-Milliliter-Rohrs auf. Dann die untere Phase mit einer Glasweidepipette auf einen Glasteufel übertragen. Um den neutralen Lipidtest durchzuführen, verdünnen Sie die Lipidextrakte und pflanzenölStandard dreifach mit Methanol.Für jede verdünnte Probe fügen Sie 80 Mikroliter zu einer 96 Well Polypropylen Mikroplatte in Quadruplikat hinzu. Für das Lösungsmittel roh, 80 Mikroliter Folchlösungsmittel in Quadruplikat auftragen. Für Normen, fügen Sie 10, 30, 60, 90 und 120 Mikroliter des verdünnten Pflanzenöl-Standard auch in Quadruplicate.Legen Sie die Mikroplatte in die Dunstabzugshaube auf einen vorgeheizten Trockenblockheizer bei 55 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft ist. Entfernen Sie die Mikroplatte aus dem Heizblock und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Dann fügen Sie 30 Mikroliter Isopropylalkohol zu jedem Brunnen und mischen durch Pipettieren nach oben und unten.Stellen Sie sicher, dass alle Pipettenkanäle die Lösung mischen und die Lipide wieder aufhängen, was zu einer homogenen grünen Flüssigkeit führt. Fügen Sie nun 200 Mikroliter eines Mikrogramms pro Milliliter eine nilerote Lösung zu jedem Brunnen hinzu, und pfeifen Sie sie 10 Mal nach oben und unten, um sie zu mischen. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur 20 Mikroliter 50% Bleichlösung zu jedem Brunnen hinzufügen und fünfmal nach oben und unten pfeifen, um sie gut zu vermischen.Lassen Sie die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur brüten. Nach 30 Minuten lesen Sie die Blütenstände in den Proben alle fünf bis zehn Minuten bei 530 Nanometern Anregung, 575 Nanometer Emission, wobei die Auto-Cut-Offs auf 570 Nanometer eingestellt sind, bis sich das Signal der Algenproben stabilisiert. Dieses Verfahren ergibt einen Zeitlichen Verlauf der algel optischen Dichtedaten bei OD 550 Nanometern.Kontrollkulturen wurden auf frischem nh4 Medium angebaut. Behandlung eins, ist Ko-Kulturen Auxenochlorella Protothekoide und Azospirillum brasiliense auf frisch angeborenen NH4 Medium angebaut. Behandlung zwei, ist ein azinic A.Protothecoides auf angeborenen NH4 Medium angebaut mit 50 Milligramm pro Milliliter IAA ergänzt, die das Algenwachstum vollständig hemmte.Behandlung drei, ist azinic A.Protothecoides, auf verbrauchten Medium aus A.Brasilienes angebaut. Die Wachstumskurven zeigen Kulturen von Auxenochlorella-Protothekisiden, die mit 120 Stunden spätlogarithmisches Wachstum aufnehmen. Hier sind Die Hiergezeigten sind Die Korelationskurven zwischen der optischen Dichte bei 550 Nanometern und der endgültigen Trockengewichtskonzentration unter Verwendung einer Polynompassung zweiter Ordnung.Schließlich kann die Färbung auf die optischen Dichtedaten des Zeitverlaufs angewendet werden, um eine Trockengewichtswachstumskurve zu erhalten. Die gleichen Behandlungen werden hier verwendet, mit der Ausnahme, dass Chlorella sorokiniana anstelle von Auxenochlorella-Protothekoiden kultiviert wird. Prozent Trockengewicht neutrales Lipid, das im neutralen Lipidtest gewonnen wird, korreliert gut mit dem Trioseglyceringehalt auf einer entsprechenden Dünnschichtchromatographieplatte.Im Gegensatz zu A.Protothecoides hemmte die IAA-Behandlung das C.Sorkiniana-Wachstum nicht. Nach der Lipidextraktion der Algen kann die verbleibende Zellpalette auf ihren Stärke- und Zellwandgehalt analysiert werden, um ein detaillierteres Bild der Energiespeicherprodukte innerhalb der Zelle zu liefern. Die hier beschriebenen Methoden haben neue Entdeckungen im Bereich der Algel-Biokraftstoffe und der Abwasserbehandlung ermöglicht.Insbesondere wurde dieses System verwendet, um besser zu verstehen, wie Bakterien das Algelwachstum beeinflussen.

Research

JoVE Journal

Environment

Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Die Analyse der Fettsäuregehalt und Zusammensetzung in Mikroalgen

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

Forschung

Umwelt

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimieren Rauchgas Einstellungen, um Mikroalgen in Photobioreaktoren Wachstum über Computer-Simulationen fördern

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Transcript und Metabolite Profiling für die Beurteilung von Tabakbaum und Pappel als Rohstoff für die Bio-basierte Industrie

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Quantifizierung von Schwermetallen und anderen anorganischen Kontaminanten auf die Produktivität von Mikroalgen

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Messung und Mapping-Muster von Erosion und Ablagerung im Zusammenhang mit Boden-Karbonat-Konzentrationen unter Landbewirtschaftung

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Die Pflanze-Infektion-Test: Spray und Wunde-vermittelten Inokulation mit Pflanzen Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Eine anaerobe Biosensor-Test zum Nachweis von Quecksilber und Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Chemische Isolierung, Quantifizierung und Trennung von Hautlipiden Reptilien

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...