Name: induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

Biz bu deneyler ve sağlanan teknik destek için kullanılan dijital PCR makine sağlamak için Lane Christenson Laboratuvarı kabul etmek istiyoruz. Ayrıca Dr. Thomas Yankee 'e rehberlik ve mentorluk için teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışmalar Tripp Aile Vakfı tarafından destekleniyor.

Tüm fare denemeleri uygunluk ve onayı ile yapıldı, Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi. Tüm sağlıklı insan kanı örnekleri bilgilendirilmiş onay altında ve Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi 'nde kurumsal Inceleme Kurulu onayı ile elde edildi.
1. NSG fareler ışınlama
<ol><li>PBMC enjeksiyonu için bir gün önce, 8 – 12 haftalık NSG fareler (ya seks kullanılabilir) radyasyona. Steril bir Biyogüvenlik kabininde, fare sterilize ed...

<ol>
	<li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation.">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li><li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+3+clinical+trial+of+steroids/mycophenolate+mofetil+vs+steroids/placebo+as+therapy+for+acute+GVHD:+BMT+CTN+0802.">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), 3221-3227 (2014).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation.">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use,+older+recipient+age,+and+use+of+unrelated+donors.">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li><li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era.">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li><li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex.">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li><li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+antimurine+xenogeneic+cytotoxic+response.+I.+Dependence+on+responder+antigen-presenting+cells.">The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice.">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li><li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes,+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease.">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li><li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4(+)+or+CD8.">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li><li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism.">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li><li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells.">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals.">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68 (2017).</li><li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8.">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Sykes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR.">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li><li>Vitale, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+to+evaluate+estrogen+receptor+gene+mutations+in+small+amounts+of+cell-free+DNA.">An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA.</a> Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).</li><li>Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+and+liquid+biopsy:+opportunities,+challenges,+and+recent+advances+in+detection+technologies.">Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies.</a> Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li><li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation:+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review.">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li><li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+human+T+cell+engraftment,+trafficking,+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD/SCID+beta2mnull+mice.">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li><li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein:+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice.">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li><li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype.">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219 (2012).</li><li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-/-+gammac-/-+double-mutant+mice.">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li><li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues.">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li><li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+graft-versus-host+disease:+advances+and+limitations.">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li><li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease:+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation?.">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?.</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li></ol>

Hastalık ilerlemesi genellikle xenoGVHD modelinde tutarlı, hatta farklı bağış PBMC enjeksiyon ile, bu yüzden birden fazla deney kombine edilebilir. Bu tutarlılığı korumak için gereken önemli adımlar doğru serum enjeksiyon tekniği, kör edici ve tutarlı skorlama. Nervi ve ark.25 tarafından yapılan bir çalışmada, intravenöz kuyruk ven enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, PBMC Retro orbital enjeksiyonları daha tutarlı Engraftman ve daha şiddetli GVHD sonuçlandı g?...

Allojeneik hematopoetik kök hücre nakli (HSCT), lösemi gibi hematolojik malignite hastalarında kötü prognoz ile rutin tedavi haline gelmiştir. HSCT 'nin önemli bir komplikasyonu akut Greft-versus-Host hastalığıdır (GVHD). Bir 2012 çalışma, akut GVHD 'nin HSCT hastalarının% 39 ' inde, kardeş bağışçılardan nakil alan hastaların% 59 ' inde, alakasız bağışçılar1' den nakli alan hastalarda geliştiği bildirildi. Akut GVHD, donör türeyen T hücrelerinin alıcı organlarına saldırırken oluşur. GVHD için tek başarılı terapi, son derece toksik olan ve enfeksiyon ve tümör nüks riskini artıran, son derece immünpresif ilaçlar2ile tedavi etmektir. Böylece, son yıllarda akut GVHD hayatta kalımına yapılan iyileştirmeler rağmen3,4,5, hala uzun vadeli remisyon teşvik minimal toksisite ile geliştirilmiş GVHD tedaviler için kritik bir ihtiyaç vardır.
Aşağıdaki yöntemlerin genel amacı, xenogeneic GVHD 'yi (xenoGVHD) teşvik etmek ve puanlar etmektir. XenoGVHD modeli klinik deneyler için önceden klinik GVHD araştırma daha doğrudan çeviri için izin murine hücreleri yerine insan hücreleri ile akut GVHD ikna etmek için bir araç olarak geliştirilmiştir6. Bu model, intravenöz olarak insan periferik kan mononükleer hücreleri enjekte eder (PBMC) içine NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) sublethally ışınlanmış fareler. Enjekte insan T hücreleri insan antijen sunan hücreler tarafından aktive edilir (APCs) murine antijeni sunan ve aktif T hücreleri sistemik inflamasyona neden uzak dokulara göç ve sonuçta ölüm6,7, 8 , 9 , 10. hastalık patolojisi ve xenoGVHD modelinde progresyon yakından insan akut GVHD taklit. Özellikle, patojenik insan t hücreleri, insan GVHD6,9' da T hücresi kodlamaktadırlar 'a benzeyen, murine büyük histouyumluluk kompleksi (MHC) proteinlerine reaktif olmaktadır. XenoGVHD modelinin birincil avantajı fare MHC-uyuşmazlığı modeli, diğer yaygın olarak kullanılan GVHD modeli üzerinde, insan hücreleri yerine murine hücreler üzerinde tedaviler test etmek için izin verir. Bu, insan hücrelerini hedef almak için yapılan herhangi bir değişiklik olmadan doğrudan kliniğe tercüme edilebilir ürünlerin test etmek için izin verir. Son zamanlarda, bu model bir insan anti-IL-2 antikor test etmek için kullanılan11, insan timik düzenleyici T hücreleri (tregs)12 ve insan mesenkimal kök hücreleri13 akut GVHD için potansiyel tedaviler olarak. Daha geniş bir bağlamda, bu model, insan T hücresi etkinliğini bastırabilir herhangi bir ilaç veya hücre türü için bir in vivo bastırma tahlil olarak kullanılabilir. Örneğin, stockis ve al.14 , xenogvhd modelini, αvβ8 entegrenin engelleme efektini in vivo olarak Treg baskılayıcı aktivitesinde incelemek için kullandı . Böylece, xenoGVHD modeli bir in vivo ayarında T hücrelerini hedefleyen herhangi bir tedavinin mekanizması içine anlayış sağlayabilir.
Bu protokolde açıklanan ek bir yöntem, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) kullanarak fare dokularındaki insan T hücrelerini nasıl algılayabilirsiniz. Bu yöntemin amacı, bu modelde test edilen immünosupresif tedavilerin etkinliğini ölçen hedef dokularda T hücrelerinin göç ve proliferasyonu ölçmek için bir araç sunması. dPCR, nükrenik asitlerin ölçülmesini belirlemek için nispeten yeni bir yöntemdir15. Kısaca, PCR reaksiyon karışımı, hedef dizinin az sayıda veya hiçbir hedef içeren bölümlere ayrılır. Hedef dizi daha sonra güçlendirilir ve DNA enterkalasyon boyalar veya floresan hedef spesifik problar kullanılarak algılanır. dpcr pozitif bölümler ve Poisson istatistikleri15,16kesir dayalı hedef dizinin kopya sayısını nicelik. DPCR ile T hücrelerinin tespiti, Akış sitometrisi ve histolojisi de dahil olmak üzere diğer alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında çok daha az doku gerektirir ve dondurulmuş veya sabit doku üzerinde yapılabilir. dPCR kopya numaralarını belirlemek için standart bir eğri gerektirmez, ne de teknik çoğaltır gereklidir. Bu, geleneksel nicel PCR (qPCR)16Ile karşılaştırıldığında dpcr için gereken reaktif ve şablon DNA miktarını azaltır. PCR reaksiyonunun dPCR 'de alt reaksiyonlarına bölünmesi, hedefleri17' ye yoğunlaşır. Böylece, dPCR öncelikle olmayan hedef DNA büyük miktarda nadir hedefleri tespiti için bir araçtır. Örneğin, dPCR süt bakteriyel kontaminasyonu algılamak için kullanılan18, östrojen reseptör geni nadir mutasyonlar belirlemek19, ve hastaların KANıNDA dolaşan tümör DNA algılamak20. Bu protokolde dPCR, xenoGVHD ile fare dokularında insan T hücrelerini tespit etmek ve ölçmek için etkili bir araç olarak hizmet vermektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;L Ranin pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17001118</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well ddPCR plate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Chamber</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EZ-178</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>PM1002</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>1811318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45001750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Irradiator Pie Cage</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>MPC 1</td>
			<td>Holds up to 11 mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4&#34;)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-027-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipetman</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>A-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetaid Gilson Macroman</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F110756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013805</td>
			<td>Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR plates</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase and DNase-free plate seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12565491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Advanced 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12633012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Pads (2&#34; x 2&#34;, 12-Ply)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reservoir</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89094-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgial Scissors</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS600393-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INS650914-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and scoring of graft-versus-host disease in a xenogeneic murine model and quantification of human t cells in mouse tissues using digital pcr

Akut Greft-versus-Host hastalığı (GVHD), hematolojik eksiklikler ve malignite tedavisi olarak hematopoetik kök hücre nakli yapan hastalar için önemli bir sınırlamadır. Akut GVHD, donör T hücrelerinin bir yabancı antijen olarak ana dokular tanımak ve ev sahipliği için bir bağışıklık yanıtı monte oluşur. Mevcut tedaviler enfeksiyon ve nüks duyarlı hastalar render toksik immünrepresif ilaçlar içerir. Böylece, etkili bir şekilde donör T hücrelerini hedef ve yan etkileri azaltmak akut GVHD tedavisi sağlamak için sürekli araştırma vardır. Bu öncesi klinik çalışmanın çoğu, bir in vivo sistemde murine hücreleri yerine insan hücrelerinde immünopresif tedavilerin test edilmesini sağlayan ksenojen GVHD (xenogvhd) duvar modelini kullanır. Bu protokol, xenoGVHD 'ye nasıl neden olduğunu ve tutarlı sonuçlar sağlamak için klinik skorlamayı nasıl kör ve standartlaştırmayı özetliyor. Ayrıca, bu protokol, daha sonra test edilen tedavilerin etkinliğini ölçmek için kullanılabilecek fare dokularında insan T hücrelerini algılamak için dijital PCR nasıl kullanılacağını açıklar. XenoGVHD modeli sadece GVHD terapileri test etmek için bir model ancak daha sonra birçok inflamatuar hastalıklara uygulanabilir insan T hücrelerini bastırabilir herhangi bir tedavi sağlar.

Sublethally ışınlanmış 8-12-hafta eski NSG fareleri insan PBMC alınan her iki cinsiyetlerin gün etrafında GVHD klinik belirtileri görüntülemeye başladı 10 sadece PBS alınan negatif kontrol fareler ile karşılaştırıldığında Enjeksiyon sonrası (Şekil 1a). XenoGVHD fareler bir Median hayatta kalma 23,5 gün vardı (Şekil 1B). Dijital PCR ile, CD3 Epsilon pozitif insan T hücreleri insan PBMC alınan fareler a...

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR at JoVE

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Burada, bir xenogeneic Graft-versus-Host hastalığı (xenoGVHD) modelinde hastalığı teşvik etmek ve puan vermek için bir protokol sunuyoruz. xenoGVHD, insan T hücrelerinin bağışıklık bastırılmasını incelemek için bir in vivo modeli sağlar. Ayrıca, immunobastırma ölçmek için bir araç olarak dijital PCR ile dokularda insan T hücrelerinin nasıl algılanmasını açıklar.

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Bu protokol, ksenogreft-versus-host hastalığı, ya da ksenoGVHD neden nasıl ve nasıl kör ve tutarlı sonuçlar sağlamak için klinik puanlama standart. KksenoGVHD modeli, murine T hücreleri yerine insana karşı immünsupresif tedavileri test etmek için in vivo bir yöntem sağlar, kliniğe bu çalışmaların çevirisini geliştirmek. Prosedürü gösteren Amara Seng, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır.Enjeksiyondan bir gün önce, sekiz ila 12 haftalık, obez olmayan diyabetik scid gama veya NSG, sterilize pasta kafesi fareler yerleştirin ve bir sezyum-137 kaynağında fareler ışınlamak 150 centigrays toplam doz, hatta ışınlama sağlamak için yavaş bir rotasyon ile. Daha sonra, bir gecede steril bir biyogüvenlik kabini temiz kafesler içine fareler yerleştirin. Ertesi sabah, yedi periferik kan mononükleer hücreleri, ya da PBMCs, fare başına 1.1 kez 10 izole etmek için yeterli sağlıklı insan kanı toplamak ve pbs% 2 fetal sığır serumu, ya da FBS eşit hacimde heparinize kan seyreltmek.Yoğunluk gradyan santrifüj ücrabirasyon için 50 mililitrelik konik tüplenfosit ayırma yoğunluğu gradyan orta 15 mililitre üzerine seyreltilmiş kan 25 mililitre kadar dikkatlice bindirme. Ayırma sonunda, apaçık pbmc hasat ve yeni bir 50 mililitre konik tüp içinde PBS 10 mililitre hücreleri yıkayın. Supernatant aspirate ve pelet gevşetmek için tüp flick.Başka bir santrifüj için taze PBS 10 mililitre PBMCs resuspend, sayım için taze PBS beş mililitre resuspension izledi. Daha sonra, son bir santrifüj ile hücreleri toplamak ve pbs konsantrasyonu mililitre başına sekiz PBMCs bir kez 10 pelet resuspend. İzole edilmiş insan PBMC'nin fare gözüne retro-orbital olarak ulaştırılması için, 100 mikrolitre hücreye sahip 28 kalibrelik bir iğneyle donatılmış bir mililitrelik şırınga yükleyin.Parmak kıskacına yanıt eksikliğini onaylayın ve fareyi başparmak ve orta parmakla hafifçe dizginle. Gözün arkasına ulaşılına kadar konjonktiva zarı üzerinden, medial canthus içine iğne eğimli tarafı aşağı, lateral yerleştirin. İğneyi hafifçe geri çekve yavaşça tüm hücre hacmini enjekte edin.Daha sonra, şırınga ve iğnenin düzgün bir şekilde atılması için iğneyi tamamen geri çekin. Göz kapağını kapatın ve gazlı bez süngeri ile enjeksiyon bölgesine hafif basınç uygulayın. Daha sonra, şişlik veya diğer görünür travma için enjeksiyon sitesini inceleyin ve farenin, hayvanı ev kafesine taşımadan önce kağıt havlularla kaplı steril bir kafeste bilincini yeniden kazanmasına izin verin.GVHD skorunu ölçmek için kafesi laminar akış başlığına yerleştirin ve kafesteki yiyecek ve suyu çıkarın. Etkinliği puanlamak için, farelerin davranışını beş dakika boyunca gözlemleyin. Bir kilo kaybı puanı elde etmek için, bir cam kabıher her fare tartMak.Fare hala kabın içindeyken, hayvanı duruş, kürk dokusu ve cilt bütünlüğü açısından inceleyin. İlgi dokuları hasat sonra, organdan doku yaklaşık üç-by-0.5 milimetrelik bir parça kesilmiş ve bir denge üzerinde örnek tartmak. Ağırlıklı dokuyu steril 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve eksi 80 santigrat derecede bir gecede depolanması için numuneyi sıvı nitrojenle dondurun.Ertesi sabah, genomik DNA izolasyon kitinin talimatlarına göre, örnekleri lysis'ten önce eritin. Dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR ile insan T hücre sayısallaştırması için, kullanılan ve insan CD3 epsilon genomik DNA'sı için uygun astarların kullanıldığı dijital PCR makinesi için DNA bağlayıcı boyalar protokolüne göre dijital PCR reaksiyonları hazırlayın. Daha sonra, uygun reaksiyon koşullarında dijital PCR reaksiyonu gerçekleştirin.İnsan PBMC alan her iki cinsin sekiz ila 12 haftalık NSG fareleri, sadece PBS ile tedavi edilen negatif kontrol farelerine kıyasla 10 enjeksiyon sonrası gün civarında GVHD'nin klinik belirtilerini göstermeye başlar. XenoGVHD fareler 23.5 gün ortanca sağkalım var. Dijital PCR kullanılarak, CD3 epsilon pozitif insan T hücreleri insan PBMCs alan farelerin akciğer ve karaciğer örnekleri tespit edilebilir.Puanlamanın tutarlı bir şekilde yapılması ve fareleri puanlama yapan araştırmacının tedavilerine kör olması çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, periferik sitokin ekspresyon analizi için ötenazi li farelerden serum toplanabilir ve akış sitometrisi yoluyla analiz için dalaktan bağışıklık hücreleri toplanabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Felç ve görsel sistem yaralanma tarafından Nöromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 T hücreleri belirli farelerde indüksiyon

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

İndüksiyon bağırsak Graft - versus - host hastalığı ve canlı fareler, Mini-endoskopik değerlendirme

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Proliferasyon ınsan antijeni spesifik CD4+ T hücrelerinin Karboksflorcein Succinimidyl Ester kullanarak ölçülmesini

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...