Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

وأيد هذا العمل 31003A-162643 منحة من "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية". ونحن نشكر بورت نيكول وبيوزينتروم التصوير الأساسية مرفق (إيمكف) للدعم.

1-البكتيرية التحول مع نانوبوديس فونكتيوناليزيد
ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول للتعبير، وتنقية، وتحليل لمكافحة فونكتيوناليزيد-التجارة والنقل نانوبوديس كما هو موضح سابقا30. Derivatization مع مويتيس البروتين الأخرى قد تحتاج إلى تعديل هذا البروتوكول القياسي.</p...

نانوبوديس تمثل طبقة ناشئة من البروتين السقالات الموثق بالعديد من المزايا على الأجسام المضادة التقليدية: فهي صغيرة، ومستقرة، وأحادي, ويمكن تحديدها لسندات عالية من ثنائي كبريتيد تقارب والافتقار إلى3533،، 44 , 45-وهي تستخدم ...

حركة تراجعية من البروتينات والدهون من سطح الخلية إلى مختلف الأقسام داخل الخلايا أمر حاسم للحفاظ على التوازن غشاء على موازنة إفراز وإعادة تدوير مكونات الأجهزة النقل anterograde1 , 2. بعد الاستيعاب الداخلي عن طريق الالتقام تعتمد على كلاثرين أو-مستقلة، البروتين والدهن الشحن أولاً ملء المبكر اندوسوميس من أين هم كذلك توجيه أما على طول النظام إندو-الليزوزومية، وإعادة تدويرها لغشاء البلازما، أو الموجهة إلى شبكة ترانس-غولجي (TGN). إعادة التدوير من اندوسوميس و/أو سطح الخلية TGN جزء من دورة الوظيفي عدد من مستقبلات البضائع transmembrane anterograde، مثل مستقبلات يطلق – 6-فوسفات تعتمد على الأيونات الموجبة والايونات الموجبة المستقلة (كدمبر وسيمبر) تسليم حديثا توليفها hydrolases الليزوزومية من TGN أواخر اندوسوميس وليسوسوميس3،،من45، سورتيلين وسورلا6،7ونتليس (ولس) نقل يغاندس Wnt إلى سطح الخلية 8 , 9 , 10 , 11-هي البروتينات الأخرى تم استردادها مرة أخرى إلى TGN TGN46 وفي إيسوفورمس ذات الصلة12،13،14، الافخاخ (القابلة للذوبان N-اثيلماليميدي-تراعي الانصهار عامل مرفق مستقبلات) 15 , 16 , 17، قسط التدريجي (عنك) البروتين20الناقلين المعادن مثل ATP7A/B أو DMT121،22، و transmembrane، اميلويد السلائف البروتين (APP)18،19 تجهيز الإنزيمات بما في ذلك كاربوكسيبيبتيداسي د، فارين أو BACE123،،من2425. وبصرف النظر عن هذه البروتينات الذاتية، خطف السموم البكتيرية والنبات (مثل السمية شيغا، والكوليرا، ومادة الريسين وابرين) الآليات النقل إلى الوراء للوصول إلى لائحة ريتروترانسلوكيشن في سيتوسول26،27، ،من 2829.
من أجل مباشرة تحليل حركة المرور إلى الوراء، قد سبق أن وضعت مجموعة من أدوات المستندة إلى نانوبودي لوسم وتتبع الشحنات البروتينات من سطح الخلية إلى المقصورات داخل الخلايا30. نانوبوديس تمثل أسرة جديدة من موثقات البروتينات المشتقة من هوموديميريك الثقيلة-سلسلة--فقط الأجسام المضادة (هكابس) التي تحدث طبيعيا في31،الإبليات والأسماك الغضروفية32. أنها تشكل المجال الثقيلة-سلسلة متغير (فة) من هكابس ولها العديد من المزايا على الأجسام المضادة التقليدية (مثلاً، إيجس): أحادي، الصغيرة (كاتشين ~ 15)، القابلة للذوبان العالية، تخلو من ثنائي كبريتيد السندات، يمكن أعرب البكتريا، والمحدد ل ربط عالية تقارب33،34،،من3536. لجعل أداة نانوبودي لدينا تنوعاً وقابلة للتطبيق على نطاق واسع، استخدمنا نانوبوديس مكافحة فونكتيوناليزيد-التجارة والنقل للبروتينات السطحية-التسمية والمسار معلم مع التجارة والنقل في مجال اختصاصهم خارج الخلية/لومينال. الروغان نانوبوديس مع متشيري، اسكوربات البيروكسيديز 2 (APEX2) النقل إلى الوراء37، أو تسلسل تيروزين الكبرتة (TS)، أصيل البضائع transmembrane البروتينات يمكن تحليلها من قبل أما ثابتة ويعيش تصوير الخلية، التي المجهر الإلكتروني، أو كيميائيا. منذ الكبرتة تيروزين توسط سولفوترانسفيراسيس تيروسيلبروتين (TPST1 و TPST2) تعديل بوسترانسلاشونال مقيد إلى ترانس-غولجي/TGN, نحن يمكن مباشرة دراسة النقل وحركية من البروتينات للفائدة من سطح الخلية إلى هذا داخل الخلايا غولجي حجرة38،،من3940.
في هذه المقالة الأساليب، يصف لنا السهولة لإنتاج نانوبوديس فونكتيوناليزيد (فة-2xTS-APEX2،-مشري ومشتقاتها) مناسبة لعدد من التطبيقات لتحليل النقل إلى الوراء في خلايا الثدييات30. نحن تركز أساسا على استخدام الملخص تعديل موقع نانوبودي لتحليل حركة المرور داخل الخلايا من سطح الخلية حجرة الكبرتة.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

النقل من البروتينات والأغشية من سطح الخلية غولجي وما بعدها ضروري للتوازن والهوية عضية وعلم وظائف الأعضاء. لدراسة حركة تراجعية البروتين، وضعنا مؤخرا مجموعة من أدوات المستندة إلى نانوبودي تنوعاً لتحليل النقل من سطح الخلية إلى المجمع غولجي، أما عن طريق خلية ثابتة ويعيش التصوير، بالمجهر الإلكتروني، أو كيميائيا. نحن هندسيا nanobodies نيون فونكتيوناليزيد الأخضر المضادة البروتين (التجارة والنقل) – موثقات الصغيرة، أحادي، والنسب العالية من البروتين – التي يمكن تطبيقها على خطوط الخلايا معربا عن بروتينات الغشاء من الاهتمام مع مجموعة بروتينات فلورية خضراء خارج الخلية. ديريفاتيزيد nanobodies منضمة إلى الصحفيين بروتينات فلورية خضراء يتم استيعابه على وجه التحديد وتنقل تراكبيا على طول طرق الفرز الصحفيين. كانت فونكتيوناليزيد نانوبوديس مع fluorophores تتبع النقل إلى الوراء بالفحص المجهري الأسفار والعيش التصوير، مع اسكوربات البيروكسيديز 2 (APEX2) للتحقيق في توطين مجمعات مراسل-نانوبودي ultrastructural إلكترون الفحص المجهري، ومع زخارف تيروزين الكبرتة (TS) لتقييم حركية ترانس-غولجي وصول الشبكة (TGN). في هذه المقالة المنهجية، نحن مخطط الإجراء العام للتعبير عن البكتريا وتطهير نانوبوديس فونكتيوناليزيد. نحن لتوضيح استخدام أداة لدينا استخدام nanobodies تعديل مشري والملخص لتحليل TGN وصول البضائع البروتينات وامتصاص اندوسيتيك قوية.

للتحقيق في نقل البروتين إلى الوراء إلى مختلف الوجهات داخل الخلايا، أنشأنا مؤخرا أداة تستند إلى نانوبودي المضادة-التجارة والنقل لوسم وتتبع البروتينات الانصهار المؤتلف من سطح الخلية30. وهنا نبدي إنتاج البكتيرية مثل ديريفاتيزيد نانوبوديس، وتبرهن على تطبيقها ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

تحليل لامتصاص اندوسيتيك والنقل إلى الوراء إلى غولجي عبر الشبكة باستخدام نانوبوديس فونكتيوناليزيد في الخلايا المستزرعة

النقل إلى الوراء من البروتينات من سطح الخلية إلى غولجي أمر ضروري للحفاظ على التوازن الغشاء. هنا، نحن تصف طريقة لتحليل الخلايا السطحية غولجي النقل المؤتلف البروتينات باستخدام نانوبوديس فونكتيوناليزيد في خلايا هيلا المتحلل.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

هذه الطريقة تمكن من إنتاج وتطبيق البكتيريا التعبير عن، وظيفية نانو الهيئات لتحليل نقل البروتين الرجعية من سطح الخلية إلى مقصورات بين الخلايا. وعلى وجه الخصوص شبكة ترانس غولجي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام الكبريت. تعديل شديد التحديد ومجزأ وحساس بعد الترجمة لتقييم وصول المراسل إلى مجمع نانو الجسم في مقصورة DTN. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة بالاشتراك مع غيرها من الأجسام النانوية المشتقة لتصوير الخلايا الحياتية والمجهر الإلكتروني لدراسة العمليات الانسطية لمستقبلات سطح الخلايا المرتبطة بالأمراض. وقد تم تصميم ذخيرة لدينا من الهيئات نانو وظيفية لدراسة النقل الرجعية في الخلايا المستزرعة. ومع ذلك، يمكن أيضاً تطبيق هذه الأدوات في الكائنات متعددة الخلايا. لبدء هذا الإجراء، واختيار مستعمرة بكتيرية تحتوي على ناقل الفائدة من لوحة وتطعيم قارورة تحتوي على 20 ملليلتر من LB المتوسطة تكملها المضادات الحيوية. احتضان ليلة وضحاها في 37

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

التجويف النيتروجين والطرد المركزي التفاضلي يسمح بمراقبة توزيع البروتينات الغشاء المحيطي في الخلايا المستزرعة

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

كثافة التدرج الطرد الفائق للتحقيق في إعادة تدوير الغدد الصماء في خلايا الثدييات

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: تطبيق مبسط لتجميع التعبير المشترك للبروتين وتحليل الشبكة في البروتينات

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

استنفاد الجلوكوز خارج الخلية كمقياس غير مباشر لامتصاص الجلوكوز في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...