Name: induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

Vi vil gerne anerkende laboratoriet i Lane Christenson for at levere den digitale PCR-maskine, der anvendes i disse eksperimenter, og for den leverede tekniske support. Vi vil også gerne takke Dr. Thomas Yankee for hans vejledning og mentorskab. Disse undersøgelser blev støttet af Tripp Family Foundation.

Alle mus eksperimenter blev udført i overensstemmelse, og med godkendelse fra, University of Kansas Medical Center institutionel Animal Care og brug udvalg. Alle raske humane blodprøver blev indhentet underinformeret samtykke og med godkendelse fra den institutionelle revisions tavle på University of Kansas Medical Center.
1. bestråling af NSG-mus
<ol><li>En dag før PBMC injektion, bestråle 8 – 12-ugers gamle NSG mus (begge køn kan bruges). I et sterilt biosikkerhedskabinet placeres...

<ol>
	<li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li><li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+3+clinical+trial+of+steroids/mycophenolate+mofetil+vs+steroids/placebo+as+therapy+for+acute+GVHD:+BMT+CTN+0802.">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), 3221-3227 (2014).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation.">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use,+older+recipient+age,+and+use+of+unrelated+donors.">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li><li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era.">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li><li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex.">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li><li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+antimurine+xenogeneic+cytotoxic+response.+I.+Dependence+on+responder+antigen-presenting+cells.">The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice.">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li><li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes,+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease.">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4(+)+or+CD8.">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li><li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism.">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li><li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells.">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals.">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).</li><li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8.">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Sykes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR.">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li><li>Vitale, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+to+evaluate+estrogen+receptor+gene+mutations+in+small+amounts+of+cell-free+DNA.">An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA.</a> Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).</li><li>Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+and+liquid+biopsy:+opportunities,+challenges,+and+recent+advances+in+detection+technologies.">Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies.</a> Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li><li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation:+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review.">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li><li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+human+T+cell+engraftment,+trafficking,+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD/SCID+beta2mnull+mice.">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li><li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein:+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).</li><li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-/-+gammac-/-+double-mutant+mice.">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li><li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues.">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation?.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?.</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li></ol>

Sygdomsprogression er generelt konsistent i xenoGVHD-modellen, selv med injektion af PBMC fra forskellige donorer, så flere eksperimenter kan kombineres. De vigtigste skridt, der kræves for at opretholde denne konsistens er korrekt i.v. injektion teknik, blændende og konsekvent scoring. En undersøgelse foretaget af Nervi et al.25 viste, at sammenlignet med intravenøs hale vene injektion resulterede retroorbital injektioner af PBMC i mere konsistent engraftment og mere alvorlig gvhd. Leon-Rico...

Allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) er blevet rutinemæssig behandling for patienter, som lider af hæmatologiske maligniteter såsom leukæmi med dårlig prognose. En signifikant komplikation af HSCT er akut graft-versus-Host-sygdom (GVHD). En 2012 undersøgelse rapporterede, at akut GVHD udviklet i 39% af HSCT patienter, der modtager transplantationer fra søskende donorer og 59% af patienter, der modtager transplantationer fra ikke-forretningsmæssigt forbundne donorer1. Akut GVHD opstår, når donor-afledte T-celler angriber modtagerens organer. Den eneste vellykkede behandling for GVHD er behandling med meget Immunsuppressive lægemidler2, som er meget giftige og øger risikoen for infektion og tumor gentagelse. På trods af forbedringer, der er foretaget i akut gvhd overlevelse i de seneste år3,4,5, er der stadig et kritisk behov for forbedrede gvhd-terapier med minimal toksicitet, der fremmer langsigtet remission.
Det overordnede mål med følgende metoder er at inducere og score xenogene gvhd (xenogvhd). XenoGVHD-modellen blev udviklet som et værktøj til at inducere akut GVHD med humane celler i stedet for murinceller, der giver mulighed for mere direkte oversættelse af præklinisk GVHD-forskning til kliniske forsøg6. Denne model involverer intravenøst injiceret humant perifert blod mononukleære celler (PBMC) i NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) mus, der er sublethally bestrålet. Injicerede humane t-celler aktiveres af humane antigen præsentations celler (apc'er), der præsenterer murin-antigen, og de aktiverede t-celler migrerer til fjernt væv, hvilket resulterer i systemisk inflammation og i sidste ende død6,7, 8 , 9 , 10. sygdoms patologi og progression i xenoGVHD-modellen nøje efterligner humant akut gvhd. Specifikt er de patogene humane T-celler reaktive over for murine Major komplekse Complex (MHC) proteiner, som svarer til T-cellens alloreactivity i human gvhd6,9. Den primære fordel ved xenoGVHD-modellen over musens MHC-mismatch-model, den anden udbredte GVHD-model, gør det muligt at teste terapier på humane celler i stedet for murinceller. Dette giver mulighed for afprøvning af produkter, der direkte kan oversættes til klinikken uden ændringer, fordi de er lavet til at målrette humane celler. For nylig er denne model blevet brugt til at teste et humant anti-IL-2 antistof11, humane thymiske regulatoriske T-celler (Tregs)12 og humane mesenchymale stamceller13 som potentielle behandlinger for akut gvhd. I en bredere sammenhæng, denne model kan bruges som en in vivo suppression analyse for enhver stof eller celletype, der kan undertrykke menneskelig T celle aktivitet. F. eks. brugte stockis et al.14 xenogvhd-modellen til at undersøge effekten af blokering af anti αvβ8 på treg suppressiv aktivitet in vivo. Derfor kan xenoGVHD-modellen give indsigt i mekanismen i enhver terapi, som målretter mod T-celler i en in vivo-indstilling.
En yderligere metode beskrevet i denne protokol er, hvordan man opdager humane T-celler i mus væv ved hjælp af digital polymerase kædereaktion (dPCR). Målet med denne metode er at tilbyde et værktøj til at kvantificere migration og spredning af T-celler i målvæv, som måler effekten af immunosuppressive behandlinger, der testes i denne model. dPCR er en forholdsvis ny metode til kvantificering af nukleinsyrer15. Kort sagt er PCR-reaktionsblandingen opdelt i partitioner, der indeholder små tal af målsekvensen eller intet mål overhovedet. Målsekvensen forstærkes og detekteres ved hjælp af DNA-interkalerende farvestoffer eller fluorescerende målspecifikke sonder. dpcr kvantificerer antallet af kopier af Target sekvens baseret på brøkdel af positive partitioner og Poissons statistik15,16. Påvisning af T-celler med dPCR kræver meget mindre væv sammenlignet med andre alternative metoder, herunder flow cytometri og histologi, og kan udføres på frosset eller fast væv. dPCR kræver ikke en standardkurve for at bestemme kopi numre, og der kræves heller ikke tekniske replikater. Dette reducerer mængden af reagens og skabelon-DNA, der er nødvendigt for dPCR sammenlignet med traditionel kvantitativ PCR (qPCR)16. Opdeling af PCR-reaktionen i sub-reaktioner i dPCR koncentrerer mål17. DPCR er således primært et værktøj til påvisning af sjældne mål i en stor mængde ikke-måldna. For eksempel bruges dPCR til at påvise bakteriel kontaminering i mælk18, identificere sjældne mutationer i østrogen receptor genet19og detektere cirkulerende tumor DNA i blodet hos patienter20. I denne protokol fungerer dPCR som et effektivt værktøj til påvisning og kvantificering af humane T-celler i væv hos mus med xenoGVHD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;L Ranin pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17001118</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well ddPCR plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EZ-178</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>PM1002</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>1811318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45001750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Irradiator Pie Cage</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>MPC 1</td>
			<td>Holds up to 11 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4&#34;)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetaid Gilson Macroman</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F110756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013805</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase and DNase-free plate seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12565491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Advanced 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Pads (2&#34; x 2&#34;, 12-Ply)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reservoir</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgial Scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600393-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650914-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr

Akut graft-versus-Host-sygdom (GVHD) er en signifikant begrænsning for patienter, der får hæmatopoietisk stamcelletransplantation som behandling for hæmatologiske mangler og maligniteter. Akut GVHD opstår, når donor-T-celler genkender værts vævet som et fremmed antigen og monterer et immunrespons over for værten. Nuværende behandlinger involverer giftige immunosuppressive lægemidler, der gør patienter modtagelige for infektion og gentagelse. Således, der er igangværende forskning for at give en akut GVHD terapi, der effektivt kan målrette donor T celler og reducere bivirkninger. Meget af dette prækliniske arbejde bruger xenogen GVHD (xenoGVHD) murine model, der giver mulighed for testning af immunosuppressive behandlinger på humane celler i stedet for murine celler i et in vivo-system. Denne protokol skitserer, hvordan xenoGVHD fremkalder, og hvordan man blinde og standardiserer klinisk scoring for at sikre ensartede resultater. Derudover beskriver denne protokol, hvordan man bruger digital PCR til at detektere humane T-celler i musens væv, som efterfølgende kan anvendes til at kvantificere effekten af testede terapier. XenoGVHD-modellen giver ikke kun en model til at teste GVHD-terapier, men enhver terapi, der kan undertrykke humane T-celler, som derefter kan anvendes til mange inflammatoriske sygdomme.

Sublethally bestrålet 8-12-ugers gamle NSG-mus af begge køn, der fik humant PBMC, viste kliniske tegn på GVHD omkring dag 10 efter injektion sammenlignet med negative kontrolmus, der kun modtog PBS (figur 1a). XenoGVHD-mus havde en Median overlevelse på 23,5 dage (figur 1b). Med digital PCR kunne CD3 Epsilon positive humane T-celler påvises i lunge-og leverprøver af mus, der fik humant PBMC. Vævsprøver fra mus, der injice...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion og scoring af graft-versus-Host-sygdom i en xenogen Murinmodel og kvantificering af humane T-celler i muse væv ved hjælp af digital PCR

Her præsenterer vi en protokol til at inducere og score sygdom i en xenogene graft-versus-Host disease (xenogvhd) model. xenoGVHD giver en in vivo-model til at studere immunsuppression af humane T-celler. Derudover beskriver vi, hvordan man opdager humane T-celler i væv med digital PCR som et redskab til at kvantificere immunsuppression.

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Denne protokol skitserer, hvordan man fremkalder xenograft-versus-host sygdom, eller xenoGVHD, og hvordan man blind og standardisere klinisk scoring for at sikre ensartede resultater. Den xenoGVHD model giver en in vivo metode til test immunsuppressive behandlinger mod menneskelige snarere end murine T-celler, forbedre oversættelsen af disse undersøgelser til klinikken. Demonstration af proceduren vil være Amara Seng, en kandidat studerende fra mit laboratorium.En dag før injektionen, sted otte-til 12-uger gamle, ikke-fede diabetisk scid gamma, eller NSG, mus i en steriliseret pie bur, og bestråle musene i en cæsium-137 kilde med en samlet dosis på 150 centigrays, med en langsom rotation for at sikre en endnu bestråling. Derefter placere musene i rene bure i en steril biosikkerhed kabinet natten over. Den næste morgen, indsamle nok sundt humant blod til at isolere 1,1 gange 10 til de syv perifere blod mononukleare celler, eller PBCS, per mus, og fortyndes hepariniseret blod i et tilsvarende volumen på 2% føtal kvæg serum, eller FBS, i PBS.Overlejrer omhyggeligt op til 25 milliliter af det fortyndede blod på 15 milliliter lymfocytseparationstæthedsgradient i et konisk rør på 50 milliliter for massevisancecentrifugering. Ved afslutningen af adskillelsen høstes PBMC ved grænsefladen, og cellerne vaskes i 10 milliliter PBS i et nyt 50-milliliter konisk rør. Inspirer supernatanten, og svirp røret for at løsne pellet.Opsælg pbm'erne igen i 10 milliliter frisk PBS til endnu en centrifugering efterfulgt af resuspension i fem milliliter frisk PBS til tælling. Derefter indsamles cellerne med en endelig centrifugering, og opslæmmet pellet på en gang 10 til de otte PBM'er pr. milliliter PBS koncentration. For retro-orbital levering af det isolerede menneskelige PBMC i museøjet, belastning en en-milliliter sprøjte udstyret med en 28-gauge nål med 100 mikroliter af celler.Bekræft manglende reaktion på tåspidsspids, og behers forsigtigt musen med tommel- og langfingeren. Sæt nålen facet-side ned, lateral i mediale canthus, gennem konjunktival membranen, indtil bagsiden af øjet er nået. Træk nålen lidt tilbage, og injicer langsomt hele mængden af celler.Træk derefter kanylen helt tilbage for at bortskaffe sprøjten og kanylen korrekt. Luk øjenlåget, og påfør mildt tryk på injektionsstedet med en gazesvamp. Derefter undersøge injektionsstedet for hævelse eller andre synlige traumer, og lad musen genvinde bevidstheden i et sterilt bur foret med papirhåndklæder og overvågning, før du flytter dyret til sit hjem bur.For at måle GVHD score, placere buret i en laminar flow hætte, og fjerne mad og vand fra buret. For at score aktiviteten skal du observere musenes opførsel i fem minutter. For at opnå et vægttab score, vejer hver mus i et glas bægerglas.Mens musen stadig er i bægeret, inspicere dyret for kropsholdning, pels tekstur, og hudens integritet. Efter høst væv af interesse, skæres en ca tre-by-0,5-millimeter stykke væv fra orglet, og afveje prøven på en balance. Det vægtede væv overføres til et sterilt 1,5 milliliterrør, og prøven fastfryses i flydende nitrogen til opbevaring natten over ved minus 80 grader Celsius.Den næste morgen, tø prøverne før lysis, ifølge instruktionerne fra en genomisk DNA isolation kit. For kvificering af human T-celle ved hjælp af digital polymerasekædereaktion eller PCR skal digitale PCR-reaktioner i henhold til protokollen for DNA-bindingsfarvestoffer til den digitale PCR-maskine anvendes og anvende passende primere til humant CD3 epsilongen genomisk DNA. Derefter udføres den digitale PCR-reaktion under de relevante reaktionsforhold.Enkeltvis bestrålet otte til 12-ugers gamle NSG mus af begge køn, der modtager humane PBMC begynde at vise kliniske tegn på GVHD omkring dag 10 post-injektion sammenlignet med negative kontrol mus behandlet med PBS kun. XenoGVHD-mus har en median overlevelse på 23,5 dage. Ved hjælp af digital PCR, CD3 epsilon-positive menneskelige T-celler kan påvises i lungerne og leveren prøver af mus, der modtager menneskelige PBCS.Det er afgørende, at scoringen udføres konsekvent, og at forskeren, der scorer musene, bliver blændet af deres behandling. Efter denne procedure kan serum indsamles fra aflivede mus til perifer cytokinudtryksanalyse, og immunceller kan indsamles fra milten til analyse via flowcytometri.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion af graft-versus-host sygdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell Monitoring Brug en MHC-matchet murin model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion af Experimental Autoimmune Encephalomyelitis i mus og evaluering af sygdommen-afhængige Fordeling af immunceller i forskellige væv

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induktion af lammelse og visuelle System skade i mus af T celler specifik for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induktion af Intestinal Graft - versus host klovesyge og sin Mini-endoskopisk vurdering i levende mus

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Kvantificering af prolifererende humane antigen-specifikke CD4+ T-celler ved hjælp af Carboxyfluorescein Succinimidyl ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Knoglemarvstransplantation platform til at undersøge den rolle, dendritiske celler i Graft-versus-Host Sygdom

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...