Name: induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

Vi ønsker å anerkjenne laboratoriet til Lane Christenson for å gi den digitale PCR maskinen som brukes i disse eksperimentene og for den tekniske støtten som tilbys. Vi vil også gjerne takke Dr. Thomas Yankee for hans veiledning og mentorer. Disse studiene ble støttet av Tripp Family Foundation.

Alle musen eksperimenter ble utført i samsvar, og med godkjenning fra, University of Kansas Medical Center institusjonelle Animal Care og use Committee. Alle friske menneskelige blodprøver ble innhentet under informert samtykke og med godkjennelse fra den institusjonelle Review Board ved University of Kansas Medical Center.
1. bestråling av NSG Mouse
<ol><li>En dag før injeksjon med PBMC irradiate 8 – 12 uker gamle NSG-mus (begge kjønn kan brukes). I et sterilt biosafety kabinett, pla...

<ol>
	<li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li><li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+3+clinical+trial+of+steroids/mycophenolate+mofetil+vs+steroids/placebo+as+therapy+for+acute+GVHD:+BMT+CTN+0802.">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), 3221-3227 (2014).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation.">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use,+older+recipient+age,+and+use+of+unrelated+donors.">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li><li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era.">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li><li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex.">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li><li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+antimurine+xenogeneic+cytotoxic+response.+I.+Dependence+on+responder+antigen-presenting+cells.">The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice.">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li><li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes,+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease.">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4(+)+or+CD8.">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li><li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism.">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li><li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells.">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals.">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).</li><li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8.">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Sykes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR.">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li><li>Vitale, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+to+evaluate+estrogen+receptor+gene+mutations+in+small+amounts+of+cell-free+DNA.">An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA.</a> Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).</li><li>Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+and+liquid+biopsy:+opportunities,+challenges,+and+recent+advances+in+detection+technologies.">Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies.</a> Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li><li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation:+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review.">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li><li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+human+T+cell+engraftment,+trafficking,+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD/SCID+beta2mnull+mice.">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li><li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein:+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).</li><li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-/-+gammac-/-+double-mutant+mice.">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li><li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues.">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation?.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?.</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li></ol>

Sykdomsprogresjon er generelt konsistent i xenoGVHD-modellen, selv med injeksjon av PBMC fra ulike donorer, slik at flere eksperimenter kan kombineres. De viktigste trinnene som kreves for å opprettholde denne konsistensen er riktig IV injeksjon teknikk, blendende og konsistent scoring. En studie av Nervi et al.25 viste at sammenlignet med intravenøs hale vene injeksjon, retro-orbital INJEKSJONER av PBMC resulterte i mer konsistent engraftment og mer alvorlig GVHD. Leon-Rico et al.<sup class="xr...

Allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (HSCT) har blitt rutinemessig behandling for pasienter som lider av hematologiske ondartet som leukemi med dårlig prognose. En betydelig komplikasjon av HSCT er akutt pode-versus-host sykdom (GVHD). En 2012 studie rapporterte at akutt GVHD utviklet i 39% av HSCT pasienter som fikk transplantasjon fra søsken givere og 59% av pasientene som fikk transplantasjon fra urelaterte donorer1. Akutt GVHD oppstår når donor-avledet T-celler angriper mottakerens organer. Den eneste vellykkede terapi for GVHD er behandling med svært immunsuppressiv narkotika2, som er svært giftig og øke risikoen for infeksjon og tumor tilbakefall. Således, til tross for forbedringer som er gjort i akutt GVHD overlevelse de siste årene3,4,5, er det fortsatt et kritisk behov for økt GVHD behandling med minimal toksisitet som fremmer langsiktig remisjon.
Det overordnede målet med følgende metoder er å indusere og score xenogeneic GVHD (xenoGVHD). Den xenoGVHD modellen ble utviklet som et verktøy for å indusere akutt GVHD med menneskelige celler i stedet for murine celler som tillater mer direkte oversettelse av pre-klinisk GVHD forskning til kliniske studier6. Denne modellen innebærer intravenøs injeksjon av humant perifere blod mononukleære celler (PBMC) i NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) mus som er subletalt bestrålt. Injisert menneskelige T-celler aktiveres av humant antigen presentere celler (APCs) presenterer murine antigen og aktiverte T celler migrere til fjerne vev som resulterer i systemisk betennelse og til slutt død6,7, 8 på alle , 9 andre priser , 10. sykdom patologi og progresjon i xenoGVHD modellen tett etterligne menneskelige akutt GVHD. Spesielt er de patogene menneskelige T-celler reaktive til murine Major histocompatibility Complex (MHC) proteiner, som ligner på T-cellen alloreactivity i Human GVHD6,9. Den primære fordelen med xenoGVHD modellen over musen MHC-konflikt modell, den andre mye brukt GVHD modell, er det gir mulighet for testing av terapier på menneskelige celler i stedet for murine celler. Dette gjør det mulig for testing av produkter som direkte kan oversettes til klinikken uten noen modifikasjoner fordi de er laget for å målrette menneskelige celler. Nylig har denne modellen blitt brukt til å teste et menneske anti-IL-2 antistoff11, Human Tymusatrofi regulatoriske T-celler (Tregs)12 og menneskelige Mesenchymal stamceller13 som potensielle behandlinger for akutt GVHD. I en større sammenheng kan denne modellen brukes som en in vivo undertrykkelse analysen for ethvert legemiddel eller celle type som kan undertrykke menneskelig T celle aktivitet. For eksempel brukte stockis et al.14 xenoGVHD modellen til å studere effekten av blokkering integrin ΑVβ8 på treg undertrykkende aktivitet in vivo. Dermed kan xenoGVHD modellen gi innsikt i mekanismen for enhver terapi målretting T-celler i en in vivo innstilling.
En ekstra metode som er beskrevet i denne protokollen er hvordan man skal oppdage menneskelige T-celler i mus vev ved hjelp av digitale polymerase kjedere reaksjon (dPCR). Målet med denne metoden er å tilby et verktøy for å kvantifisere migrasjon og spredning av T-celler i målet vev, som måler effekten av immunsuppressiv terapier testes i denne modellen. dPCR er en relativt ny metode for kvantifisering av nukleinsyre syrer15. Kort sagt er PCR reaksjonsblandingen delt inn i partisjoner som inneholder små antall mål sekvensen eller ikke noe mål i det hele tatt. Mål sekvensen forsterkes og oppdages ved hjelp av DNA-interkalering fargestoffer eller fluorescerende mål spesifikke sonder. dPCR kvantifiserer antall eksemplarer av mål sekvensen basert på brøkdel av positive partisjoner og Poisson ' s statistikk15,16. Oppdage T-celler med dPCR krever mye mindre vev sammenlignet med andre alternative metoder, inkludert Flow flowcytometri og histologi, og kan utføres på frossen eller fast vev. dPCR krever ikke en standard kurve for å finne kopi numre, og det er heller ikke tekniske replikerer som kreves. Dette reduserer mengden av reagens og mal DNA som trengs for dPCR sammenlignet med tradisjonell kvantitativ PCR (qPCR)16. Partisjonering av PCR-reaksjonen i sub-reaksjoner i dPCR konsentrerer effektivt mål17. Således er dPCR primært et verktøy for påvisning av sjeldne mål i en stor mengde ikke-Target DNA. For eksempel, dPCR brukes til å oppdage bakteriell forurensning i melk18, identifisere sjeldne mutasjoner i østrogen reseptoren genet19, og oppdage sirkulerende tumor DNA i blodet av pasienter20. I denne protokollen, dPCR fungerer som et effektivt verktøy for å oppdage og kvantifisere menneskelige T-celler i vev av mus med xenoGVHD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;L Ranin pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17001118</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well ddPCR plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EZ-178</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>PM1002</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>1811318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45001750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Irradiator Pie Cage</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>MPC 1</td>
			<td>Holds up to 11 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4&#34;)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetaid Gilson Macroman</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F110756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013805</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase and DNase-free plate seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12565491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Advanced 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Pads (2&#34; x 2&#34;, 12-Ply)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reservoir</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgial Scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600393-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650914-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr

Akutt pode-versus-host sykdom (GVHD) er en betydelig begrensning for pasienter som får blodkreft stilk cellen transplantasjon som terapi for hematologiske mangler og ondartet. Akutt GVHD oppstår når donor T celler anerkjenner vert vev som et utenlandsk antigen og montere en immunrespons til verten. Nåværende behandlinger involverer giftige immunsuppressiv medikamenter som gjør pasienter utsatt for infeksjon og gjentakelse. Dermed er det pågående forskning for å gi en akutt GVHD terapi som effektivt kan målrette donor T celler og redusere bivirkninger. Mye av dette pre-klinisk arbeid bruker xenogenic GVHD (xenoGVHD) murine modell som gjør det mulig for testing av immunsuppressiv behandling på menneskelige celler i stedet for murine celler i en in vivo system. Denne protokollen skisserer hvordan å indusere xenoGVHD og hvordan å blinde og standardisere klinisk scoring for å sikre konsistente resultater. I tillegg beskriver denne protokollen hvordan du bruker digital PCR til å oppdage menneskelige T-celler i mus vev, som senere kan brukes til å kvantifisere effekten av testede terapier. Den xenoGVHD modellen gir ikke bare en modell for å teste GVHD terapier, men noen terapi som kan undertrykke menneskelige T-celler, som deretter kan brukes på mange inflammatoriske sykdommer.

Subletalt bestrålt 8-12-uke gamle NSG mus av begge kjønn som fikk menneskelige PBMC begynte å vise kliniske tegn på GVHD rundt dag 10 etter injeksjon sammenlignet med negative kontroll mus som fikk PBS bare (figur 1a). XenoGVHD-mus hadde en median overlevelse på 23,5 dager (figur 1B). Med digital PCR, CD3 Epsilon positive menneskelige T-celler kan påvises i lungene og leveren prøver av mus som fikk menneskelige PBMC. Vevsp...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induksjon og scoring av pode-versus-host sykdom i en Xenogeneic murine modell og kvantifisering av menneskelige T celler i mus vev ved hjelp av digital PCR

Her presenterer vi en protokoll for å indusere og score sykdom i en xenogeneic pode-versus-host sykdom (xenoGVHD) modell. xenoGVHD gir en in vivo-modell for å studere immunsuppresjon av menneskelige T-celler. I tillegg beskriver vi hvordan du kan oppdage menneskelige T-celler i vev med digital PCR som et verktøy for å kvantifisere immunsuppresjon.

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Denne protokollen beskriver hvordan man induserer xenograft-versus-host sykdom, eller xenoGVHD, og hvordan du blinder og standardiserer klinisk scoring for å sikre konsistente resultater. XenoGVHD-modellen gir en in vivo-metode for testing av immunsuppressive behandlinger mot mennesker i stedet for murine T-celler, noe som forbedrer oversettelsen av disse studiene til klinikken. Å demonstrere prosedyren vil være Amara Seng, en utdannet student fra laboratoriet mitt.En dag før injeksjonen, plasser åtte til 12 uker gammel, ikke-overvektig diabetisk scid gamma, eller NSG, mus i et sterilisert paibur, og bestråle musene i en cesium-137 kilde med en total dose på 150 centigrays, med en langsom rotasjon for å sikre en jevn bestråling. Deretter plasserer musene i rene bur i et sterilt biosikkerhetsskap over natten. Neste morgen, samle nok sunt menneskelig blod til å isolere 1,1 ganger 10 til de syv perifere blod mononukleære celler, eller PBMCs, per mus, og fortynne heparinisert blod i et likt volum på 2% fosterbovin serum, eller FBS, i PBS.Legg forsiktig over opptil 25 milliliter av fortynnet blod på 15 milliliter lymfocytt separasjonstetthetsmedium i et 50-milliliter konisk rør for tetthets sentrifugasjon. På slutten av separasjonen høster du PBMC ved grensesnittet, og vask cellene i 10 milliliter PBS i et nytt konisk rør på 50 milliliter. Aspirer overnatanten, og knips røret for å løsne pelleten.Gjenoppusser PBMCene i 10 milliliter frisk PBS for en annen sentrifugering, etterfulgt av resuspensjon i fem milliliter med ferske PBS for telling. Deretter samler cellene med en endelig sentrifugasjon, og gjenbruker pelleten til en gang 10 til de åtte PBMCene per milliliter PBS-konsentrasjon. For retro-orbital levering av den isolerte menneskelige PBMC inn i museøyet, last en en-milliliter sprøyte utstyrt med en 28-gauge nål med 100 mikroliter celler.Bekreft mangel på respons på tåklemmen, og hold forsiktig musen med tommelen og langfingeren. Sett nålekantsiden ned, lateral inn i mediale canthus, gjennom konjunktivalmembranen til baksiden av øyet er nådd. Trekk lett tilbake nålen, og injiser sakte hele volumet av celler.Deretter trekker du kanylen helt tilbake for riktig avhending av sprøyten og nålen. Lukk øyelokket, og påfør mildt trykk på injeksjonsstedet med en gasbindsvamp. Deretter undersøker du injeksjonsstedet for hevelse eller andre synlige traumer, og la musen gjenvinne bevisstheten i et sterilt bur foret med papirhåndklær og overvåking før du flytter dyret til sitt hjembur.For å måle GVHD-poengsummen plasserer du buret i en laminær strømningshette og fjerner mat og vann fra buret. For å score aktiviteten, observere musenes oppførsel i fem minutter. For å oppnå en vekttap score, veie hver mus i et glassbeger.Mens musen fortsatt er i begeret, inspiser dyret for holdning, pelstekstur og hudintegritet. Etter høsting av vev av interesse, kutt et omtrent tre ganger 0,5 millimeter stykke vev fra orgelet, og veie prøven på en balanse. Overfør det vektede vevet til et sterilt 1,5-milliliter rør, og snap-fryse prøven i flytende nitrogen for overnatting lagring på minus 80 grader Celsius.Neste morgen tiner prøvene før lysis, i henhold til instruksjonene fra et genomisk DNA-isolasjonssett. For human T-celle kvantifisering av digital polymerase kjedereaksjon, eller PCR, forberede digitale PCR reaksjoner i henhold til protokollen for DNA bindende fargestoffer for den digitale PCR-maskinen som brukes og bruke de riktige primere for menneskelig CD3 epsilon genomisk DNA. Deretter utfører du den digitale PCR-reaksjonen under de riktige reaksjonsforholdene.Sublethally bestrålte åtte til 12 uker gamle NSG-mus av begge kjønn som mottar human PBMC begynner å vise kliniske tegn på GVHD rundt dag 10 etter injeksjon sammenlignet med negative kontrollmus behandlet med PBS bare. XenoGVHD-mus har en median overlevelse på 23,5 dager. Ved hjelp av digital PCR kan CD3 epsilonpositive humane T-celler oppdages i lunge- og leverprøver av mus som mottar menneskelige PBMCer.Det er avgjørende at scoringen utføres konsekvent, og at forskeren som scorer musene er blindet for behandlingen. Etter denne prosedyren kan serum samles inn fra eutaniserte mus for perifer cytokinuttrykksanalyse, og immunceller kan samles inn fra milten for analyse via strømningscytometri.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induksjon av transplantat-mot-vert-sykdom og<em&gt; In Vivo</em&gt; T Cell overvåking ved hjelp av en MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Endring av primære humane T celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos mus og evaluering av sykdom avhengige Fordeling av immunceller i ulike vev

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Induksjon av lammelse og visuelle systemet skade i mus ved T-celler spesifikke for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induksjon av Intestinal Graft - versus - host sykdom og sin Mini-endoskopisk vurdering i levende mus

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Kvantifisering av voksende Human antigen-spesifikke CD4+ T celler bruke Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Benmargstransplantasjonsplattform for å undersøke rollen til dendrittiske celler i graft-versus vertssykdom

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...