Name: induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

نود أن نعترف مختبر لين كريستنسون لتوفير آلة PCR الرقمية المستخدمة في هذه التجارب والدعم التقني المقدمة. ونود أيضا أن نشكر الدكتور توماس يانكي على توجيهه وإرشاده. وقد حظيت هذه الدراسات بدعم مؤسسة تريب فاميلي.

وقد أجريت جميع تجارب الماوس في الامتثال، وبموافقة من، مركز جامعة كانساس الطبي المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها لجنة. تم الحصول على جميع عينات الدم البشري السليمة بموافقة مستنيرة وبموافقة من مجلس المراجعة المؤسسية في المركز الطبي بجامعة كانساس.
1. تشعيع الفئران NSG
<ol><li...

<ol>
	<li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li><li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+3+clinical+trial+of+steroids/mycophenolate+mofetil+vs+steroids/placebo+as+therapy+for+acute+GVHD:+BMT+CTN+0802.">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), 3221-3227 (2014).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation.">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use,+older+recipient+age,+and+use+of+unrelated+donors.">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li><li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era.">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li><li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex.">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li><li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+antimurine+xenogeneic+cytotoxic+response.+I.+Dependence+on+responder+antigen-presenting+cells.">The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice.">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li><li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes,+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease.">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4(+)+or+CD8.">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li><li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism.">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li><li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells.">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals.">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).</li><li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8.">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Sykes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR.">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li><li>Vitale, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+to+evaluate+estrogen+receptor+gene+mutations+in+small+amounts+of+cell-free+DNA.">An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA.</a> Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).</li><li>Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+and+liquid+biopsy:+opportunities,+challenges,+and+recent+advances+in+detection+technologies.">Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies.</a> Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li><li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation:+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review.">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li><li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+human+T+cell+engraftment,+trafficking,+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD/SCID+beta2mnull+mice.">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li><li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein:+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).</li><li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-/-+gammac-/-+double-mutant+mice.">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li><li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues.">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation?.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?.</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li></ol>

تطور المرض هو عموما متسقة في نموذج xenoGVHD، حتى مع حقن PBMC من مختلف الجهات المانحة، لذلك يمكن الجمع بين تجارب متعددة. الخطوات الرئيسية المطلوبة للحفاظ على هذا الاتساق هي تقنية الحقن i.v. المناسبة، والعمى والتهديف متسقة. وأظهرت دراسة أجراها نيرفي وآخرون25 أنه بالمقارنة مع حقن الوريد...

أصبحت زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم اللوجينية (HSCT) العلاج الروتيني للمرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية مثل سرطان الدم مع سوء التكهن. ومن المضاعفات الهامة لمرض HSCT مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف الحاد (GVHD). وأفادت دراسة أجريت في عام 2012 أن مرض نقص المناعة البشرية الحاد ة تطور في 39٪ من مرضى HSCT الذين يتلقون عمليات زرع من المتبرعين الأشقاء و 59٪ من المرضى الذين يتلقون عمليات زرع من متبرعين غير ذوي صلة1. تحدث GVHD الحادة عندما تهاجم الخلايا T المشتقة من الجهات المانحة أعضاء المتلقي. العلاج الناجح الوحيد لGVHD هو العلاج مع الأدوية المثبطة للمناعة للغاية2، والتي هي شديدة السمية وزيادة خطر العدوى وتكرار الورم. وهكذا، على الرغم من التحسينات التي أدخلت على البقاء على قيد الحياة GVHD الحاد في السنوات الأخيرة3،4،5، لا تزال هناك حاجة ماسة لتحسين العلاجات GVHD مع الحد الأدنى من السمية التي تعزز مغفرة طويلة الأجل.
الهدف العام من الطرق التالية هو حث وتسجيل XEnogeneic GVHD (xenoGVHD). تم تطوير نموذج xenoGVHD كأداة للحث على GVHD الحاد مع الخلايا البشرية بدلا من خلايا المورين مما يسمح للترجمة المباشرة أكثر من البحوث GVHD قبل السريرية إلى التجارب السريرية6. ينطوي هذا النموذج على حقن خلايا الدم الطرفية أحادية النووية البشرية عن طريق الوريد (PBMC) في الفئران NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) التي يتم تشعيعها دون مميت. يتم تنشيط الخلايا T البشرية المحقونة من قبل مستضد الإنسان تقديم الخلايا (APCs) تقديم مستضد المورين والخلايا T تنشيط الهجرة إلى الأنسجة البعيدة مما أدى إلى التهاب الجهازية والموت في نهاية المطاف6،7، 8 , 9 , 10.علم الأمراض والتقدم في نموذج xenoGVHD يحاكي عن كثب الإنسان الحاد GVHD. على وجه التحديد، والخلايا T البشرية المسببة للأمراض هي رد فعل على murine الرئيسية البروتينات مجمع التوافق النسيجي (MHC)، والتي تشبه alloreactivity الخلية T في GVHD الإنسان6،9. الميزة الأساسية لنموذج xenoGVHD على نموذج الماوس MHC عدم التطابق, نموذج GVHD الأخرى المستخدمة على نطاق واسع, هو أنه يسمح لاختبار العلاجات على الخلايا البشرية بدلا من خلايا المورين. وهذا يسمح لاختبار المنتجات التي يمكن ترجمتها مباشرة إلى العيادة دون أي تعديلات لأنها مصنوعة لاستهداف الخلايا البشرية. في الآونة الأخيرة، وقد استخدم هذا النموذج لاختبار الإنسان المضادة IL-2 الأجسام المضادة11،والخلايا T التنظيمية الثيمية البشرية (Tregs)12 والخلايا الجذعية mesenchymal الإنسان13 كعلاجات محتملة لGVHD الحاد. في سياق أوسع, ويمكن استخدام هذا النموذج كفحص قمع في الجسم الحي لأي نوع من المخدرات أو الخلية التي يمكن أن قمع نشاط الخلايا T الإنسان. فعلى سبيل المثال، استخدم Stockis et al.14 نموذج xenoGVHD لدراسة تأثير منع integrin αVβ8 على النشاط القمعي Treg في الجسم الحي. وهكذا، يمكن أن يوفر نموذج xenoGVHD نظرة ثاقبة في آلية أي علاج يستهدف الخلايا T في إعداد في الجسم الحي.
وهناك طريقة إضافية موصوفة في هذا البروتوكول هي كيفية الكشف عن الخلايا T البشرية في أنسجة الماوس باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR). والهدف من هذه الطريقة هو تقديم أداة لقياس الهجرة وانتشار الخلايا T في الأنسجة المستهدفة، والتي تقيس فعالية العلاجات المثبطة للمناعة التي يجري اختبارها في هذا النموذج. dPCR هو طريقة جديدة نسبيا للقياس الكمي للأحماض النووية15. باختصار، ينقسم خليط تفاعل PCR إلى أقسام تحتوي على أعداد صغيرة من التسلسل المستهدف أو لا يوجد هدف على الإطلاق. ثم يتم تضخيم التسلسل المستهدف واكتشافه باستخدام الأصباغ المتداخلة للحمض النووي أو المسبارات الفلورية الخاصة بالهدف. dPCR كميا عدد نسخ من التسلسل المستهدف على أساس جزء من أقسام إيجابية وإحصاءات بواسون15،16. الكشف عن الخلايا T مع dPCR يتطلب أنسجة أقل بكثير مقارنة مع الطرق البديلة الأخرى، بما في ذلك قياس التدفق والنسيج، ويمكن القيام به على الأنسجة المجمدة أو الثابتة. لا يتطلب dPCR منحنى قياسي لتحديد أرقام النسخ، كما لا يلزم إجراء نسخ متماثل تقني. وهذا يقلل من كمية الكاشف والحمض النووي القالب اللازمة لdPCR مقارنة PCR الكمية التقليدية (qPCR)16. تقسيم رد فعل PCR إلى ردود فعل فرعية في dPCR يركز بشكل فعال الأهداف17. وبالتالي، فإن dPCR هو في المقام الأول أداة للكشف عن الأهداف النادرة في كمية كبيرة من الحمض النووي غير المستهدف. على سبيل المثال، يتم استخدام dPCR للكشف عن التلوث البكتيري في الحليب18،وتحديد الطفرات النادرة في الجينات مستقبلات الإستروجين19،والكشف عن تعميم الحمض النووي الورم في دم المرضى20. في هذا البروتوكول، dPCR بمثابة أداة فعالة للكشف عن وقياس الخلايا T البشرية في أنسجة الفئران مع xenoGVHD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;L Ranin pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17001118</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well ddPCR plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EZ-178</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>PM1002</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>1811318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45001750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Irradiator Pie Cage</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>MPC 1</td>
			<td>Holds up to 11 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4&#34;)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetaid Gilson Macroman</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F110756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013805</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase and DNase-free plate seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12565491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Advanced 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Pads (2&#34; x 2&#34;, 12-Ply)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reservoir</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgial Scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600393-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650914-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr

يعد مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف الحاد (GVHD) قيدًا كبيرًا على المرضى الذين يتلقون زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم كعلاج لنقص الدم والأورام الخبيثة. يحدث GVHD الحاد عندما تعترف الخلايا T المانحة الأنسجة المضيفة كمستضد أجنبي وجبل استجابة مناعية للمضيف. وتشمل العلاجات الحالية الأدوية المثبطة للمناعة السامة التي تجعل المرضى عرضة للعدوى والتكرار. وهكذا، هناك بحوث جارية لتوفير العلاج الحاد GVHD التي يمكن أن تستهدف بشكل فعال الخلايا T المانحة والحد من الآثار الجانبية. يستخدم الكثير من هذا العمل قبل السريرية نموذج المورين GVHD xenogenic (xenoGVHD) الذي يسمح لاختبار العلاجات المثبطة للمناعة على الخلايا البشرية بدلا ً من خلايا المورين في نظام في الجسم الحي. يحدد هذا البروتوكول كيفية حث xenoGVHD وكيفية العمى وتوحيد التهديف السريري لضمان نتائج متسقة. بالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام PCR الرقمية للكشف عن الخلايا T البشرية في أنسجة الماوس، والتي يمكن استخدامها في وقت لاحق لتحديد فعالية العلاجات المختبرة. نموذج xenoGVHD ليس فقط يوفر نموذجا لاختبار العلاجات GVHD ولكن أي علاج يمكن قمع الخلايا T البشرية، والتي يمكن بعد ذلك تطبيقها على العديد من الأمراض الالتهابية.

بدأت فئران NSG القديمة التي تُعفى بالأشعة تحت الأربعة واللاإنسانية واللاإنسانية واللاإنسانية واللاإنسانية والمهينة من كلا الجنسين التي تلقت PBMC البشري تظهر علامات سريرية لـ GVHD حول اليوم 10 بعد الحقن مقارنة بفئران التحكم السلبية التي تلقت PBS فقط (الشكل1A). وك...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

الحث والتهديف من مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف في نموذج المورين Xenogeneic والقياس الكمي للخلايا تي البشرية في أنسجة الماوس باستخدام PCR الرقمية

هنا، نقدم بروتوكولللحث على وتسجيل المرض في نموذج الكسب غير المشروع مقابل المضيف xenogeneic (xenoGVHD). xenoGVHD يوفر نموذج في الجسم الحي لدراسة كبت المناعة للخلايا T البشرية. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نصف كيفية الكشف عن الخلايا T البشرية في الأنسجة مع PCR الرقمية كأداة لتحديد كمية كبت المناعة.

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

يحدد هذا البروتوكول كيفية الحث على مرض xenograft مقابل المضيف ، أو xenoGVHD ، وكيفية العمى وتوحيد التهديف السريري لضمان النتائج المتسقة. نموذج xenoGVHD يوفر طريقة في الجسم الحي لاختبار العلاجات المثبطة للمناعة ضد الخلايا البشرية بدلا من مورين T، وتحسين ترجمة هذه الدراسات إلى العيادة. ومن خلال هذا الإجراء سيكون عمارة سنغ، وهي طالبة دراسات عليا من مختبري.قبل يوم واحد من الحقن، ضع شعا السكري غير البدين الذي يبلغ من العمر ثمانية إلى 12 أسبوعًا، أو NSG، الفئران في قفص فطيرة معقمة، وتشعع الفئران في مصدر سيزيوم-137 بجرعة إجمالية قدرها 150 مئوية، مع دوران بطيء لضمان حتى التشعيع. ثم، ضع الفئران في أقفاص نظيفة في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، وجمع ما يكفي من الدم البشري السليم لعزل 1.1 مرة 10 إلى سبع خلايا أحادية النوى الدم الطرفية، أو PBMCs، لكل فأر، وتمييع الدم heparinized في حجم متساو من مصل البقر الجنينية 2٪، أو FBS، في برنامج تلفزيوني.تراكب بعناية تصل إلى 25 ملليلتر من الدم المخفف على 15 ملليلتر من متوسطة تدرج كثافة الفصل اللمفاوي في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر للانفصال الانحداري للتدرج الكثافة. في نهاية الفصل، والحصاد PBMC في واجهة، وغسل الخلايا في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر. التعرق، ونفض الغبار الأنبوب لتخفيف بيليه.Resuspend PBMCs في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد للطرد المركزي آخر ، تليها resuspension في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد للعد. ثم، وجمع الخلايا مع الطرد المركزي النهائي، وإعادة تعليق بيليه في مرة واحدة 10 إلى PBMCs ثمانية لكل ملليلتر من تركيز برنامج تلفزيوني. بالنسبة للتسليم المداري الرجعي لـ PBMC البشري المعزول في عين الماوس ، قم بتحميل حقنة واحدة ذات ملليلتر مجهزة بإبرة من عيار 28 مع 100 ميكرولتر من الخلايا.تأكد من عدم الاستجابة لقرصة إصبع الإصبع، وكبح جماح الماوس بلطف باستخدام الإبهام والإصبع الأوسط. إدراج إبرة شطبة الجانب إلى أسفل، الجانبي في كانثوس الوسطى، من خلال غشاء الملتحمة حتى يتم التوصل إلى الجزء الخلفي من العين. تراجع قليلا الإبرة، وحقن ببطء حجم كامل من الخلايا.ثم، تراجع تماما الإبرة للتخلص السليم من الحقنة والإبرة. أغلق الجفن، واتّض الضغط الخفيف على موقع الحقن مع إسفنجة شاش. ثم، فحص موقع الحقن للتورم أو غيرها من الصدمات المرئية، والسماح للماوس لاستعادة وعيه في قفص معقمة اصطف مع المناشف الورقية والرصد قبل نقل الحيوان إلى قفص منزله.لقياس درجة GVHD، ضع القفص في غطاء تدفق لامينار، وإزالة الطعام والماء من القفص. لتسجيل النشاط، مراقبة سلوك الفئران لمدة خمس دقائق. للحصول على درجة فقدان الوزن، وزن كل فأرة في كوب زجاجي.في حين أن الماوس لا يزال في القارس، تفقد الحيوان لوضعية، نسيج الفراء، وسلامة الجلد. بعد حصاد الأنسجة ذات الاهتمام ، قطع ما يقرب من ثلاثة في 0.5 ملليمتر قطعة من الأنسجة من الجهاز ، ووزنها العينة على التوازن. نقل الأنسجة المرجحة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر معقمة، و المفاجئة تجميد العينة في النيتروجين السائل لتخزين بين عشية وضحاها في ناقص 80 درجة مئوية.في صباح اليوم التالي ، ذوبان العينات قبل التحلل ، وفقا للتعليمات من مجموعة عزل الحمض النووي الجينومي. بالنسبة لتكينات الخلايا التى البشرية عن طريق تفاعل البوليميراز الرقمي المتسلسل، أو PCR، قم بإعداد تفاعلات PCR الرقمية وفقًا للبروتوكول الخاص بصبغات ربط الحمض النووي للحمض النووي الصبغية لل PCR الرقمية التي يتم استخدامها واستخدام الاعوام المناسبة للحمض النووي الجينومي CD3 epsilon. ثم، تنفيذ تفاعل PCR الرقمية في ظل ظروف رد الفعل المناسبة.sublethed إشعاعا من ثمانية إلى 12 أسبوعا الفئران NSG القديمة من كلا الجنسين التي تتلقى PBMC الإنسان تبدأ في عرض العلامات السريرية لGVHD حول اليوم 10 بعد الحقن بالمقارنة مع الفئران التحكم السلبي تعامل مع برنامج تلفزيوني فقط. فئران XenoGVHD لديها متوسط البقاء على قيد الحياة من 23.5 يوما. باستخدام PCR الرقمية، CD3 epsilon إيجابية يمكن الكشف عن الخلايا التائية الإنسان في الرئة والكبد عينات من الفئران التي تتلقى PBMCs الإنسان.ومن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ التهديف باستمرار وأن الباحث الذي يسجل الفئران أعمى عن علاجها. بعد هذا الإجراء، يمكن جمع المصل من الفئران القتل الرحيم لتحليل التعبير السيتوكين المحيطي، ويمكن جمع الخلايا المناعية من الطحال للتحليل عن طريق تدفق الخلايا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

تحريض التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ في الفئران وتقييم توزيع الأمراض التي تعتمد على خلايا المناعة في الأنسجة المختلفة

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

التعريفي للشلل وإصابة النظام المرئي في الفئران التي تي الخلايا المحددة للبصري المياليني أقوابورين أوتوانتيجين-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

التعريفي للابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض وتقييمها بالمنظار ميني في الفئران حية

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا التطبيب في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...