Name: cultivation of green microalgae in bubble column photobioreactors and an assay for neutral lipids
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids at JoVE.com

Apoyo para esta investigación fue proporcionada por el Instituto Nacional de alimentos de USDA y agricultura Portilla proyecto ALA0HIGGINS y las oficinas de la Universidad de Auburn de preboste, el Vicepresidente para la investigación y la escuela de ingeniería de Samuel Ginn. También fue apoyado por la NSF concede CBET-1438211.

1. configuración de fotobiorreactores de columna de burbuja
<ol><li>Construir un conjunto de tapas ventiladas de las tapas de plástico que viene con las botellas de vidrio de 1 L y tubos de hibridación (véase figura 1 esquema y fotos). La construcción de las tapas para el humidificador, trampa, cada aire ascensor fotobiorreactor y cada reactor botella de mezcla.<ol>
<li>¼" agujeros en la tapa: 2 agujeros son necesarios para las tapas de bioreactor y el humidificador; 3 agujeros se ne...

<ol>
	<li>Prandini, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+nutrient+removal+from+swine+wastewater+digestate+coupled+to+biogas+purification+by+microalgae+Scenedesmus+spp.">Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp.</a> Bioresource Technology. , 67-75 (2016).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycoremediation+of+dairy+and+winery+wastewater+using+Diplosphaera+sp.+MM1.">Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1.</a> Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).</li><li>Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+thiamine+metabolites+and+spent+medium+from+Chlorella+sorokiniana+on+metabolism+in+the+green+algae+Auxenochlorella+prototheciodes.">Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes.</a> Algal Research. 33, 197-208 (2018).</li><li>L&#233;pinay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+insight+on+interactions+between+bacteria+and+the+marine+diatom+Haslea+ostrearia:+Algal+growth+and+metabolomic+fingerprinting.">First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting.</a> Algal Research. 31, 395-405 (2018).</li><li>Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. 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M., VanderGheynst, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+assay+for+quantitation+of+neutral+lipids+in+extracts+from+microalgae.">Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae.</a> Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).</li><li>Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+elevated+CO2+concentration+on+the+quality+of+algal+starch+as+a+potential+biofuel+feedstock.">The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informatics+for+improved+algal+taxonomic+classification+and+research:+A+case+study+of+UTEX+2341.">Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341.</a> Algal Research. 12, 545-549 (2015).</li><li>Garrett, R. H., Grisham, C. 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La consideración más importante al cultivo de algas es un entendimiento de las necesidades específicas del organismo o grupo de organismos. Las algas en el sistema de cultivo aquí descrito puede utilizarse para una amplia gama de las algas pero los específicos factores abióticos (temperatura, media, pH, intensidad de luz, nivel de CO2 , tasa de aireación) de la cultura deben ajustarse a las necesidades del organismo. Tenga en cuenta los parámetros aquí descritos fueron utilizados para el cultivo de <e...

El uso de microalgas en ingeniería y biotecnología ha atraído gran interés en los últimos años. Microalgas se están estudiando para el uso en aguas residuales tratamiento1,2,3,4, biocombustibles producción5,6,7,8y el producción de nutracéuticos y otros productos de alto valor9,10. Las algas también se están modificando genéticamente a mayores tasas en un esfuerzo por mejorar su idoneidad para aplicaciones ingeniería específica11,12 En consecuencia, hay gran interés en la experimentación con organismos industrialmente relevantes en entornos controlados. El propósito de este método es para comunicar un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en un entorno de laboratorio controlado y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. Mejorar el crecimiento de las tasas y el contenido de lípido neutral de microalgas han sido identificados como dos cuellos de botella claves hacia la comercialización de biocombustibles de algas13.
Una amplia gama de enfoques se han utilizado a las algas de la cultura para los propósitos experimentales. En general, estos enfoques se pueden dividir entre cultivo al aire libre a gran escala y pequeña escala cultivo interior. Cultivo al aire libre en estanques abiertos y en fotobiorreactores es apropiado para la experimentación a la intensificación de procesos que ya han sido probados a escala de laboratorio (por ejemplo, para probar a escala de una nueva cepa de alta de lípidos de algas)14. Sin embargo, el cultivo en pequeña escala interior es apropiado al desarrollo de cepas de algas nuevos o mejorados o realizar experimentos dirigidos a comprender los mecanismos biológicos. En estos últimos casos, es necesaria un alto grado de control experimental para provocar cambios sutiles en el comportamiento biológico. Para ello, cultivos axénicos a menudo se requieren para reducir al mínimo los complejos factores bióticos asociados con otros organismos (e.g. bacterias, otras algas) que inevitablemente crecen en sistemas al aire libre a gran escala. Incluso al estudiar las interacciones entre algas y otros organismos, hemos encontrado que el uso de condiciones experimentales altamente controladas es útil al examinar el intercambio molecular entre los organismos15,16,17.
Dentro de la categoría de cultivo de algas interiores en pequeña escala, se han utilizado una variedad de enfoques. Quizás el método más común es crecer algas en matraces de Erlenmeyer sobre una mesa coctelera debajo de un banco de luz18,19. Intercambio de oxígeno y CO2 lleva a cabo por difusión pasiva a través de un tapón de espuma en la parte superior del frasco. Algunos investigadores han mejorado este montaje una aireación activa de los matraces20. Otro método es cultivar algas en botellas, mezcladas por barra de agitación y aireación activa. A pesar de su sencillez, hemos encontrado que el uso de frascos y botellas a menudo conduce a resultados inconsistentes entre los distintos recipientes biológicos. Probablemente esto es debido a los efectos de la posición - posiciones reciben diferentes cantidades de luz, que también afectan las temperaturas del interior del reactor. Rotación diaria de reactores a nuevas posiciones puede ayudar pero no solucionar el problema porque ciertas etapas de crecimiento de las algas (por ejemplo, temprano exponencial) son más sensibles a efectos posicionales que otros (p. ej., fase de registro).
En el lado opuesto del espectro de la sofisticación tecnológica son fotobiorreactores comercial totalmente controlado. Estos sistemas continuamente monitorea y regula las condiciones en el reactor para optimizar el crecimiento de algas. Tienen iluminación programable, control de temperatura en tiempo real y control del pH. Por desgracia, son caros y por lo general cuestan varios miles de dólares por el reactor. Más revistas científicas y de ingeniería requieren replicación biológica de resultados, lo que requeriría la compra de varios Biorreactores. Aquí os presentamos un sistema de reactor de columna de burbujas que une la brecha entre el simple (matraz) y sofisticado (biorreactor totalmente controlado) se acerca para el cultivo de algas de escala de laboratorio. Columnas de burbujas utilizan burbujas de gas de levantamiento para facilitar el intercambio de gases y mezcla del reactor. Este enfoque proporciona cierto grado de control sobre la iluminación y la temperatura pero lo hace de una manera rentable. Por otra parte, hemos encontrado este sistema para producir resultados muy consistentes entre los distintos recipientes biológicos, reduciendo el número de repeticiones biológicos necesarios para obtener resultados estadísticamente significativos en comparación con el método de frasco o botella. También hemos utilizado este sistema para cultivar con éxito mezclas de algas y bacterias21. Además de cultivo de algas, describiremos un procedimiento para medir el contenido de lípidos neutros en las algas cultivadas. Este último método ha sido publicado en otro lugar22, pero incluimos aquí el procedimiento para proporcionar instrucciones paso a paso sobre cómo utilizar con éxito.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supplies for airlift photobioreactor setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>16157-191</td>
			<td>For bottle reactors, humidifiers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2&#34; hose clamp</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>UC953A</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; female luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FTLL360-6005</td>
			<td>1/4&#34; ID, PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; ID, 3/8&#34; OD autoclaveable PVC tubing</td>
			<td>Thermo-Nalgene</td>
			<td>63013-244</td>
			<td>50&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; in O-rings</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>1REC5</td>
			<td>#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239&#34; I.D., 0.379&#34;O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>FTLL230-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD autoclaveable PVC tubing</td>
			<td>Thermo-Nalgene</td>
			<td>63013-608</td>
			<td>250&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; male spinning luer to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>MLRL013-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; multiport barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>4PLL230-6005</td>
			<td>1/8&#34; multiport barb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; NPT to barb</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>18230-6005</td>
			<td>1/8&#34; 200 series barb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; panel mount luer</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson MLRLB230-6005</td>
			<td>1/8&#34;, PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 gallon fish tank</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>802262</td>
			<td>Can hold up to 8 bioreactors depending on layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-13-SSV</td>
			<td>For bottle reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ft fluorescent light bank</td>
			<td>Agrobrite</td>
			<td>FLT24 T5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200-2500 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-14-SSV</td>
			<td>For air regulation upstream of humidifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Pyrex bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>16157-136</td>
			<td>For gas mixing after humidifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-500 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-12-SSV</td>
			<td>For hybridization tube reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-50 ccm flow meter</td>
			<td>Dwyer</td>
			<td>RMA-151-SSV</td>
			<td>For CO2 flow rate control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air filters 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman/ Fisher</td>
			<td>09-745-1A</td>
			<td>Polyvent, 28 mm, 0.2 &#181;m, PTFE, 50 pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning lids for pyrex bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-233</td>
			<td>10 GL45 lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer endcap</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FTLLP-6005</td>
			<td>Female stable PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>32645-030</td>
			<td>35x300 mm, pack of 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light timer</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>556393626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locknuts</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson LNS-3</td>
			<td>1/4&#34;, red nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile magnetic stirrer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-690</td>
			<td>Low profile magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male luer endcap</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson LP4-6005</td>
			<td>Male plug PP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning luer lock ring</td>
			<td>Nordson biomedical</td>
			<td>Nordson FSLLR-6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars - long</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-040</td>
			<td>38.1 mm, for bottle reactors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars - medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>58949-034</td>
			<td>25 mm, for hyridization tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies and reagents for culturing algae</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-491</td>
			<td>13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Air-tite</td>
			<td>89215-216</td>
			<td>For filtering spent media from daily culture sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-482</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100x15 mm stackable petri dishes, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-276</td>
			<td>Sterile (or equivalent), polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Serological pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82051-584</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-298</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-348</td>
			<td>Sterile (or equivalent), polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>89089-578</td>
			<td>Polystyrene with lid, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inocculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-478</td>
			<td>Sterile (or equivalent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid carbon dioxide tank and regulator</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL bead tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10158-556</td>
			<td>Polypropylene tube w/ lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>82050-774</td>
			<td>Polypropylene, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>550646751</td>
			<td>Only use regular bleach, not cleaning bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1109-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1115-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH20864.400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TCN0659-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vegetable oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>9276383</td>
			<td>Any vegetable oil should work as long as it is fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)</td>
			<td>Biospec products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>XS205DU</td>
			<td>Capable of at least 4 decimal accuracy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead homogenizer</td>
			<td>Omni</td>
			<td>19-040E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop micro centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Heraeus Fresco 21 with 24x2</td>
			<td>Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75838-282</td>
			<td>Including dry block for a microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670520</td>
			<td>2.5L freeze drying system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large benchtop centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Heraeus Megafuge 16R Tissue</td>
			<td>Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M2</td>
			<td>Capable of reading absorbance and fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of green microalgae in bubble column photobioreactors and an assay for neutral lipids

Hay gran interés en el estudio de las microalgas para aplicaciones de ingeniería tales como la producción de biocombustibles, productos de alto valor y para el tratamiento de residuos. Medida más nuevos esfuerzos de investigación a escala de laboratorio, hay una necesidad de métodos rentables para el cultivo de microalgas de forma reproducible. Aquí, nos comunicamos un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en fotobiorreactores de escala de laboratorio y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. También se incluyen instrucciones sobre cómo configurar el sistema de fotobiorreactor. Aunque los organismos ejemplo son especies de Chlorella y Auxenochlorella, se puede adaptar este sistema para cultivar una amplia gama de microalgas, incluyendo co-cultivos de algas con las especies de algas no. Culturas comunes se cultivan primero en botellas para producir inóculo para el sistema del fotobiorreactor. Inóculo de algas se concentra y transferido a fotobiorreactores para el cultivo en lotes. Las muestras se recogen diariamente de las lecturas de densidad óptica. Al final de la cultura de la hornada, las células se cosechan por centrífuga, lavado y liofilizado para obtener una concentración de peso seco final. La concentración de peso seco final se utiliza para crear una correlación entre la densidad óptica y la concentración de peso seco. Un método modificado de Folch se utiliza posteriormente para extraer los lípidos totales de la biomasa liofilizada y el extracto es analizado por su contenido de lípido neutral usando un análisis de la microplaca. Este ensayo ha sido publicado anteriormente pero pasos de protocolo se incluyeron aquí para destacar los pasos críticos en el procedimiento donde se producen frecuentemente errores. El sistema de biorreactor descrito aquí llena un nicho entre cultivo frasco simple y biorreactores comerciales totalmente controlado. Incluso con sólo 3-4 biológicos repeticiones por tratamiento, nuestro acercamiento al cultivo de algas conduce a desviaciones de estándar ajustadas en los ensayos de crecimiento y de los lípidos.

Este procedimiento produce un curso de tiempo de datos de algas densidad óptica OD 550 nm (Figura 4A). La densidad óptica y peso seco de concentración pueden ser datos correlacionados (Figura 4B). Esto se logra mediante el primer cálculo de la concentración de algas de peso seco final después del paso de liofilización. A continuación, puede correlacionarse la densidad óptica de la dilución serial de cultura (realizado e...

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Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Aquí, presentamos un protocolo para construir laboratorio burbuja columna fotobiorreactores y usarlos para cultivo de microalgas. También proporciona un método para la determinación de la tasa de crecimiento del cultivo y el contenido de lípidos neutros.

Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Este protocolo proporciona instrucciones para la construcción y el uso de un sistema de fotobiorreactor de columna de burbujas para cultivar microalgas, y debe ser de interés para cualquier persona que estudie biocombustibles de algel, tratamiento de aguas residuales o biología de algel. Hemos encontrado el sistema de reactores spire para producir resultados de alta reputación. El sistema de reactores también es personalizable a una amplia gama de algas y cuesta mucho menos que muchas ofertas comerciales.Demostrando el procedimiento estará Qichen Wang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para comenzar la configuración de los fotobiorreactores de columna de burbujas, construya un conjunto de tapas ventiladas a partir de las tapas de plástico de las botellas de vidrio de un litro y tubos de hibridación como se describe en el protocolo de texto. Deslice un anillo O de 1/4 de pulgada sobre las bandas de rodadura de un accesorio de señuelo de montaje en panel de 1/8 de pulgada, y deslícelo en el orificio de 1/4 pulgada perforado en la tapa.Deslice un segundo 1/4 de pulgada sobre los hilos para que la tapa se emparete entre los dos anillos O. A continuación, deslice una tuerca de fijación sobre los hilos y apriétela para fijar el señuelo de montaje del panel en su lugar. Ahora encaje para fijar los anillos en el señuelo masculino expuesto, proyectando desde la tapa.Repita este procedimiento para cada orificio de la tapa. Para las tapas que se utilizarán en la columna de burbujas y los reactores de botella, conecte el señuelo hembra de 1/8 de pulgada a los accesorios de púas a 1 piezas de 1/2 pulgada de tubo de PVC ID de 1/8 de pulgada. Fije estos a cada uno de los accesorios de señuelo macho expuestos en la tapa.Conecte una válvula de retención al extremo libre de una de las piezas de 1/8 de pulgada. A continuación, conecte un señuelo macho a la colocación de la púa a la segunda pieza de tubo de 1/8 de pulgada que se proyecta desde la tapa. Haga clic en el anillo de bloqueo giratorio en su lugar y fije un filtro de aire de 0,2 micras a esto.Ensamblaje Compleat del sistema de entrega de aire, tanques de pescado, placas de agitación, y las luces como descried el protocolo de texto. Concentrar el stock de microalgas asentadas retirando el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Deje menos de 100 mililitros de medio en cada botella, pero evite eliminar las algas asentadas.Suspenda y transfiera la lodo de algas a tubos estériles de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar 1.000 veces G durante cinco minutos para concentrar aún más las algas. En el gabinete de bioseguridad, retire suficiente sobrenadante para lograr un volumen total de aproximadamente 80 mililitros de concentrados de algas para 12 fotobiorreactores.Evite aspirar el pellet. Transfiera el concentrado de algas a un recipiente de esterilización. Ahora, agregue seis mililitros de lodos de algas en cada fotobiorreactor con una pipeta serológica esterilizada de 10 mililitros.Gire los biorreactores para mezclar las algas en el medio. Dibuje una muestra de dos mililitros de cada biorreactor utilizando una pipeta serológica y transfiera a un tubo de dos mililitros. Recoja una muestra de dos mililitros cada 24 horas para monitorear el progreso del cultivo.Compruebe la muestra en busca de ph utilizando tiras reactivas y ajuste el reactor según sea necesario. Apriete las tapas del biorreactor y coloque todos los biorreactores en el baño de agua de la pecera. Ajuste la aireación, el dióxido de carbono y la iluminación a los niveles adecuados para la especie.Gire la posición del biorreactor cada día después del muestreo. Aplicar 200 microlitros de cada muestra de cultivo triplicado a pozos de una microplaca de 96 pozos. A continuación, mida la densidad óptica a 550 nanómetros y 680 nanómetros.Mida un volumen fijo de cultivo de algas de cada biorreactor con un cilindro de posgrado y transfiera en botellas de centrífuga. Centrifugar la cultura 4, 696 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante al aspirarlo cuidadosamente.Transfiera los pellets a tubos etiquetados de 50 mililitros. Enjuague las botellas centrífugas con agua destilada y transfiera el contenido a los tubos de 50 mililitros. Asegúrese de que el volumen total no supere los 45 mililitros.Después de lavar los pellets de algas como se describe en el protocolo de texto, deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 7,5 mililitros de agua destilada a cada tubo de 50 mililitros. Ahora, vórtice los tubos de 50 mililitros y transfiera los lodos de algas a tubos prepesados de 15 mililitros.Enjuague los tubos de 50 mililitros con agua destilada adicional y transfiera el líquido a los tubos de 15 mililitros manteniendo el volumen total en esos tubos a menos de 12 mililitros. Después de centrifugar los tubos de 15 mililitros y desechar el sobrenadante como antes, congele los tubos con pellets a menos 80 grados centígrados durante al menos 30 minutos en preparación para el secado por congelación. Añadir 1,5 mililitros de disolvente folch a cada tubo de dos mililitros que contenga 20 miligramos de algas secas congeladas.Vierta aproximadamente 0,5 mililitros de perlas de sílice de zirconia en cada tubo hasta que el nivel de líquido alcance dos mililitros. Homogeneizar las muestras de algas en un molino de cuentas durante 20 segundos a una velocidad de 6,5 metros por segundo. Transfiera los tubos a hielos durante 30 segundos para enfriar las muestras.Luego, repita cinco veces más para extraer completamente los lípidos. Filtrar el homogeneizar a través de una jeringa de cinco mililitros que contiene un disco de malla de alambre de acero inoxidable para estirar las perlas, recogiendo el filtrado en un tubo de 15 mililitros. Lavar las perlas con 1,5 mililitros de disolvente folch, empujando el líquido con el siring según sea necesario.Repita este lavado 2 veces más y recoja todo el filtrado en el tubo de 15 mililitros, produciendo un volumen final de aproximadamente seis mililitros. Añadir 1,2 mililitros de solución de cloruro de sodio al 0,9% al extracto de folch en el tubo de 15 mililitros, y vórtice para mezclar bien. Centrifugar los tubos de 15 mililitros a 6.000 veces G durante cinco minutos.Registre el volumen inferior de la fase de cloroformo al 0,1 mililitro más cercano utilizando líneas en el lado del tubo de 15 mililitros. A continuación, transfiera la fase inferior a una vil de vidrio utilizando una pipeta de pasto de vidrio. Para realizar el ensayo de lípidos neutros, diluir los extractos de lípidos y el aceite vegetal estándar tres veces con metanol.Por cada comprimido, la muestra añade 80 microlitros a una microplaca de polipropileno de 96 pocótanos en cuadrúplica. Para el disolvente en blanco, aplique 80 microlitros de disolvente folch en cuadrúplica. Para las normas, agregue 10, 30, 60, 90 y 120 microlitros del estándar de aceite vegetal diluido también en cuadrúplica.Coloque la microplaca en la campana de humos en un calentador de bloque seco precalentado a 55 grados Celsius durante 20 a 30 minutos hasta que todo el disolvente se haya evaporado. Retire la microplaca del bloque de calefacción y déjela enfriar a temperatura ambiente. Luego, agregue 30 microlitros de alcohol isopropílico a cada pozo y mezcle en pipeteando arriba y abajo.Asegúrese de que todos los canales de pipeta están mezclando la solución y resuspendiendo los lípidos, produciendo un líquido verde homogéneo. Ahora, agregue 200 microlitros de un microgramo por mililitro una solución roja del nilo a cada pozo, y entumece hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, agregue 20 microlitros de 50% de solución de lejía a cada pozo, y entumegue hacia arriba y hacia abajo cinco veces para mezclar bien.Deje la placa para incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lea la florescencia en las muestras cada cinco a 10 minutos a 530 nanómetros de excitación, emisión de 575 nanómetros, con cortes automáticos establecidos en 570 nanómetros hasta que la señal de las muestras de algas se estabilice. Este procedimiento produce un curso de tiempo de datos de densidad óptica de algel a 550 nanómetros OD.Los cultivos de control se cultivaron en un nuevo anate NH4 medio. El tratamiento uno, es co-cultivos auxenochlorella protothecoides y azospirillum brasiliense cultivados en medio NH4 innato fresco. El tratamiento dos, es un A.Protothecoides azinic cultivado en medio innato NH4 complementado con 50 miligramos por mililitro IAA, que inhibió completamente el crecimiento de algas.Tratamiento tres, es azinic A.Protothecoides, cultivado en medio gastado de A.Brasilienes. Las curvas de crecimiento muestran cultivos de auxenochlorella protothecoides entran en crecimiento logarítmico tardío a las 120 horas. Aquí se muestran curvas de corelación entre la densidad óptica a 550 nanómetros y la concentración final de peso seco, utilizando un ajuste polinomio de segundo orden.Por último, la coloración se puede aplicar a los datos de densidad óptica del curso de tiempo para obtener una curva de crecimiento de peso seco. Los mismos tratamientos se utilizan aquí, excepto que la clorella sorokiniana se cultiva en lugar de auxenochlorella protothecoides. Por porcentaje de lípido neutro de peso seco obtenido en el ensayo de lípidos neutros se correlaciona bien con el contenido de glicerol de tríos en una placa de cromatografía de capa delgada correspondiente.A diferencia de A.Protothecoides, el tratamiento con IAA no inhibió el crecimiento de C.Sorkiniana. Después de la extracción de lípidos de las algas, el palet celular restante se puede analizar para su contenido de almidón y pared celular, proporcionando una imagen más detallada de los productos de almacenamiento de energía dentro de la célula. Los métodos descritos aquí han permitido nuevos descubrimientos en el campo de los biocombustibles de algel y el tratamiento de aguas residuales.Específicamente, Este sistema se ha utilizado para entender mejor cómo las bacterias influyen en el crecimiento de algel.

Research

JoVE Journal

Environment

Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Análisis de contenido de ácido graso y Composición en microalgas

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

Investigación

Medio ambiente

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Optimizar la combustión Gas Ciudad para promover el crecimiento de microalgas en fotobiorreactores a través de Simulaciones computacionales

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Transcripción y metabolito de perfiles para la Evaluación de árbol Tabaco y Poplar como materia prima para la industria basada en Bio

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

La cuantificación de los metales pesados ​​y otros contaminantes inorgánicos en la productividad de microalgas

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Medición y mapeo de patrones de erosión y deposición relacionadas las concentraciones de carbonato de suelo bajo manejo agrícola

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Colección y extracción de muestras de aire profesional para análisis de ADN fúngico

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

La prueba de infección de planta: Spray y mediada por la herida la inoculación con el patógeno de planta Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Un análisis de anaerobios biosensores para la detección de mercurio y cadmio

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Detección de Tilapia lago Virus usando RT-PCR convencional y SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Aislamiento químico, cuantificación y separación de los lípidos de la piel de los Reptiles

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...