Name: induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

レーン・クリステンソンの研究室では、これらの実験で使用されるデジタルPCRマシンを提供し、提供される技術サポートを提供することを認めしたいと思います。また、トーマス・ヤンキー博士の指導と指導に感謝します。これらの研究は、トリップファミリー財団によって支援されました。

すべてのマウス実験は、カンザス大学医療センター機関動物ケア・使用委員会の承認を得て、コンプライアンスに従って行われました。すべての健康なヒト血液サンプルは、インフォームドコンセントの下で、カンザス大学医療センターの機関審査委員会の承認を得ました。
1. NSGマウスの照射
<ol><li>PBMC注射の1日前に、8〜12週齢のNSGマウスを照射する(どちらの性別も使...

<ol>
	<li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li><li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+3+clinical+trial+of+steroids/mycophenolate+mofetil+vs+steroids/placebo+as+therapy+for+acute+GVHD:+BMT+CTN+0802.">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), 3221-3227 (2014).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation.">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use,+older+recipient+age,+and+use+of+unrelated+donors.">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li><li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era.">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li><li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex.">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li><li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+antimurine+xenogeneic+cytotoxic+response.+I.+Dependence+on+responder+antigen-presenting+cells.">The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice.">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li><li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes,+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease.">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4(+)+or+CD8.">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li><li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism.">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li><li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells.">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals.">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).</li><li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8.">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Sykes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR.">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li><li>Vitale, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+to+evaluate+estrogen+receptor+gene+mutations+in+small+amounts+of+cell-free+DNA.">An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA.</a> Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).</li><li>Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+and+liquid+biopsy:+opportunities,+challenges,+and+recent+advances+in+detection+technologies.">Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies.</a> Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li><li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation:+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review.">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li><li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+human+T+cell+engraftment,+trafficking,+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD/SCID+beta2mnull+mice.">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li><li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein:+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).</li><li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-/-+gammac-/-+double-mutant+mice.">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li><li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues.">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation?.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?.</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li></ol>

疾患の進行は、一般的に異なるドナーからのPBMCの注入であっても、xenoGVHDモデルで一貫しているので、複数の実験を組み合わせることができます。この一貫性を維持するために必要な重要な手順は、適切なi.v.インジェクション技術、ブラインドと一貫性のあるスコアリングです。Nervi et al.25による研究は、静脈内尾静脈注射と比較して、PBMCのレトロ軌道注射がより一貫性の...

同種造血幹細胞移植(HSCT)は、予後不良の白血病などの血液学的悪性腫瘍に苦しむ患者の日常的な治療となっている。HSCTの有意な合併症は急性移植片対宿主病(GVHD)である。2012年の研究では、急性GVHDが兄弟ドナーから移植を受けているHSCT患者の39%と無関係なドナー1からの移植を受けている患者の59%で開発されたと報告されています。急性GVHDは、ドナー由来のT細胞がレシピエントの臓器を攻撃するときに起こる。GVHDの唯一の成功した治療法は、非常に毒性が高く、感染および腫瘍再発のリスクを高める高い免疫抑制薬2による治療である。したがって、近年3、4、5の急性GVHD生存率で行われた改善にもかかわらず、長期寛解を促進する毒性を最小限に抑えたGVHD療法の改善が依然として重要である。
以下の方法の全体的な目標は、異種系GVHD(xenoGVHD)を誘導し、スコア付けすることです。xenoGVHDモデルは、前臨床GVHD研究を臨床試験6に直接翻訳することを可能にするマウス細胞ではなくヒト細胞で急性GVHDを誘導するツールとして開発された。このモデルは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、非致死的に照射されるNOD-SCID IL-2Rγヌル(NSG)マウスに静脈内注入することを含む。注入されたヒトT細胞は、マウス抗原を提示するヒト抗原提示細胞(APC)によって活性化され、活性化されたT細胞は、全身性炎症および最終的に死亡する遠隔組織に移行する6、7、8,9,10.xenoGVHDモデルにおける疾患病理および進行は、ヒト急性GVHDを密接に模倣する。具体的には、病原性ヒトT細胞は、マウス主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質に反応し、ヒトGVHD6、9におけるT細胞アロア活性に類似している。マウスMHCミスマッチモデルに対するxenoGVHDモデルの主な利点は、他の広く使用されているGVHDモデルは、マウス細胞ではなくヒト細胞上の治療法の試験を可能にすることである。これにより、ヒト細胞を標的とするため、変更を加えずに直接クリニックに翻訳できる製品のテストが可能になります。近年、このモデルは、急性GVHDの潜在的な治療法としてヒト抗IL-2抗体11、ヒト胸腺調節T細胞(Tregs)12およびヒト間葉系幹細胞13を試験するために用いられている。より広い文脈において、このモデルは、ヒトT細胞活性を抑制することができる任意の薬物または細胞型に対する生体内抑制アッセイとして使用することができる。例えば、Stockis et al.14はxenoGVHDモデルを用いて、生体内のトレグ抑制活性に対するインテグリンαVβ8のブロッキング効果を研究した。したがって、xenoGVHDモデルは、インビボ設定でT細胞を標的とする任意の治療のメカニズムに関する洞察を提供することができる。
このプロトコルに記載されている追加の方法は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)を用いてマウス組織中のヒトT細胞を検出する方法である。この方法の目的は、このモデルで試験されている免疫抑制療法の有効性を測定する標的組織におけるT細胞の移動および増殖を定量化するツールを提供することである。dPCRは、核酸15の定量のための比較的新しい方法である。簡単に言えば、PCR反応混合物は、ターゲット配列の少数を含むパーティションに分割されるか、またはターゲットがまったく含まれていません。次に、標的配列を増幅し、DNAインターカシング染料または蛍光標的特異的プローブを用いて検出します。dPCR は、正のパーティションとポアソンの統計15,16の割合に基づいて、ターゲット シーケンスのコピー数を定量化します。dPCRを用いてT細胞を検出することは、フローサイトメトリーおよび組織学を含む他の代替方法と比較してはるかに少ない組織を必要とし、凍結または固定組織上で行うことができる。dPCR は、コピー番号を決定するための標準曲線を必要とせず、技術的な反復も必要ありません。これにより、従来の定量的PCR(qPCR)16と比較して、dPCRに必要な試薬およびテンプレートDNAの量が減少します。pcR反応をdPCRのサブ反応に分割すると、ターゲット17が効果的に濃縮されます。したがって、dPCRは、主に大量の非標的DNA中の希少標的を検出するためのツールである。例えば、dPCRは、牛乳18における細菌汚染を検出し、エストロゲン受容体遺伝子19のまれな変異を同定し、患者20の血液中の循環腫瘍DNAを検出するために使用されている。このプロトコルでは、dPCRはxenoGVHDを有するマウスの組織におけるヒトT細胞を検出および定量するための効率的なツールとして機能する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;L Ranin pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17001118</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well ddPCR plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EZ-178</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>PM1002</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>1811318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45001750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Irradiator Pie Cage</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>MPC 1</td>
			<td>Holds up to 11 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4&#34;)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetaid Gilson Macroman</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F110756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013805</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase and DNase-free plate seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12565491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Advanced 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Pads (2&#34; x 2&#34;, 12-Ply)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reservoir</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgial Scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600393-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650914-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr

急性移植片対宿主病(GVHD)は、血液学的欠乏および悪性腫瘍の治療として造血幹細胞移植を受けている患者にとって重要な制限である。急性GVHDは、ドナーT細胞が宿主組織を外来抗原として認識し、宿主に免疫応答をマウントするときに起こる。現在の治療には、患者が感染や再発を受けやすくする有毒な免疫抑制薬が含まれます。したがって、ドナーT細胞を効果的に標的にし、副作用を減らすことができる急性GVHD療法を提供するための継続的な研究があります。この前臨床研究の多くは、生体内系のマウス細胞ではなくヒト細胞に対する免疫抑制療法の試験を可能にする異種生成GVHD(xenoGVHD)マウスモデルを使用しています。このプロトコルは、xenoGVHDを誘導する方法と、一貫した結果を確実にするために臨床スコアリングを盲目にし、標準化する方法を概説します。さらに、このプロトコルは、デジタルPCRを使用してマウス組織内のヒトT細胞を検出する方法について説明し、その後、試験された治療の有効性を定量化するために使用することができる。xenoGVHDモデルは、GVHD療法をテストするモデルを提供するだけでなく、ヒトT細胞を抑制できる任意の治療法を提供し、多くの炎症性疾患に適用することができる。

ヒトPBMCを受けた両男女の8〜12週齢のNSGマウスを、PBSのみを受け取った陰性対照マウスと比較して10日目のポスト注射の臨床徴候を示し始めた(図1A)。XenoGVHDマウスは23.5日の中央値生存期間を有した(図1B)。デジタルPCRを用いて、CD3イプシロン陽性ヒトT細胞は、ヒトPBMCを受けたマウスの肺および肝臓サンプルで検出することが...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

デジタルPCRを用いたマウス組織における異種マウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導とスコア付け

ここでは、異種系移植片対宿主病(xenoGVHD)モデルにおける疾患を誘導し、スコア付けするプロトコルを提示する。xenoGVHDは、ヒトT細胞の免疫抑制を研究するためのインビボモデルを提供する。さらに、免疫抑制を定量化するツールとしてデジタルPCRを用いて組織内のヒトT細胞を検出する方法について述べた。

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

このプロトコルは、異種移植片対宿主病(xenoGVHD)を誘発する方法と、一貫した結果を確保するために臨床スコアリングを盲目および標準化する方法を概説する。xenoGVHDモデルは、マウスT細胞ではなくヒトに対する免疫抑制療法を試験するためのin vivo方法を提供し、これらの研究のクリニックへの翻訳を改善する。この手順を実証することは、私の研究室の大学院生であるアマラ・センです。注射の前日、8〜12週齢の非肥満糖尿病性サイドガンマ、またはNSGを殺菌されたパイケージに入れたマウスを置き、セシウム137源のマウスを150センチグレイの総用量で照射し、ゆっくりと回転して均一な照射を確実にする。その後、無菌バイオセーフティキャビネットの中の清潔なケージにマウスを一晩置きます。翌朝、7つの末梢血単核細胞(PBMC)に1.1倍の10を単離するのに十分な健康なヒト血液を採取し、PBSでヘパリン化された血液を同量の2%ウシウシ血清(FBS)で希釈する。慎重に50ミリリットルの円錐形チューブでリンパ球分離密度勾配媒体の15ミリリットルに希釈された血液の25ミリリットルまで重ね、密度勾配遠心分離を行います。分離の終わりに、界面でPBMCを収穫し、新しい50ミリリットル円錐形チューブでPBSの10ミリリットルで細胞を洗浄する。上清を吸引し、チューブをフリックしてペレットを緩めます。別の遠心分離のために新鮮なPBSの10ミリリットルでPBMCsを再懸濁し、続いてカウントのための新鮮なPBSの5ミリリットルで再懸濁を行う。次いで、最終遠心分離で細胞を回収し、PBS濃度の1ミリリットル当たり8 PBMCsに10回10回でペレットを再懸濁する。マウスの目に孤立したヒトPBMCのレトロ軌道配信のために、100マイクロリットルの細胞を備えた28ゲージの針を装備した1ミリリットルの注射器を1つロードする。つまみつまみへの反応の欠如を確認し、親指と中指でマウスを静かに拘束します。針ベベル側を下に、内側カンサスに内側に挿入し、眼の後部に達するまで結膜を通る。わずかに針を引っ込め、ゆっくりと細胞の全容を注入する。その後、注射器と針の適切な処分のために針を完全に引き込みます。まぶたを閉じ、ガーゼスポンジで注射部位に軽い圧力をかける。次に、腫脹または他の目に見える外傷の注射部位を調べ、動物を自宅のケージに移動する前に、ペーパータオルと監視が並ぶ無菌ケージでマウスが意識を取り戻すことを可能にする。GVHDスコアを測定するには、ケージを層流フードに入れ、ケージから食べ物と水を取り除きます。活性をスコア付けするには、マウスの挙動を5分間観察する。減量スコアを得るために、ガラスビーカーで各マウスの重量を量る。マウスがビーカーに残っている間、動物の姿勢、毛皮の質感、肌の完全性を検査します。目的の組織を収穫した後、臓器から約3〜0.5ミリメートルの組織を切断し、バランスでサンプルを計量します。重み付けされた組織を無菌1.5ミリリットルチューブに移し、サンプルを液体窒素でスナップフリーズさせ、マイナス80°Cで一晩保存します。翌朝、ゲノムDNA分離キットからの指示に従って、リシス前にサンプルを解凍する。デジタルポリメラーゼ連鎖反応またはPCRによるヒトT細胞定量のために、使用されているデジタルPCRマシン用のDNA結合色素のプロトコルに従ってデジタルPCR反応を調製し、ヒトCD3 εゲノムDNAに適切なプライマーを使用します。次に、適切な反応条件下でデジタルPCR反応を行う。ヒトPBMCを受ける男女の8〜12週齢のNSGマウスを致死的に照射し、PBSのみで治療された陰性対照マウスと比較して、注射後10日目頃にGVHDの臨床徴候を示し始める。XenoGVHDマウスは、23.5日の生存期間の中央値を有する。デジタルPCRを用いて、ヒトPBMCを受けるマウスの肺および肝臓サンプルでCD3イプシロン陽性ヒトT細胞を検出することができる。スコアリングが一貫して行われ、マウスを採点する研究者が治療に目をつぶることが重要です。この手順に従って、末梢サイトカイン発現解析のために安楽死マウスから血清を採取することができ、免疫細胞はフローサイトメトリーを介して分析するために脾臓から収集することができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

マウスおよび種々の組織における免疫細胞の疾患に依存する分布の評価における実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...