Name: cultivation of green microalgae in bubble column photobioreactors and an assay for neutral lipids
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids at JoVE.com

Støtte for denne forskningen ble levert av USDA National Institute of Food og landbruk Luke prosjektet ALA0HIGGINS og Auburn University kontorene til Prost, direktør for forskning og i Samuel Ginn College of Engineering. Støtte ble også levert av NSF gi CBET-1438211.

1. oppsett av boble kolonnen Photobioreactors
<ol><li>Konstruere en rekke ventilerte dekslene fra plast dekslene som kom med 1 L glassflasker og hybridisering rør (se figur 1 for skjematisk og bilder). Konstruere lokk luftfukter, blande felle, hver air lift photobioreactor og hver flaske reaktoren.<ol>
<li>Bore ¼" hull i lokket: 2 hull er nødvendig for bioreactor og luftfukter lokk; 3 hull er nødvendig for miksing fellen.</li>
		<li>Ta en ¼" O-ring over trådene av en 1/8â€ panel m...

<ol>
	<li>Prandini, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+nutrient+removal+from+swine+wastewater+digestate+coupled+to+biogas+purification+by+microalgae+Scenedesmus+spp.">Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp.</a> Bioresource Technology. , 67-75 (2016).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoremediation+of+dairy+and+winery+wastewater+using+Diplosphaera+sp.+MM1.">Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1.</a> Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).</li><li>Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dairy+Wastewaters+for+Algae+Cultivation,+Polyhydroxyalkanote+Reactor+Effluent+Versus+Anaerobic+Digester+Effluent.">Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent.</a> BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).</li><li>Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+a+native+alga+for+biomass+and+biofuel+accumulation+in+coal+bed+methane+production+water.">Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water.</a> Algal Research. 19, 63-68 (2016).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil+accumulation+mechanisms+of+the+oleaginous+microalga+Chlorella+protothecoides+revealed+through+its+genome,+transcriptomes,+and+proteomes.">Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes.</a> BMC Genomics. 15, (2014).</li><li>Burch, A. R., Franz, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+nitrogen+limitation+and+hydrogen+peroxide+treatment+enhances+neutral+lipid+accumulation+in+the+marine+diatom+Phaeodactylum+tricornutum.">Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum.</a> Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).</li><li>Brennan, L., Owende, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofuels+from+microalgae--A+review+of+technologies+for+production,+processing,+and+extractions+of+biofuels+and+co-products.">Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products.</a> Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).</li><li>Branyikova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microalgae+-+Novel+highly+efficient+starch+producers.">Microalgae - Novel highly efficient starch producers.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).</li><li>Chalima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+Volatile+Fatty+Acids+from+Microalgae+for+the+Production+of+High+Added+Value+Compounds.">Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds.</a> Fermentation. 3 (4), (2017).</li><li>Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprocess+engineering+of+microalgae+to+produce+a+variety+of+consumer+products.">Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+method+for+genetic+transformation+of+the+green+alga+Chlorella+ellipsoidea.">Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutate+Chlorella+sp.+by+nuclear+irradiation+to+fix+high+concentrations+of+CO2.">Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2.</a> Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).</li><li>Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techno-economic+analysis+of+autotrophic+microalgae+for+fuel+production.">Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production.</a> Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).</li><li>Sales, C. M., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Scale+in+a+Photosynthetic+Reactor+System+for+Algal+Remediation+of+Wastewater.">Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).</li><li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofactor+symbiosis+for+enhanced+algal+growth,+biofuel+production,+and+wastewater+treatment.">Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment.</a> Algal Research. 17, 308-315 (2016).</li><li>Higgins, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal-bacterial+synergy+in+treatment+of+winery+wastewater.">Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater.</a> Nature Clean Water. 1 (6), (2017).</li><li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+thiamine+metabolites+and+spent+medium+from+Chlorella+sorokiniana+on+metabolism+in+the+green+algae+Auxenochlorella+prototheciodes.">Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes.</a> Algal Research. 33, 197-208 (2018).</li><li>L&#233;pinay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+insight+on+interactions+between+bacteria+and+the+marine+diatom+Haslea+ostrearia:+Algal+growth+and+metabolomic+fingerprinting.">First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting.</a> Algal Research. 31, 395-405 (2018).</li><li>Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+three+microalgae+strains+and+nutrient+removal+from+an+agro-zootechnical+digestate.">Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate.</a> Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).</li><li>Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azospirillum+brasilense+Increases+CO2+Fixation+on+Microalgae+Scenedesmus+obliquus,+Chlorella+vulgaris,+and+Chlamydomonas+reinhardtii+Cultured+on+High+CO2+Concentrations.">Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations.</a> Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).</li><li>Higgins, B., VanderGheynst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Escherichia+coli+on+mixotrophic+growth+of+Chlorella+minutissima+and+production+of+biofuel+precursors.">Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors.</a> PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).</li><li>Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+assay+for+quantitation+of+neutral+lipids+in+extracts+from+microalgae.">Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae.</a> Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).</li><li>Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+elevated+CO2+concentration+on+the+quality+of+algal+starch+as+a+potential+biofuel+feedstock.">The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informatics+for+improved+algal+taxonomic+classification+and+research:+A+case+study+of+UTEX+2341.">Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341.</a> Algal Research. 12, 545-549 (2015).</li><li>Garrett, R. H., Grisham, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , 578-730 (2012).</li><li>de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -. P., Bashan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorella+sorokiniana+UTEX+2805,+a+heat+and+intense,+sunlight-tolerant+microalga+with+potential+for+removing+ammonium+from+wastewater.">Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater.</a> Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).</li><li>Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual International Meeting of the ASABE. , (2018).</li></ol>

Det viktigste hensynet når dyrking alger er en forståelse av behovene til organisme eller gruppe organismer. Algene dyrking systemet beskrevet her kan brukes å kulturen en rekke alger men bestemte abiotiske faktorer (temperatur, media, pH, lysintensitet, CO2 -nivå, lufting rate) må justeres for organismen. Merk parameterne som beskrives her ble brukt til dyrking av Chlorella og Auxenochlorella. Disse organismene er industrielle interessante fordi de er tolerante høyt næringsinnhold, ly...

Anvendelsen av mikroalger i ingeniørfag og bioteknologi har tiltrukket stor interesse i de senere år. Mikroalger blir undersøkt for bruk i avløpsvann behandling1,2,3,4, biodrivstoff produksjon5,6,7,8, og produksjon av nutraceuticals og andre høy verdi produkter9,10. Alger er også genetisk endres til høyere priser i et forsøk på å forbedre deres egnethet for bestemte tekniske programmer11,12. Dermed er det stor interesse eksperimentering med industrielt relevante organismer i kontrollerte innstillinger. Formålet med denne metoden er å kommunisere effektiv tilnærming til kultur mikroalger i et kontrollert laboratoriemiljø og måle vekst og nøytrale lipid innhold av at alger. Forbedre vekst priser og nøytrale lipid innhold av mikroalger har blitt identifisert som to viktige flaskehalser mot kommersialisering av alger biodrivstoff13.
En rekke tilnærminger har blitt brukt til kultur alger for eksperimentelle formål. Generelt, kan disse metodene deles mellom store utendørs dyrking og småskala innendørs dyrking. Utendørs dyrking i photobioreactors og åpne dammer er egnet for eksperimentering å skalere opp prosesser som er allerede påvist i laboratoriet skala (f.eks å teste skalaen opp av en ny høy-lipid stamme av alger)14. Men innendørs småskala dyrking er egnet når utvikle nye eller forbedrede alger stammer eller utføre eksperimenter sikte på å forstå biologiske mekanismer. I disse siste tilfellene, er en høy grad av eksperimentelle kontroll nødvendig å tease ut subtile endringer i biologisk atferd. Derfor, er axenic kulturer ofte nødvendig for å minimere de komplekse biotiske faktorene assosiert med andre organismer (f.eks bakterier, andre alger) som uunngåelig vokse i store utendørs systemer. Selv når studere interaksjoner mellom alger og andre organismer, har vi funnet at bruk av svært-kontrollerte eksperimentelle forhold er nyttig når undersøke molekylær utveksling mellom organismer15,16,17.
Innenfor kategorien av småskala innendørs Algedyrking har en rekke tilnærminger brukt. Kanskje er den mest brukte metoden å dyrke alger i Erlenmeyer flasker i en shaker tabell under en lys bank18,19. Utveksling av oksygen og CO2 foregår ved passiv spredning gjennom en skum plugg i toppen av flasken. Noen forskere har forbedret dette oppsettet gjennom aktiv lufting av flasker20. En annen tilnærming er å dyrke alger på flasker, mikset av rør bar og aktive lufting. Til tross for sin enkelhet, har vi funnet at bruk av kolber og flasker fører ofte til inkonsekvente resultater blant biologiske gjentak. Antagelig dette skyldes posisjon effekter - forskjellige posisjoner motta ulike mengder av lys, som også påvirker interne reaktoren temperaturer. Daglig rotasjon av reaktorer til nye plasseringer kan hjelpe, men ikke avhjelpe problemet fordi visse stadier av alger vekst (f.eks tidlig eksponentiell) er mer følsomme for posisjonelle effekter enn andre (f.eks Logg fase).
På motsatt side av spekteret av teknologisk raffinement er fullstendig kontrollert kommersielle photobioreactors. Disse systemene kontinuerlig overvåke og justere forhold i reaktoren å optimalisere algene oppblomstringen. De har programmerbare belysning, sanntid temperaturkontroll og pH-kontroll. Dessverre de er dyre og vanligvis koster flere tusen dollar per reaktoren. Mest vitenskapelige og tekniske tidsskrifter krever biologiske replikering av resultater, nødvendiggjør kjøp av flere bioreactors. Vi presenterer her en boble kolonnen reaktoren system som broer skillet mellom enkel (kolbe) og sofistikert (fullt kontrollert bioreactor) tilnærminger for lab skala Algedyrking. Boble kolonnene bruker stigende gassboblene å lette gassutveksling og bland reaktoren. Denne tilnærmingen gir en viss grad av kontroll over lys og temperatur, men gjør det på en måte som er kostnadseffektiv. Videre har vi funnet dette systemet å gi svært konsekvente resultater blant biologiske gjentak, redusere antall biologiske gjentak nødvendig for å få statistisk signifikante resultater sammenlignet med kolbe eller flaske tilnærming. Vi har også brukt dette systemet til vellykket dyrke blandinger av alger og bakterier21. I tillegg til Algedyrking skissere vi en prosedyre for å måle nøytral lipid innholdet i kulturperler alger. Sistnevnte har vært publisert andre steder22, men vi inkluderer fremgangsmåten her for å gi trinnvise instruksjoner for hvordan du bruker den med hell.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies for airlift photobioreactor setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>16157-191</td>
			<td>For bottle reactors, humidifiers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2&#34; hose clamp</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>UC953A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; female luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FTLL360-6005</td>
			<td>1/4&#34; ID, PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; ID, 3/8&#34; OD autoclaveable PVC tubing</td>
			<td>Thermo-Nalgene</td>
			<td>63013-244</td>
			<td>50&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; in O-rings</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>1REC5</td>
			<td>#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239&#34; I.D., 0.379&#34;O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>FTLL230-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD autoclaveable PVC tubing</td>
			<td>Thermo-Nalgene</td>
			<td>63013-608</td>
			<td>250&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; male spinning luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>MLRL013-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; multiport barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>4PLL230-6005</td>
			<td>1/8&#34; multiport barb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; NPT to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>18230-6005</td>
			<td>1/8&#34; 200 series barb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; panel mount luer</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson MLRLB230-6005</td>
			<td>1/8&#34;, PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 gallon fish tank</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>802262</td>
			<td>Can hold up to 8 bioreactors depending on layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-13-SSV</td>
			<td>For bottle reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ft fluorescent light bank</td>
			<td>Agrobrite</td>
			<td>FLT24 T5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200-2500 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-14-SSV</td>
			<td>For air regulation upstream of humidifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Pyrex bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>16157-136</td>
			<td>For gas mixing after humidifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-500 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-12-SSV</td>
			<td>For hybridization tube reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-50 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-151-SSV</td>
			<td>For CO2 flow rate control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air filters 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman/ Fisher</td>
			<td>09-745-1A</td>
			<td>Polyvent, 28 mm, 0.2 &#181;m, PTFE, 50 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning lids for pyrex bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-233</td>
			<td>10 GL45 lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer endcap</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FTLLP-6005</td>
			<td>Female stable PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>32645-030</td>
			<td>35x300 mm, pack of 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light timer</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>556393626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locknuts</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson LNS-3</td>
			<td>1/4&#34;, red nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-690</td>
			<td>Low profile magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male luer endcap</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson LP4-6005</td>
			<td>Male plug PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning luer lock ring</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FSLLR-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars - long</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-040</td>
			<td>38.1 mm, for bottle reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars - medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-034</td>
			<td>25 mm, for hyridization tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies and reagents for culturing algae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-491</td>
			<td>13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Air-tite</td>
			<td>89215-216</td>
			<td>For filtering spent media from daily culture sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-482</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100x15 mm stackable petri dishes, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-276</td>
			<td>Sterile (or equivalent), polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Serological pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82051-584</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-298</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-348</td>
			<td>Sterile (or equivalent), polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>89089-578</td>
			<td>Polystyrene with lid, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inocculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-478</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid carbon dioxide tank and regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL bead tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10158-556</td>
			<td>Polypropylene tube w/ lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-774</td>
			<td>Polypropylene, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>550646751</td>
			<td>Only use regular bleach, not cleaning bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1109-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TCN0659-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vegetable oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>9276383</td>
			<td>Any vegetable oil should work as long as it is fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>Biospec products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XS205DU</td>
			<td>Capable of at least 4 decimal accuracy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead homogenizer</td>
			<td>Omni</td>
			<td>19-040E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop micro centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Heraeus Fresco 21 with 24x2</td>
			<td>Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75838-282</td>
			<td>Including dry block for a microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td>2.5L freeze drying system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Tissue</td>
			<td>Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2</td>
			<td>Capable of reading absorbance and fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of green microalgae in bubble column photobioreactors and an assay for neutral lipids

Det er betydelig interesse i studiet av mikroalger for tekniske applikasjoner som produksjon av biodrivstoff, høy verdi produkter, og for behandling av avfall. Som de fleste nye forskningsinnsats begynner på laboratoriet skala, er det behov for kostnadseffektive metoder for dyrking av mikroalger på en reproduserbar måte. Her kommuniserer vi en effektiv tilnærming til kultur mikroalger i laboratoriet skala photobioreactors, og å måle vekst og nøytrale lipid innhold av at alger. Instruksjonene finnes også på hvordan du setter opp photobioreactor systemet. Selv om eksempel organismene Chlorella og Auxenochlorella, kan dette systemet tilpasses for å dyrke en rekke mikroalger, inkludert co kulturer av alger med ikke-alger arter. Lager kulturer dyrkes først i flasker for å produsere inoculum for photobioreactor-systemet. Alger inoculum er konsentrert og overført til photobioreactors for dyrking i satsvis modus. Eksempler er samlet daglig for optisk densitet målingene. På slutten av batch kultur, celler er høstet av sentrifuge, vasket, og fryse tørket å få en endelig tørrvekt konsentrasjon. Siste tørrvekt konsentrasjonen brukes til å lage en sammenheng mellom optisk densitet og tørr vekt konsentrasjonen. En modifisert Folch metode brukes deretter til å hente totalt lipider fra frysetørket biomasse og ekstrakt er assayed for sin nøytrale lipid innhold ved hjelp av en microplate analysen. Denne analysen er publisert tidligere, men protokollen skritt ble tatt her for å markere viktige trinnene i fremgangsmåten hvor ofte oppstår. Bioreactor systemet beskrevet her fyller en nisje mellom enkel kolbe dyrking og fullt kontrollert kommersielle bioreactors. Selv med bare 3-4 biologiske replikerer per behandling, vår tilnærming til dyrking alger fører til tett standardavvik i vekst og lipid analyser.

Denne prosedyren gir en gang løpet av alger optisk tetthet data på OD 550 nm (figur 4A). Optisk tetthet og tørr vekt konsentrasjon data kan være korrelert (figur 4B). Dette oppnås ved første beregning av den endelige tørrvekt alger konsentrasjonen etter fryse-tørking trinn. Neste, den optiske densitet for kultur føljetong fortynning (utføres på den siste dagen av sampling) og de faktiske tørrvekt konsentrasjonene kan ...

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids at JoVE.com

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Her presenterer vi en protokoll for å konstruere lab skala boble kolonnen photobioreactors og bruke dem til kultur mikroalger. Det gir også en metode for bestemmelse av kultur vekst og nøytrale lipid innhold.

Dyrking av grønne mikroalger boble kolonnen Photobioreactors og analysen for nøytral lipider

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Denne protokollen gir instruksjoner for bygging og bruk av en Bubble Column Photobioreactor system for å vokse mikroalger, og bør være av interesse for alle som studerer algel biodrivstoff, avløpsvann behandling, eller algel biologi. Vi har funnet spirreaktorsystemet for å gi svært anerkjente resultater. Reaktorsystemet kan også tilpasses til en bred rang av alger og koster langt mindre enn mange kommersielle tilbud.Å demonstrere prosedyren vil være Qichen Wang, en utdannet student fra laboratoriet mitt. For å begynne oppsettet av Bubble Column Photobioreactors, konstruer et sett med ventilerte lokk fra plastlokkene på en liters glassflasker og hybridiseringsrør som beskrevet i tekstprotokollen. Sett en 1/4 tommers O-ring over slitebanene på en 1/8th tommers panelfeste lokketilpasning, og skyv denne inn i 1/4 tommers hullet som er boret i lokket.Sett en annen 1 /4 tommer over trådene slik at lokket er klemt mellom de to O-ringene. Sett deretter en låsemutter på trådene og stram den for å feste panelfestet lokke på plass. Nå snap for å låse ringer på den eksponerte mannlige lokke, projisere fra lokket.Gjenta denne prosedyren for hvert hull i lokket. For lokk som vil bli brukt på Bubble Column og flaske reaktorer, fest 1/8th tommers kvinnelig lokke til barb beslag til 1 1/2 tommers biter av 1/8th tommers ID PVC rør. Fest disse til hver av de eksponerte hannlokkbeslagene på lokket.Koble en tilbakeslagsventil til den frie enden av en av de 1/8th tommers stykker. Koble deretter en mannlig lokke til barb montering til den andre delen av 1/8th tommers rør som projiserer fra lokket. Klikk den roterende låseringen på plass og fest et 0,2 mikron luftfilter til dette.Kompleat montering av luft levere system, fisketanker, røre plater, og lys som descried det tekstprotokollen. Konsentrer den avgjorte mikroalgerlageret ved å fjerne supernatenten ved hjelp av en vakuumpumpe. La mindre enn 100 milliliter medium i hver flaske, men unngå å fjerne avgjorte alger.Suspender og overfør alger slurry å sterile 50 milliliter sentrifuge rør. Sentrifuge 1000 ganger G i fem minutter for å konsentrere alger ytterligere. I biosikkerhetsskapet fjerner du nok supernatent for å oppnå et totalt volum på ca. 80 milliliter algekonsentrater for 12 fotobioreaktorer.Unngå støvsuging av pelleten. Overfør algekonsentratet til en steril beholder. Nå legger du til seks milliliter algeslam i hver fotobioreaktor med en steril 10 milliliter serologisk pipette.Virvle bioreaktorene for å blande alger inn i mediet. Tegn en to milliliter prøve fra hver bioreaktor ved hjelp av en serologisk pipette og overfør til et to milliliter rør. Samle en to milliliter prøve hver 24 timer for å overvåke kulturfremdrift.Kontroller prøven for ph ved hjelp av teststrimler og juster reaktoren etter behov. Stram bioreaktorlokkene og legg alle bioreaktorer i fisketankens vannbad. Juster vanning, karbondioksid og belysning til de riktige nivåene for arten.Roter bioreaktorposisjonen hver dag etter prøvetaking. Påfør 200 mikroliter av hver kulturprøve i triplikate til brønner av en 96 brønnmikroplate. Mål deretter optisk tetthet ved 550 nanometer og 680 nanometer.Mål et fast volum av algekultur fra hver bioreaktor med en utdannet sylinder og overfør i sentrifugeflasker. Sentrifuge kulturen 4, 696 ganger G i fem minutter. Kast det overnaturet ved å støvsuge det forsiktig ut.Overfør pellets til merket 50 milliliter rør. Skyll sentrifugeflaskene med destillert vann og overfør innholdet til de 50 milliliter rørene. Kontroller at det totale volumet ikke overstiger 45 milliliter.Etter å ha vasket alger pellets som beskrevet i tekstprotokollen, kast overnatent. Deretter legger du til 7,5 milliliter destillert vann til hvert 50 milliliter rør. Nå, vortex 50 milliliter rør og overføre alger slurries i pre veide 15 milliliter rør.Skyll de 50 milliliter rørene med ekstra destillert vann, og overfør væsken til de 15 milliliter rørene som holder det totale volumet i disse rørene til mindre enn 12 milliliter. Etter sentrifugering av de 15 milliliter rørene og kast supernatent som før, frys rørene med pellets ved minus 80 grader Celsius i minst 30 minutter som forberedelse til frysetørking. Tilsett 1,5 milliliter folch løsemiddel til hver to milliliter rør som inneholder 20 milligram fryse tørkede alger.Hell ca 0,5 milliliter zirkonia silikaperler i hvert rør til væskenivået når to milliliter. Homogeniser algeprøvene i en perlemølle i 20 sekunder med en hastighet på 6,5 meter per sekund. Overfør rørene til is i 30 sekunder for å kjøle ned prøvene.Gjenta deretter fem ganger til for å trekke ut lipidene fullt ut. Filtrer homogenatet gjennom en fem milliliter sprøyte som inneholder en rustfritt stål nettingplate for å spenne ut perlene, samle filtrering i et 15 milliliter rør. Vask perlene med 1,5 milliliter folch løsemiddel, skyve væske gjennom med syring etter behov.Gjenta denne vasken 2 ganger til og samle all filtrat i 15 milliliter røret, noe som gir et endelig volum på ca seks milliliter. Tilsett 1,2 milliliter med 0,9% natriumkloridoppløsning til foliosekstraktet i 15 milliliter røret, og vortex for å blande godt. Sentrifuge de 15 milliliter rørene ved 6000 ganger G i fem minutter.Registrer bunnklorformfasevolumet til nærmeste 0,1 milliliter ved hjelp av linjer på siden av 15 milliliter røret. Overfør deretter den nederste fasen til et glass ondt ved hjelp av en glassbeitepipette. For å utføre den nøytrale lipidanalysen, fortynne lipidekstraktene og vegetabilsk oljestandard tre ganger med metanol.For hver fortynnet, prøven legge 80 mikroliter til en 96 brønn polypropylen mikroplate i quadruplicate. For løsningsmiddelet tomt, bruk 80 mikroliter folch løsemiddel i quadruplicate. For standarder, tilsett 10, 30, 60, 90 og 120 mikroliter av den fortynnede vegetabilske oljestandarden også i quadruplicate.Plasser mikroplaten i røykhetten på en forvarmet tørrblokkvarmer ved 55 grader Celsius i 20 til 30 minutter til alt løsningsmiddel har fordampet. Fjern mikroplaten fra varmeblokken og la den avkjøles til romtemperatur. Deretter legger du til 30 mikroliter isopropylalkohol til hver brønn og bland ved å pipetter opp og ned.Sørg for at alle pipettekanaler blander løsningen og gjenbruker lipidene, noe som gir en homogen grønn væske. Nå legger du til 200 mikroliter av ett mikrogram per milliliter en nile rød løsning til hver brønn, og rør den opp og ned 10 ganger for å blande. Etter en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur, tilsett 20 mikroliter med 50% blekemiddelløsning til hver brønn, og rør den opp og ned fem ganger for å blande godt.La plat å inkubere i 30 minutter ved romtemperatur. Etter 30 minutter, les florescence i prøvene hvert femte til 10 minutt ved 530 nanometer eksitasjon, 575 nanometer utslipp, med auto cut offs satt til 570 nanometer til signalet fra alger prøvene stabiliserer seg. Denne prosedyren gir et tidsforløpet av algel optisk tetthetsdata ved OD 550 nanometer.Kontrollkulturer ble dyrket på fersk anate NH4 medium. Behandling en, er co-kulturer auxenochlorella protothecoides og azospirillum brasiliense dyrket på frisk medfødt NH4 medium. Behandling to, er en azinic A.Protothecoides dyrket på medfødte NH4 medium supplert med 50 milligram per milliliter IAA, som helt hemmet alger vekst.Behandling tre, er azinic A.Protothecoides, dyrket på brukt medium fra A.Brasilienes. Vekstkurvene viser kulturer av auxenochlorella protothecoides inn sent logaritmisk vekst på 120 timer. Vist her er corelation kurver mellom den optiske tettheten på 550 nanometer og den endelige tørrvektkonsentrasjonen, ved hjelp av en andre ordre polynom passform.Til slutt kan fargen brukes på tidskurs optisk tetthet data for å oppnå en tørr vekt vekst kurve. De samme behandlingene brukes her, bortsett fra at klorella sorokiniana er dyrket i stedet for auxenochlorella protothecoides. Prosent tørrvektnøytral lipid oppnådd i den nøytrale lipidanalysen korrelerer godt med triose glyserolinnhold på en tilsvarende tynn lagkromatografiplate.I motsetning til A.Protothecoides hemmet ikke IAA-behandlingen C.Sorkiniana-veksten. Etter lipidekstraksjon av alger kan den gjenværende cellepallen analyseres for stivelse og cellevegginnhold, noe som gir et mer detaljert bilde av energilagringsprodukter i cellen. Metodene som er beskrevet her har gjort det mulig å oppdage nye funn innen algelbiodrivstoff og behandling av avløpsvann.Spesielt har dette systemet blitt brukt til å bedre forstå hvordan bakterier påvirker algelvekst.

Research

JoVE Journal

Environment

Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Analyse av Fatty Acid innhold og sammensetning i Mikroalger

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimalisere Røykgass Innstillinger for å fremme Mikroalger Vekst i fotobioreaktorer via datasimulering

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Avskrift og Metabolitt Profilering for bedømmelse av tobakk Tree and Poplar som råstoff for bio-basert industri

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Kvantifisering av tungmetaller og andre uorganiske forurensninger på produktiviteten Mikroalger

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Måle og kartlegge jorderosjon og deponering relatert til jord Carbonate konsentrasjoner Under landbruks forvaltningen

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Innsamling og utvinning av yrkesmessig Air prøver for analyse av sopp DNA

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Anlegget infeksjon testen: Spray og såret-mediert Inoculation med anlegget patogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

En anaerob Biosensor analysen for påvisning av kvikksølv og kadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Påvisning av Tilapia Lake Virus bruker konvensjonelle RT PCR og SYBR grønne RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Kjemisk isolasjon, kvantifisering og separasjon av huden lipider fra reptiler

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...