Name: induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

היינו רוצים להכיר את המעבדה של ליין Christenson לספק את מכונת ה-PCR הדיגיטלי המשמש ניסויים אלה ועל התמיכה הטכנית סיפק. אנחנו רוצים גם להודות לד ר תומס יאנקי על הדרכתו והמנטורה שלו. מחקרים אלה תמכו בקרן משפחת טריפ.

כל הניסויים בעכבר בוצעו בהתאם, ובאישור, המרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש. כל דגימות הדם האנושיות הבריאים הושגו תחת הסכמה מושכלת ובאישור ממועצת הסקירה המוסדית במרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס.
1. הקרנה של עכברים NSG
<ol><li>יום אחד לפני הזרקת...

<ol>
	<li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li><li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+3+clinical+trial+of+steroids/mycophenolate+mofetil+vs+steroids/placebo+as+therapy+for+acute+GVHD:+BMT+CTN+0802.">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), 3221-3227 (2014).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation.">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use,+older+recipient+age,+and+use+of+unrelated+donors.">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li><li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era.">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li><li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex.">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li><li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+antimurine+xenogeneic+cytotoxic+response.+I.+Dependence+on+responder+antigen-presenting+cells.">The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice.">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li><li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes,+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease.">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4(+)+or+CD8.">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li><li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism.">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li><li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells.">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals.">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).</li><li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8.">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Sykes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR.">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li><li>Vitale, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+to+evaluate+estrogen+receptor+gene+mutations+in+small+amounts+of+cell-free+DNA.">An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA.</a> Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).</li><li>Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+and+liquid+biopsy:+opportunities,+challenges,+and+recent+advances+in+detection+technologies.">Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies.</a> Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li><li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation:+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review.">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li><li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+human+T+cell+engraftment,+trafficking,+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD/SCID+beta2mnull+mice.">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li><li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein:+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).</li><li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-/-+gammac-/-+double-mutant+mice.">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li><li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues.">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation?.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?.</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li></ol>

התקדמות המחלה היא עקבית בדרך כלל במודל xenoGVHD, אפילו עם הזרקה של התורמים שונים, כך ניסויים מרובים ניתן לשלב. השלבים העיקריים הנדרשים כדי לשמור על עקביות זו הם שיטת הזרקת העירוי הנכונה, מסנוור ועקבי הניקוד. מחקר של Nervi ואח '25 הפגינו כי בהשוואה הזרקת וריד הזנב, הזרקות רטרו מסלולית ש?...

להשתלת תא גזע המטמית (HSCT) הפכה לטיפול שגרתי עבור חולים הסובלים ממאירות המטולוגית כגון לוקמיה עם פרוגנוזה גרועה. סיבוך משמעותי של HSCT הוא השתל חריפה-מול-מארחים מחלה (GVHD). מחקר 2012 דיווחו כי GVHD חריפה שפותחה ב 39% מהחולים HSCT לקבל השתלות מתורמים אח ו 59% של חולים שקיבלו השתלות מתורמים שאינם קשורים1. GVHD חריפה מתרחשת כאשר התורם נגזר תאים T לתקוף איברים של המטופל. הטיפול המוצלח היחיד עבור GVHD הוא טיפול עם תרופות מדכאים חיסוני מאוד2, אשר רעילים מאוד להגדיל את הסיכון לזיהום והישנות הגידול. לפיכך, למרות שיפורים שנעשו בהישרדות gvhd חריפה בשנים האחרונות3,4,5, יש עדיין צורך חיוני עבור טיפולים משופרים של gvhd עם רעילות מינימלית המקדמים הפוגה ארוכת טווח.
המטרה הכוללת של השיטות הבאות היא לגרום ולהבקיע xenogeneic GVHD (Xenogeneic). מודל xenoGVHD פותחה ככלי כדי לגרום GVHD חריפה עם תאים אנושיים במקום תאים מורטין המאפשר תרגום ישיר יותר של מחקר GVHD מראש קליני ניסויים קליניים6. מודל זה כולל הזרקת באופן מובהק את התאים האנושיים היקפיים (PBMC) לתוך עכברים-SCID IL-2Rγnull (NSG) עכבר כי הם לקרינה משנית. מוזרק האדם תאים t מופעלים על ידי האדם אנטיגן הצגת תאים (apcs) הצגת אנטיגן murine ואת התאים הפעילים T להעביר לרקמות רחוקות וכתוצאה מכך דלקת מערכתית בסופו של דבר מוות6,7, בן שמונה , מיכל בן 10 , 10. המחלה פתולוגיה והתקדמות במודל xenoGVHD הדוק מקרוב האדם gvhd אקוטי. באופן ספציפי, התאים האנושיים T הפתוגניים הם מגיבים מערכת מורכבים היסטורתתאימות (mhc) חלבונים, אשר דומה לפעילות ה-alloreactivity של האדם gvhd6,9. היתרון העיקרי של מודל xenoGVHD מעל מודל התנגשות MHC העכבר, מודל GVHD בשימוש נרחב, הוא מאפשר בדיקות של טיפולים על תאים אנושיים ולא תאים מורקיים. זה מאפשר בדיקות של מוצרים שיכולים ישירות להיות מתורגם למרפאה ללא כל שינוי כי הם עשויים למקד את התאים האנושיים. לאחרונה, מודל זה נעשה שימוש כדי לבדוק את האדם anti-IL-2 נוגדן11, הגוף הרגיל הרתי T תאים (tregs)12 ותאי גזע mesenchymal אנושי13 כטיפולים פוטנציאליים עבור gvhd חריפה. בהקשר רחב יותר, מודל זה יכול לשמש כvivo לדיכוי של כל סוג של סם או תא שיכול לדכא את פעילות תא T האנושית. לדוגמה, Stockis ואח '14 השתמשו במודל xenoGVHD כדי ללמוד את ההשפעה של חסימת אינטגרציה αVβ8 על פעילות מדכאים treg ב vivo. כך, מודל xenoGVHD יכול לספק תובנה לתוך המנגנון של כל תרפיה לכוון תאים T ב vivo הגדרה.
שיטה נוספת המתוארת בפרוטוקול זה היא כיצד לזהות תאי T אנושיים ברקמות העכבר באמצעות תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלי (dPCR). המטרה של שיטה זו היא להציע כלי כדי לכמת הגירה והתפשטות של תאים T ברקמות היעד, אשר למדוד את היעילות של טיפולים חיסוניים מדכאים נבדק במודל זה. dPCR היא שיטה מקורית יחסית לקוונפיקציה של חומצות גרעין15. בקצרה, תערובת התגובה של ה-PCR מחולקת למחיצות המכילות מספר קטן של רצף היעד או ללא מטרה כלל. רצף היעד הוא לאחר מכן מוגבר וזוהה באמצעות צבעי DNA intercalating או היעד הספציפי המטרה-בדיקות ספציפיות. dpcr ככמת את מספר העותקים של רצף היעד בהתבסס על שבריר של מחיצות חיוביות וסטטיסטיקה של פואסון15,16. זיהוי תאים T עם dPCR דורש רקמות הרבה פחות לעומת שיטות חלופיות אחרות, כולל הזרמת cy, היסטולוגיה, וניתן לבצע על הרקמות קפוא או קבוע. dPCR אינו דורש עיקול רגיל כדי לקבוע מספרי עותקים, וגם לא משכפל טכני. זה מפחית את כמות ה-DNA של התבנית ואת התבניות הדרושות עבור dPCR בהשוואה ל-PCR כמותי מסורתי (qPCR)16. חלוקת תגובת ה-PCR לתגובות משנה ב-dPCR ביעילות מתמקדת במטרות17. לפיכך, dPCR הוא בעיקר כלי לזיהוי מטרות נדירות בכמות גדולה של דנ א שאינו מטרה. לדוגמה, dPCR משמש כדי לזהות זיהום חיידקי בחלב18, לזהות מוטציות נדירות בגן קולטן אסטרוגן19, ולזהות במחזור DNA גידול בדם של חולים20. בפרוטוקול זה, dPCR משמש כלי יעיל לזיהוי וכימות האדם בתאי T ברקמות של עכברים עם xenoGVHD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;L Ranin pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17001118</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well ddPCR plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EZ-178</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>PM1002</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>1811318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45001750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Irradiator Pie Cage</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>MPC 1</td>
			<td>Holds up to 11 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4&#34;)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetaid Gilson Macroman</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F110756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013805</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase and DNase-free plate seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12565491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Advanced 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Pads (2&#34; x 2&#34;, 12-Ply)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reservoir</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgial Scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600393-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650914-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr

השתל חריפה לעומת מארחים (GVHD) היא מגבלה משמעותית עבור חולים המקבלים השתלת תא גזע המטופאות כטיפול בליקויים המטולוגיים וממאירות. GVHD חריפה מתרחשת כאשר תאים התורם T לזהות רקמות מארח כמו אנטיגן זר והר תגובה חיסונית למארח. הטיפולים הנוכחיים כוללים תרופות מדכאים חיסוני רעיל הרינדור חולים הרגישים זיהום והישנות. כך, יש מחקר מתמשך כדי לספק טיפול GVHD חריפה שיכולים ביעילות למקד את תאי התורם T ולהפחית תופעות לוואי. הרבה מהעבודה הפרה-קלינית הזאת משתמשת במודל ה-GVHD (xenoGVHD) המאפשר בדיקה של טיפולים חיסוניים מדכאים על תאים אנושיים במקום תאים מורניים במערכת vivo. פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום ל-xenoGVHD וכיצד לעוור ולתקנן ניקוד קליני כדי להבטיח תוצאות עקביות. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש ב-PCR דיגיטלי כדי לזהות תאי T אנושיים ברקמות העכבר, אשר יכול לאחר מכן לשמש לכמת את היעילות של טיפולים נבדק. מודל xenoGVHD לא רק מספק מודל לבדוק טיפולים GVHD אבל כל טיפול שיכול לדכא את תאי T האדם, אשר לאחר מכן ניתן להחיל על מחלות דלקתיות רבות.

משנה לקרינה 8-12 שבוע עכברים NSG הישן של שני המינים שהתקבלו PBMC האדם התחיל להציג סימנים קליניים של GVHD סביב היום 10 לכתוב הזרקה לעומת עכברים שליטה שלילית שקיבלו PBS בלבד (איור 1A). לעכברים XenoGVHD היתה הישרדות חציון של 23.5 ימים (איור 1B). עם ה-PCR הדיגיטלי, CD...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום ולצבור מחלות ב-xenogeneic השתל-מול-מארח (Xenogeneic) מודל. xenoGVHD מספק מודל vivo כדי ללמוד דיכוי חיסוני של תאים האדם T. בנוסף, אנו מתארים כיצד לזהות תאים האדם T ברקמות עם PCR דיגיטלי ככלי כדי לכמת את הדיכוי החיסוני.

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום למחלת קסנוגרפט מול מארח, או xenoGVHD, וכיצד לעוור ולתקנן ניקוד קליני כדי להבטיח תוצאות עקביות. מודל xenoGVHD מספק שיטת in vivo לבדיקת טיפולים מדכאי חיסון נגד תאים אנושיים ולא מורין T, שיפור התרגום של מחקרים אלה למרפאה. הפגנת ההליך תהיה אמארה סנג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.יום אחד לפני ההזרקה, מקום שמונה עד 12 שבועות, לא שמנים סוכרתית scid גמא, או NSG, עכברים בכלוב עוגה מעקר, ולהקרין את העכברים במקור צסיום-137 עם מנה כוללת של 150 centigrays, עם סיבוב איטי כדי להבטיח הקרנה אפילו. לאחר מכן, מניחים את העכברים בכלובים נקיים בארון ביו-בטיחות סטרילי בן לילה. למחרת בבוקר, לאסוף מספיק דם אנושי בריא כדי לבודד 1.1 פעמים 10 לשבעה תאים mononuclear דם היקפי, או PBMCs, לכל עכבר, ולדלל את הדם heparinized בנפח שווה של 2% נסיוב בקר עוברי, או FBS, ב PBS.בזהירות כיסוי עד 25 מיליליטר של הדם מדולל על 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות הפרדת לימפוציטים בצינור חרוט 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות. בסוף ההפרדה, לקצור את PBMC בממשק, ולשטוף את התאים ב 10 מיליליטר של PBS בצינור חרוט חדש 50 מיליליטר. שאפו את העל-טבעי, והניפו את הצינור כדי לשחרר את גלולת הכדור.תן שימוש חוזר ב-PBMCs ב-10 מיליליטר של PBS טרי לצנטריפוגה נוספת, ולאחר מכן יהיה שימוש חוזר בחמישה מיליליטר של PBS טרי לספירה. לאחר מכן, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה סופית, ו להשתמש שוב את גלולה באחת פעמים 10 לשמונה PBMCs למיליליטר של ריכוז PBS. למסירה רטרו-מסלולית של PBMC האנושי המבודד לתוך עין העכבר, לטעון מזרק אחד מיליליטר מצויד מחט 28-מד עם 100 microliters של תאים.אשר חוסר תגובה לצביטת בוהן, ורסן בעדינות את העכבר באמצעות האגודל והאצבע האמצעית. הכנס את המחט בצד משופע למטה, צדדי לתוך canthus המדיאלי, דרך קרום הלחמית עד החלק האחורי של העין הוא הגיע. מעט לסגת המחט, לאט להזריק את כל נפח התאים.לאחר מכן, לסגת לחלוטין את המחט לסילוק נאות של המזרק והמחט. סגור את העפעף, ולהחיל לחץ קל על אתר ההזרקה עם ספוג גזה. לאחר מכן, בדקו את אתר ההזרקה לנפיחות או לטראומה גלויה אחרת, ואפשרו לעכבר לחזור להכרה בכלוב סטרילי מרופד במגבות נייר וניטור לפני העברת החיה לכלוב הביתי שלה.כדי למדוד את ציון GVHD, מניחים את הכלוב במכסה המנוע של זרימה למינארית, ומסירים את המזון והמים מהכלוב. כדי להבקיע את הפעילות, להתבונן בהתנהגות של העכברים במשך חמש דקות. כדי לקבל ציון הרזיה, לשקול כל עכבר ב זכוכית.בזמן שהעכבר עדיין בגוון, בדוק אם החיה יציבה, מרקם פרווה ושלמות העור. לאחר קצירת הרקמות של עניין, לחתוך כ 3 על 0.5 מילימטר חתיכת רקמה מהאיבר, ולשקול את המדגם על איזון. מעבירים את הרקמה המשוקללת לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר, ומקפיאים את הדגימה בחנקן נוזלי לאחסון לילה במינוס 80 מעלות צלזיוס.למחרת בבוקר, להפשיר את הדגימות לפני תמיסת, על פי ההוראות של ערכת בידוד DNA גנומי. לכימות תאי T אנושיים על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית, או PCR, הכינו תגובות PCR דיגיטליות בהתאם לפרוטוקול לצבעי קשירה לדנ"א עבור מכונת PCR הדיגיטלית המשמשת ושימוש בפרימרים המתאימים לדנ"א גנומי EPSILON של CD3 אנושי. לאחר מכן, לבצע את תגובת PCR דיגיטלית תחת תנאי התגובה המתאימים.Sublethally מוקרן שמונה עד 12 שבועות עכברי NSG משני המינים המקבלים PBMC אנושי להתחיל להציג סימנים קליניים של GVHD סביב היום 10 לאחר הזרקה לעומת עכברי שליטה שלילית שטופלו PBS בלבד. עכברי XenoGVHD יש הישרדות חציונית של 23.5 ימים. באמצעות PCR דיגיטלי, CD3 אפסילון חיובי תאי T אנושיים ניתן לזהות את דגימות הריאה והכבד של עכברים המקבלים מחשבים אנושיים.זה קריטי כי הניקוד מבוצע באופן עקבי, כי החוקר ניקוד העכברים עיוור לטיפול שלהם. בעקבות הליך זה, סרום ניתן לאסוף מעכברים המתת דם לניתוח ביטוי ציטוקינים היקפיים, ותאי החיסון ניתן לאסוף מן הטחול לניתוח באמצעות ציטומטריה זרימה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...