Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud 31003A-162643 af den schweiziske National Science Foundation. Vi takker Nicole Beuret og Biozentrum Imaging Core facilitet (IMCF) for støtte.

1. Bakteriers Transformation med Functionalized Nanobodies
Bemærk: Denne protokol er blevet optimeret til udtryk, oprensning og analyse af functionalized anti-NGL nanobodies som tidligere beskrevet30. Forædling med andre protein fraspaltning kan kræve ændring af denne standard protokol.
<ol><li>Optø chemocompetent bakterier (~ 100 µL) egnet til protein udtryk (fx, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) celler) ved at placere dem på is.<br...

Nanobodies repræsenterer en ny klasse af protein binder stilladser med mange fordele i forhold til konventionelle antistoffer: de er lille, stabil, monomere, kan vælges for høj affinitet og manglende disulfid obligationer33,35, 44 , 45. de bruges i en række applikationer, såsom i celle kultur systemer og organismer i udviklingsmæssige biologi46,<sup clas...

Retrograd trafik af proteiner og lipider fra cellens overflade til forskellige intracellulære rum er afgørende for opretholdelse af membran homøostase modvægt sekretion og at genbruge komponenter af anterograd transport machineries1 , 2. efter internalisering via clathrin-afhængige eller -uafhængig endocytose, proteiner og lipid cargo først udfylde tidligt endosomes fra hvor de er yderligere omdirigeret enten langs den endo-lysosomale system, genanvendt til plasma membran, eller målrettet til trans-Golgi netværk (TGN). Genbrug fra endosomes og/eller cellens overflade til TGN er en del af den funktionelle cyklus af en række anterograd transmembrane cargo receptorer, såsom kation-afhængige og kation-uafhængige mannose-6-fosfat-receptorer (CDMPR og CIMPR) leverer nyligt syntetiserede lysosomale hydrolaser fra TGN til afdøde endosomes og lysosomer3,4,5, sortilin og SorLA6,7, og Wntless (WLS) transport af Wnt ligander til cellens overflade 8 , 9 , 10 , 11. andre proteiner hentet tilbage til TGN er TGN46 og dens relaterede isoformer12,13,14, snarer (opløselige N- ethylmaleimide-følsomme fusion faktor vedhæftet fil receptorer) 15 , 16 , 17, amyloid forløber protein (APP)18,19, progressive ankylose (ANK) protein20, metal transportvirksomheder som ATP7A/B eller DMT121,22, og transmembrane forarbejdning enzymer herunder carboxypeptidase D, furin eller BACE123,24,25. Bortset fra disse endogene proteiner kapre bakteriel og plante toksiner (fx Shiga og kolera toksin, ricin og abrin) retrograd transport machineries til at nå på Skadestuen for retrotranslocation i cytosol26,27, 28,29.
For at direkte analysere retrograd trafik, har vi tidligere har udviklet en nanobody-baseret toolkit for at mærke og følge lasten proteiner fra cellens overflade til intracellulære rum30. Nanobodies repræsenterer en ny familie af protein bindemidler afledt af homodimeriske heavy chain kun antistoffer (hcAbs) der forekommer naturligt i camelids og arter fisk31,32. De udgør de variable heavy-kæde domæne (VHH) af hcAbs og har mange fordele i forhold til konventionelle antistoffer (f.eks. IgGs): de er monomere, lille (~ 15 kDa), højt opløseligt, blottet for disulfid obligationer, kan bacterially udtrykkes og valgt høj-affinitet bindende33,34,35,36. For at gøre vores nanobody værktøj, alsidigt og bredt anvendelige, ansat vi functionalized anti-NGL nanobodies til overflade-label og spor proteiner markeret med normal god landbrugspraksis på deres ekstracellulære/lumenal domæne. Ved functionalization af nanobodies med mCherry, Ascorbat peroxidase 2 (APEX2)37eller tyrosin sulfation (TS) sekvenser, retrograd transport af bonafide transmembrane cargo proteiner kan analyseres af enten fast og live celle imaging, af elektronmikroskopi, eller biokemisk. Da tyrosin sulfation medieret af tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 og TPST2) er en posttranslationelle modifikation begrænset til trans-Golgi/TGN, vi kan direkte undersøgelse transport og kinetik af proteiner af interesse fra cellens overflade til dette intracellulære Golgi rummet38,39,40.
I artikelen metoder beskrive vi lethed, hvormed produktionen af functionalized nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry og derivater) egner sig til en række applikationer til at analysere retrograd transport i pattedyrceller30. Vi fokusere hovedsagelig på brugen af TS websted-modificerede nanobody til analyse af intracellulære trafik fra cellens overflade til rum i sulfation.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Transport af proteiner og membraner fra cellens overflade til Golgi og videre er afgørende for homeostase, organelle identitet og fysiologi. For at studere retrograd protein trafik, har vi for nylig udviklet en alsidig nanobody-baserede toolkit for at analysere transporten fra cellens overflade til Golgi kompleks, enten ved faste og levende celle imaging, ved elektronmikroskopi eller biokemisk. Vi konstruerede functionalized anti-grøn fluorescerende proteiner (NGL) nanobodies — små, monomere, høj-affinitet protein bindemidler — der kan anvendes til cellelinjer udtrykker Membranproteiner af interesse med en ekstracellulære NGL-gruppe. Derivatized nanobodies bundet til normal god landbrugspraksis journalister er specifikt internaliseret og transporteres piggyback langs journalister sortering ruter. Nanobodies blev functionalized med fluorophores til følge retrograd transport af Fluorescens mikroskopi og live imaging med Ascorbat peroxidase 2 (APEX2) til at undersøge de ultrastrukturelle lokalisering af reporter-nanobody komplekser af elektron mikroskopi, og med tyrosin sulfation (TS) motiver til at vurdere kinetik af trans-Golgi netværk (TGN) ankomst. I denne metodologiske artikel skitsere vi den generelle procedure for at bacterially express og rense functionalized nanobodies. Vi illustrere den kraftfulde brug af vores værktøj ved hjælp af den mCherry - og TS-modificerede nanobodies til at analysere endocytic optagelse og TGN ankomst af last proteiner.

For at undersøge retrograd protein transport til forskellige intracellulære destinationer, har vi for nylig etableret en anti-NGL nanobody-baseret værktøj til at mærke og følge rekombinant fusion proteiner fra celle overflade30. Her, påvise vi bakteriel produktion af sådanne derivatized nanobodies og demonstrere deres ansøgning at studere endocytic optagelse af Fluorescens mikroskopi samt immunoblotting og deres anvendelse at undersøge TGN ankomsten af su...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse af Endocytic optagelse og retrograd Transport til Trans-Golgi netværket ved hjælp af Functionalized Nanobodies i kulturperler celler

Retrograd transport af proteiner fra cellens overflade til Golgi er afgørende at fastholde membran homøostase. Her, beskriver vi en metode til at analysere biokemisk celle overflade til Golgi transport af rekombinante proteiner ved hjælp af functionalized nanobodies i HeLa celler.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Denne metode gør det muligt at producere og påføring af ekskrystielle, funktionaliserede nanokroppe til at analysere retrograd proteintransport fra celleoverfladen til intercellulære rum. Især Trans-Golgi-nettet. Den største fordel ved denne teknik er brugen af sulation. En meget specifik, opdelt og følsom ændring efter oversættelsen for at vurdere reporter nano-krop kompleks ankomst i DTN-rummet. Denne metode i kombination med andre derivatiserede nanokroppe til livscellebilleddannelse og elektronmikroskopi kan også anvendes til at undersøge endocitiske processer af sygdomsrelaterede cellereklaceptorer. Vores repertoire af funktionaliserede nanokroppe er udviklet til at studere retrograd transport i dyrkede celler. Disse værktøjer kan dog også anvendes i flercellede organismer. For at begynde denne procedure, vælge en bakteriekoloni, der indeholder vektor af interesse fra pladen og inokulere en kolbe, der indeholder 20 milliliter LB medium suppleret med antibiotika. Inkubere natten over på 37

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Kvælstof kavitation og differentieret centrifugering giver mulighed for overvågning fordelingen af perifere Membranproteiner i kulturperler celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser af mitokondrie Calcium tilstrømning i isolerede mitochondrier og kulturperler celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Tæthedsgradient ultracentrifugering til undersøgelse af endoytisk genanvendelse i pattedyrceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: En strømlinet applikation til protein co-ekspressionsklynger og netværksanalyse i proteomics

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær glukoseudtømning som et indirekte mål for glukoseoptagelse i celler og væv Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...