Name: induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

우리는 이러한 실험에 사용되는 디지털 PCR 기계를 제공하고 제공되는 기술 지원을 위해 Lane Christenson의 실험실을 인정하고 싶습니다. 또한 토마스 양키 박사님의 지도와 멘토링에 감사드립니다. 이러한 연구는 트립 가족 재단에 의해 지원되었다.

모든 마우스 실험은 캔자스 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 거쳐 준수하고 승인을 받아 수행되었습니다. 모든 건강한 인간 혈액 샘플은 캔자스 대학 의료 센터의 기관 검토 위원회의 승인을 받고 정보에 입각한 동의하에 얻어졌습니다.
1. NSG 마우스의 조사
<ol><li>PBMC 주입 하루 전에, 조사 8-12 주 오래 된 NSG 마우스 (어느 섹스 사용할 수 있습니다). 멸?...

<ol>
	<li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li><li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+3+clinical+trial+of+steroids/mycophenolate+mofetil+vs+steroids/placebo+as+therapy+for+acute+GVHD:+BMT+CTN+0802.">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), 3221-3227 (2014).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation.">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use,+older+recipient+age,+and+use+of+unrelated+donors.">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li><li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era.">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li><li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex.">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li><li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. 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Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice.">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li><li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes,+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease.">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4(+)+or+CD8.">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li><li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism.">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li><li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells.">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals.">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).</li><li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8.">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR.">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li><li>Vitale, S. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li><li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation:+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review.">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li><li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+human+T+cell+engraftment,+trafficking,+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD/SCID+beta2mnull+mice.">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li><li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein:+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).</li><li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-/-+gammac-/-+double-mutant+mice.">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li><li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues.">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation?.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?.</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li></ol>

질병 진행은 일반적으로 xenoGVHD 모델에서 일관적이며, 다른 공여자로부터 PBMC를 주사하더라도, 그래서 여러 실험을 결합할 수 있다. 이러한 일관성을 유지하는 데 필요한 주요 단계는 적절한 즉 주입 기술, 눈가리개 및 일관된 점수입니다. Nervi 등25에 의한 연구는 정맥 꼬리 정맥 주사에 비해, PBMC의 복고풍 궤도 주사가 더 일관된 생착과 더 심한 GVHD 귀착되었다는 것을 보여주었습...

동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 가난한 예후를 가진 백혈병과 같은 혈액학적 악성 종양으로 고통받는 환자를 위한 일상적인 처리가 되었습니다. HSCT의 중요한 합병증은 급성 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)입니다. 2012년의 한 연구에서는 급성 GVHD가 형제 기증자로부터 이식을 받는 HSCT 환자의 39%와 관련없는기증자로부터 이식을 받는 환자의 59%에서 개발되었다고 보고했습니다 1. 급성 GVHD는 기증자 유래 T 세포가 수령인의 장기를 공격할 때 발생합니다. GVHD에 대한 유일한 성공적인 치료법은 매우 독성이 높고 감염 및 종양 재발의 위험을 증가시키는 고면역 억제 제2로 치료하는 것입니다. 따라서, 최근 몇 년 동안 급성 GVHD 생존에서 이루어진 개선에도 불구하고 3,4,5,장기 완화를 촉진하는 최소한의 독성으로 개선된 GVHD 요법에 대한 중요한 필요성이 여전히 존재한다.
다음 방법의 전반적인 목표는 xenogeneic GVHD (xenoGVHD)를 유도하고 점수를 매기는 것입니다. xenoGVHD 모델은 임상 시험 6에 전임상 GVHD 연구를 보다 직접적으로 번역할 수 있도록 뮤린 세포가아닌 인간 세포로 급성 GVHD를 유도하는 도구로 개발되었다. 이 모형은 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 SUBlethally 조사되는 NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) 마우스로 주입하는 것을 관련시킵니다. 주입된 인간 T 세포는 인간 항원 제시 세포(APC)에 의해 활성화되어 뮤린 항원과 활성화된 T세포가 전신 염증을 초래하고 궁극적으로 사망하는 먼 조직으로 이동한다 6,7, 8개 , 9개 , 10. xenoGVHD 모델의 질병 병리학 및 진행은 인간의 급성 GVHD를 밀접하게 모방합니다. 구체적으로, 병원성 인간 T 세포는 인간 GVHD6,9에서T 세포 동모활성과 유사한 뮤린 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질에 반응한다. 마우스 MHC 불일치 모델, 다른 널리 사용되는 GVHD 모델에 비해 xenoGVHD 모델의 주요 장점은, 뮤린 세포보다는 인간 세포에 대한 치료법의 테스트를 허용한다. 이것은 인간 세포를 표적으로 하기 위하여 만들어지기 때문에 어떤 수정도 없이 진료소에 직접 번역될 수 있는 제품의 시험을 허용합니다. 최근, 이 모델은 급성 GVHD에 대한 잠재적 치료제로서 인간 항-IL-2항체(11),인간 흉선 조절 T 세포(Tregs)12 및 인간 중간엽 줄기세포(13)를 시험하는데 사용되고 있다. 더 넓은 맥락에서, 이 모델은 인간 T 세포 활성을 억제할 수 있는 임의의 약물 또는 세포 유형에 대한 생체내 억제 분석법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Stockis et al.14는 xenoGVHD 모델을 사용하여 생체 내 트레그 억제 활성에 대한 인테그린 αVβ8 차단 효과를 연구하였다. 따라서, xenoGVHD 모델은 생체 내 설정에서 T 세포를 표적화하는 임의의 치료의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
이 프로토콜에 기재된 추가방법은 디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR)을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포를 검출하는 방법이다. 이 방법의 목표는 표적 조직에서 T 세포의 이동 및 증식을 정량화하는 도구를 제공하는 것이며, 이는 이 모델에서 시험되는 면역 억제 요법의 효능을 측정하는 것입니다. dPCR은 핵산(15)의 정량화를위한 비교적 새로운 방법이다. 간단히, PCR 반응 혼합물은 타겟 서열의 작은 숫자를 포함하는 파티션으로 분할또는 전혀 타겟이 없다. 표적 서열은 DNA 인터컬레이터 염료 또는 형광 표적 특이적 프로브를 사용하여 증폭및 검출된다. dPCR은 양극분할및 푸아송통계의 분수에 기초하여 대상 시퀀스의 사본 수를 정량화한다15,16. dPCR로 T 세포를 검출하는 것은 유세포 분석 및 조직학을 포함하여 다른 대체 방법에 비해 훨씬 적은 조직을 필요로 하며, 동결 또는 고정 된 조직에서 수행 될 수있다. dPCR은 복사 번호를 결정하기 위해 표준 곡선이 필요하지 않으며 기술 복제가 필요하지 않습니다. 이는 기존의 정량적 PCR(qPCR)16에비해 dPCR에 필요한 시약 및 템플릿 DNA의 양을 감소시킨다. PCR 반응을 dPCR에서 하위 반응으로 분할하는 것은 효과적으로 타겟17을집중시다. 따라서, dPCR은 주로 다량의 비표적 DNA에서 희귀 표적을 검출하기 위한 도구이다. 예를 들어, dPCR은우유(18)에서세균 오염을 검출하고, 에스트로겐 수용체 유전자(19)에서 드문 돌연변이를 식별하고, 환자의 혈액에서 순환 종양 DNA를 검출하는 데 사용된다(20). 이 프로토콜에서, dPCR은 xenoGVHD를 가진 마우스의 조직에서 인간 T 세포를 검출하고 정량화하기 위한 효율적인 도구역할을 한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;L Ranin pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17001118</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well ddPCR plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EZ-178</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>PM1002</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>1811318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45001750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Irradiator Pie Cage</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>MPC 1</td>
			<td>Holds up to 11 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4&#34;)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetaid Gilson Macroman</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F110756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013805</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase and DNase-free plate seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12565491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Advanced 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Pads (2&#34; x 2&#34;, 12-Ply)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reservoir</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgial Scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600393-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650914-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr

급성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)은 혈액학적 결핍 및 악성 종양에 대한 치료로서 조혈 줄기 세포 이식을 받는 환자에게 상당한 제한이다. 급성 GVHD는 공여자 T 세포가 외국 항원으로 숙주 조직을 인식하고 숙주에게 면역 반응을 장착할 때 발생한다. 현재 처리는 감염과 재발에 영향을 받기 쉬운 환자를 렌더링하는 유독한 면역 억제 약을 관련시킵니다. 따라서, 기증자 T 세포를 효과적으로 표적으로 하고 부작용을 감소시킬 수 있는 급성 GVHD 치료를 제공하기 위한 연구가 진행 중이다. 이 전 임상 작업의 대부분은 생체 내 시스템에서 뮤린 세포보다는 인간 세포에 면역 억제 요법의 테스트를 허용 하는 xenogenic GVHD (xenoGVHD) 뮤린 모델을 사용 합니다. 이 프로토콜은 xenoGVHD를 유도하는 방법과 일관된 결과를 보장하기 위해 임상 점수를 장님과 표준화하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 이 프로토콜은 마우스 조직에 있는 인간 적인 T 세포를 검출하기 위하여 디지털 PCR를 사용하는 방법을 기술합니다, 이후에 시험된 치료의 효험을 정량화하기 위하여 이용될 수 있는. xenoGVHD 모델은 GVHD 요법을 테스트하는 모델뿐만 아니라 인간 T 세포를 억제 할 수있는 모든 치료법을 제공하며, 이는 많은 염증성 질환에 적용 될 수 있습니다.

인간 PBMC를 받은 남녀 모두의 8-12주 령 NSG 마우스를 치명적으로 조사한 결과, PBS만을 받은 음성 대조군 마우스에비해 10일 전후의 GVHD의 임상 적 징후를 보이기 시작했다(도 1A). XenoGVHD 마우스는 23.5 일의중간 생존을 가졌다 (도 1B). 디지털 PCR을 사용하면, CD3 엡실론 양성 인간 T 세포는 인간 PBMC를 수신한 마우스의 폐 및 간 샘플에?...

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Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

여기서, 우리는 xenogeneic 이식편 대 숙주 질환(xenoGVHD) 모델에서 질병을 유도하고 점수를 매기는 프로토콜을 제시한다. xenoGVHD는 인간 T 세포의 면역 억제를 연구하는 생체 내 모델을 제공한다. 추가적으로, 우리는 면역 억제를 정량화하는 공구로 디지털 PCR를 가진 조직에서 인간 적인 T 세포를 검출하는 방법을 기술합니다.

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

이 프로토콜은 xenograft 대 숙주 질병, 또는 xenoGVHD를 유도하는 방법과 일관된 결과를 보장하기 위해 임상 점수를 장님및 표준화하는 방법을 설명합니다. xenoGVHD 모델은 뮤린 T 세포가 아닌 인간에 대한 면역 억제 요법을 테스트하여 이러한 연구의 번역을 클리닉으로 개선하는 생체 내 방법을 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 아마라 셍 (Amara Seng)이 될 것입니다.주사 하루 전에, 8-12 주 된, 비 비만 당뇨병 성 공상 장마, 또는 NSG, 살균 된 파이 케이지에 마우스를 배치하고, 150 센티미터의 총 용량으로 세슘-137 소스에서 마우스를 조사, 심지어 조사를 보장하기 위해 느린 회전. 그런 다음 생쥐를 멸균 생물 안전 캐비닛에 밤새 깨끗한 케이지에 넣습니다. 다음 날 아침, 마우스당 7개의 말초 혈액 단핵세포 또는 PBMC에 1.1배 10배 를 분리하고, PBS에서 2%의 태아 소 혈청 또는 FBS의 동등한 부피로 고분리된 혈액을 희석시키기 위하여 충분한 건강한 인간 혈액을 수집합니다.밀도 그라데이션 원심분리를 위한 50밀리리터 원내 튜브에서 15밀리리터의 림프구 분리 밀도 그라데이션 배지에 희석된 혈액의 최대 25밀리리터를 조심스럽게 오버레이합니다. 분리의 끝에서, 인터페이스에서 PBMC를 수확하고, 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브에서 PBS의 10 밀리리터에서 세포를 세척. 수퍼내티를 흡인하고 튜브를 쓸어 당겨 펠릿을 풀어냅니다.또 다른 원심분리를 위해 신선한 PBS의 10 밀리리터에서 PBMC를 다시 중단하고, 계산을 위한 신선한 PBS의 5밀리리터에 재서스펜션이 뒤따랐습니다. 이어서, 최종 원심분리를 가진 세포를 수집하고, PBS 농도의 밀리리터당 8개의 PBMC에 10회 10회에서 펠릿을 재연한다. 격리된 인간 PBMC를 마우스 눈으로 레트로 궤도 전달하기 위해 100마이크로리터의 셀이 장착된 28게이지 바늘을 장착한 1밀리리터 주사기를 적재한다.발가락 핀치에 대한 응답의 부족을 확인하고 엄지 손가락과 가운데 손가락으로 마우스를 부드럽게 억제합니다. 바늘 배꼽 측을 아래로 삽입하고, 측면 캔투스에, 눈의 뒤쪽에 도달할 때까지 결막막을 통해 삽입한다. 바늘을 약간 후퇴시키고 세포의 전체 부피를 천천히 주입하십시오.그런 다음 주사기와 바늘을 적절히 처리하기 위해 바늘을 완전히 철회합니다. 눈꺼풀을 닫고 거즈 스폰지로 주사 부위에 가벼운 압력을 가하십시오. 그런 다음, 붓기 또는 다른 눈에 보이는 외상에 대한 주입 부위를 검사하고, 마우스가 집 케이지로 동물을 이동하기 전에 종이 타월과 모니터링줄이 있는 멸균 케이지에서 의식을 되찾을 수 있도록 합니다.GVHD 점수를 측정하려면 케이지를 라미나르 플로우 후드에 넣고 케이지에서 음식과 물을 제거합니다. 활성을 점수하려면 마우스의 동작을 5분 동안 관찰한다. 체중 감량 점수를 얻으려면 유리 비커에 각 마우스의 무게를 측정합니다.마우스가 여전히 비커에 있는 동안, 자세, 모피 질감 및 피부 무결성에 대 한 동물을 검사. 관심있는 조직을 수확 한 후, 기관에서 조직의 약 3 ~ 0.5 밀리미터 조각을 잘라, 균형에 샘플을 무게. 가중 조직을 멸균 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고, 영하 80도에서 밤새 보관하기 위해 액체 질소로 샘플을 스냅 동결한다.다음 아침, 유전체 DNA 격리 키트의 지침에 따라 용해 전에 샘플을 해동하십시오. 디지털 폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR에 의한 인간 T 세포 정량화를 위해, 사용되고 있는 디지털 PCR 기계에 대한 DNA 결합 염료에 대한 프로토콜에 따라 디지털 PCR 반응을 준비하고 인간 CD3 엡실론 게놈 DNA에 적합한 프라이머를 사용한다. 이어서, 적절한 반응 조건하에서 디지털 PCR 반응을 수행한다.인간 PBMC를 수신하는 두 남녀의 8-12주 된 NSG 마우스를 초심하게 조사하여 PBS로만 치료된 부정적인 대조군 마우스에 비해 10일 전후 GVHD의 임상 징후를 표시하기 시작한다. 제노GVHD 마우스는 23.5일의 중간 생존을 가지고 있다. 디지털 PCR을 사용하여, CD3 epsilon 양성 인간 T 세포는 인간 PBMC를 수신하는 마우스의 폐 및 간 견본에서 검출될 수 있습니다.점수가 일관되게 수행되고 마우스를 채점하는 연구원이 치료에 눈이 멀어지는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 혈청은 말초 사이토카인 발현 분석을 위해 안락사 마우스로부터 수집될 수 있으며, 면역 세포는 유동 세포분석을 통해 분석을 위해 비장으로부터 수집될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

장 이식-비교-호스트 질병 및 라이브 쥐에서 미니 내 시경 평가의 유도

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정량화

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...